Nghiên cứu điều kiện thủy phân rong lục bằng chế phẩm enzyme thô thu được

B GIO DC V O TO TRNG I HC BCH KHOA H NI - H TH NH PHNG NGHIấN CU IU KIN THY PHN RONG LC BNG CH PHM ENZYM THễ THU C T VI SINH VT Chuyờn ngnh : CễNG NGH THC PHM Mó ti: CNTP13B-14 LUN VN THC S K THUT CễNG NGH THC PHM NGI HNG DN KHOA HC: PGS.TS NGUYN THANH HNG H Ni - 2015 LI CAM OAN Hc viờn: H Th Nhó Phng Ni o to: Trng i hc Bỏch Khoa H Ni Chuyờn ngnh: Cụng ngh thc phm Ngi hng dn : PGS TS Nguyn Thanh Hng Tờn lun vn: Nghiờn cu iu kin thy phõn rong lc bng ch phm enzym thụ thu c t vi sinh vt Ni dung cam oan: Tụi xin cam oan, sut quỏ trỡnh nghiờn cu lun thc s, di s hng dn ch bo tn tỡnh ca giỏo viờn hng dn, tụi ó tin hnh nghiờn cu lun mt cỏch trung thc, ton b ni dung bỏo cỏo lun c tụi trc tip thc hin Tt c cỏc nghiờn cu khụng chộp t cỏc bỏo cỏo khoa hc, lun tin s, thc s hay sỏch ca bt c tỏc gi no Hc viờn H Th Nhó Phng ii LI CM N Tụi xin trõn trng cm n PGS.TS Nguyn Thanh Hng ó tn tỡnh trc tip hng dn v giỳp tụi sut quỏ trỡnh thc hin ti Tụi xin trõn trng cm n cỏc thy giỏo, cụ giỏo Vin Cụng ngh Sinh hc v Cụng ngh Thc phm Trng i hc Bỏch Khoa H Ni, ó luụn to iu kin giỳp tụi sut khúa hc cng nh thi gian tụi thc hin ti ny Tụi xin trõn trng cm n Trng i Hc Bỏch Khoa H Ni ó to iu kin cho tụi c hc v nghiờn cu sut quỏ trỡnh hc ui c ng, tụi mun y t ng cm n gi nh, n , ng nghip ó ng vi n, giỳp tụi hon thnh un v n ny Hc viờn H Th Nhó Phng iii MC LC LI CAM OAN ii LI CM N iii MC LC iv DANH MC BIU vii M U Chng I: TNG QUAN 1.1 S phỏt trin ethanol nhiờn liu t nguyờn liu rong bin 1.1.1.Tỡnh hỡnh nghiờn cu v sn xut ethanol nhiờn liu t rong bin trờn th gii 1.1.2 Trin vng v phỏt trin nhiờn liu sinh hc Vit Nam 1.2 Nguyờn liu sn xut ethanol t rong bin 1.2.1 Thnh phn húa hc ca cỏc loi rong bin 1.2.2 Tim nng t ngun nguyờn liu rong bin 10 1.3 Cụng ngh sn xut ethanol t rong bin 12 1.3.1 S cụng ngh sn xut ethanol t rong bin 12 1.3.2 Quỏ trỡnh x lý nguyờn liu 13 1.3.3 Quỏ trỡnh thy phõn rong bin 13 1.3.4 Quỏ trỡnh lờn men dch thy phõn rong bin 19 Chng II: VT LIU V PHNG PHP NGHIấN CU 21 2.1 Vt liu 21 2.1.1 Sinh rong Lc 21 2.1.2 Vi sinh vt sinh enzyme thy phõn rong Lc 21 2.1.3 Hoỏ cht 22 2.1.4 Thit b 23 2.2 Phng phỏp phõn tớch 23 2.2.1 Xỏc nh hm lng polysaccharid thụ t sinh rong Lc 23 iv 2.2.2 Xỏc nh tinh bt thụ 24 2.2.3 Xỏc nh Ulvan thụ 25 2.2.4 Xỏc nh hot ca ch phm enzyme 25 2.2.5 Xỏc nh ng kh theo phng phỏp Somogyi Nelson 26 2.2.6 Xỏc nh hm lng carbohydrat hũa tan ca dch rong Lc thy phõn bng phng phỏp Dubois 27 2.2.7 Phng phỏp toỏn hc 28 2.2.8 Thng kờ s liu 29 2.3 Phng phỏp nghiờn cu 30 2.3.1 Phng phỏp nuụi cy t hp bn chng vi sinh vt v thu nhn enzyme thụ t c cht rong Lc 30 2.3.2 Tin x lý 30 2.3.3 Thy phõn bng enzyme 30 Chng III: KT QU NGHIấN CU 31 3.1 Thnh phn polysaccharid ca rong Lc 32 3.2 Sn xut v xỏc nh hot enzym ca ch phm vi sinh vt 33 3.2.1 Gii thớch s 33 3.2.2 Xỏc nh hot ch phm enzyme thụ 35 3.3 Kho sỏt quỏ trỡnh thy phõn sinh rong Lc t enzyme vi sinh vt 36 3.3.1 Kho sỏt nh hng ca pH n quỏ trỡnh thy phõn rong Lc 36 3.3.2 Kho sỏt nh hng ca nhit n quỏ trỡnh thy phõn rong Lc 37 3.3.3 Kho sỏt nh hng ca thi gian n quỏ trỡnh thy phõn rong Lc 37 3.4 Ti u húa iu kin thy phõn rong lc thu nhn dch thy phõn cú hm lng ng cao 38 KT LUN V KIN NGH 43 TI LIU THAM KHO 44 PH LC 48 v DANH MC BNG Bng 1.1 Cỏc cụng ty ang tham gia sn xut nhiờn liu sinh hc t rong bin [12] Bng 1.2 Thnh phn húa hc ca cỏc loi rong bin [17] Bng 1.3 Din tớch nuụi v sn lng rong bin ti thi im kho sỏt (2009) v d kin n nm 2015 [20] 10 Bng 1.4 So sỏnh nng sut nuụi trng ca cỏc ngun sinh 11 Bng 1.5 Thnh phn húa hc rong bin v ng to thnh bi thy phõn ca cỏc loi rong bin [17] .14 Bng 1.6 Bng cỏc yu t nh hng n quỏ trỡnh thy phõn bng axit 18 Bng 1.7 Bng cỏc yu t nh hng n quỏ trỡnh thy phõn bng enzyme 18 Bng 3.1 Thnh phn polysaccharid rong Lc .32 Bng 3.2 Hot ch phm enzyme vi sinh vt thy phõn cỏc loi polysaccharid 36 Bng 3.3 Ma trn thc nghim 39 Bng 3.4 Kt qu mụ hỡnh hi quy tuyn tớnh trờn excel .40 Bng 3.5 Kt qu tớnh bc chuyn ng (j) ca cỏc yu t 41 Bng 3.6 Ti u húa iu kin thy phõn rong theo Box-wilson 42 vi DANH MC BIU Hỡnh 1.1 S cụng ngh sn xut ethanol t rong bin 12 Hỡnh 2.1 Ch phm sinh hc TRICHOMIX-DT 22 Hỡnh 2.2 Quy trỡnh x lý nguyờn liu v thy phõn rong bin bng enzyme 31 Hỡnh 3.1 S sn xut ch phm enzym t nuụi cy cỏc chng vi sinh vt .33 Hỡnh 3.2 Canh trng nuụi cy vi sinh vy v ch phm enzyme thu c 35 Hỡnh 3.3 nh hng ca pH n quỏ trỡnh thy phõn .36 Hỡnh 3.4 nh hng ca nhit n quỏ trỡnh thy phõn .37 Hỡnh 3.5 nh hng ca thi gian n quỏ trỡnh thy phõn 38 vii M U K t cuc cỏch mng cụng nghip th gii, nhu cu v nng lng trờn th gii ngy cng tng v c ỏp ng ch yu ngun nhiờn liu húa thch nh than, du v khớ t nhiờn Tuy nhiờn, nhu cu v nng lng khụng ngng tng nhanh v ngun ti nguyờn nhiờn liu húa thch ang cn kit tr lng cú hn m s tng trng nhanh chúng ca nhng nn kinh t cú thu nhp thp, trung bỡnh ngy cng ln Mt khỏc dõn s th gii ang ngy mt tng lờn, d kin lng tiờu th khớ t, than ỏ, du s tng lờn 26% 20 nm tip theo Ngoi ra, mụi trng v kinh t ang gp phi nhiu thỏch thc liờn quan n vic s dng ti nguyờn nhiờn liu húa thch, bao gm hiu ng nh kớnh, s núng lờn ton cu, rỳt xung sụng bng, mc nc bin dõng, mt a dng sinh hc, du thụ tng giỏ du, v mt an ninh nng lng Tt c nhng yu t ny ó nhn mnh s cn thit phi thay th ngun nhiờn liu húa thch bng cỏc ngun nhiờn liu khỏc sch cú hiu qu kinh t v s dng cao v cú kh nng phc hi Nhiờn liu sinh hc l mt thay th tuyt vi cho cỏc ngun nng lng t nhiờn liu húa thch truyn thng, vỡ chỳng cú th c sn xut t ngun cung sinh tỏi to di Trong ú, ethanol nhiờn liu sinh hc l mt nhng gii phỏp u tiờn chớnh sỏch nng lng ca nhiu nc trờn th gii Nhiờn liu sinh hc nh ethanol ớt c hi, cú th phõn hy v to cỏc cht gõy ụ nhim ớt hn so vi nhiờn liu du khớ Cỏc ngun nguyờn liu ó c nghiờn cu sn xut ethanol bao gm cỏc loi cõy lng thc, ng mớa, lignocellulose t g, ph phm nụng nghip Tuy nhiờn nhng ngun nguyờn liu ny gõy tỏc ng khụng tt n an ninh lng thc, k thut sn xut, mụi trng sn xut Do vy, rong to bin l i tng ang c th gii quan tõm lnh vc sn xut ethanol nhiờn liu sinh hc Vit Nam l nc nm vựng nhit i giú ụng Nam chõu vi h thng sụng sui dy c cựng vi trờn 3260km b bin, trờn 3000 o v qun o, cựng vi h sinh thỏi in hỡnh vựng nc thm lc a rng ln nh cỏc rn san hụ, rng ngp mn, chui m phỏ ven bin cỏc h ca sụng chỳng l ni sinh sng v phỏt trin ca hng cỏc loi thy sinh vt, ú cú rong to bin Rong to bin l ngun sinh t nhiờn rt a dng v chng loi, phong phỳ v sn lng Thnh phn rong to bin cú hm lng polysacchrid cao, cú kh nng thy phõn thnh cỏc dng ng n, õy l ngun c cht quan trng cho vi sinh vt thc hin quỏ trỡnh lờn men sn xut nhiờn liu sinh hc Bờn cnh ú, rong bin khụng cú lignin, vỡ vy cú th xem rong to bin l vt liu d phõn gii thnh glucose hn cỏc thc vt trờn cn, c bit hm lng carbonhydrate mt s loi rong rt cao t 40% - 79,4% (Gelidium amansi) v hiu sut chuyn húa ca quỏ trỡnh lờn men ethanol khong 70% Mt khỏc, rong bin cú sn lng t nhiờn ln, vũng i sinh trng ngn, kh nng sinh sn v sinh trng nhanh, cú th c phỏt trin mt lot cỏc mụi trng bao gm c nc ngt, nc mn, nc thi ụ th m khụng cnh tranh vi t nụng nghip; khụng cn phõn bún, khụng gõy ụ nhim mụi trng; chi phớ sn xut thp, d thu hoch Vi rt nhiu nhng u im nh vy, hin nay, rong bin ang c bit n nh l ngun nguyờn liu tim nng sn sut ethanol nhiờn liu sinh hc th h th Trong cụng ngh sn xut ethanol nhiờn liu t rong bin, quỏ trỡnh thy phõn rong bin úng vai trũ quan trng nhm to cỏc sn phm tin hnh lờn men to ethanol Do ú, chỳng tụi tin hnh ti Nghiờn cu iu kin thy phõn rong Lc bng ch phm enzym thụ thu c t vi sinh vt ng dng sn xut cn nhiờn liu Mc ớch: Nghiờn cu cỏc iu kin thy phõn rong Lc bng ch phm enzym thụ thu c t cỏc chng vi sinh vt i tng nghiờn cu: Rong lc Chaetomorpha sp Phm vi nghiờn cu: Xỏc nh cỏc thụng s cụng ngh thy phõn rong Lc bng ch phm enzym thụ thu c t cỏc chng vi sinh vt í ngha khoa hc ca ti Gúp phn tỡm ngun nguyờn liu mi thay th cho cỏc ngun nguyờn liu ph bin sn xut bioethanol hin ang nh hng n an ninh lng thc v cht t Gii quyt k thut sn xut ethanol nhiờn liu t rong Lc Chng I TNG QUAN 1.1 S phỏt trin ethanol nhiờn liu t nguyờn liu rong bin 1.1.1 Tỡnh hỡnh nghiờn cu v sn xut ethanol nhiờn liu t rong bin trờn th gii Trờn th gii, tỡnh hỡnh nghiờn cu v sn xut ethanol t nguyờn liu rong bin cng ó c nhiu nc quan tõm Brazil l nc s xõy dng nh mỏy sn xut nhiờn liu sinh hc t rong bin u tiờn trờn th gii vo cui nm 2013 Bờn cnh ú, mt s nc cng ó cú cỏc d ỏn phỏt trin rong bin cụng nghip Ti Nht, d ỏn Sunrise [7] sn xut bioethanol t rong bin Sargassum c nuụi trng ngoi bin Nht Bn K hoch ca h bt u vo nm 2012, phỏt trin cụng ngh nuụi rong bin vo nm 2016, v thit lp mt quy trỡnh sn xut khong nm 2020 Nht Bn bt u trin khai t thỏng 3/2007, theo ú h s dng t ng cng 10.000km2 mt nc trng loi rong m Sargassum hondawara nhm sn xut mi nm 20 triu bioethanol, ngha l tng ng vi 1/3 nhu cu tiờu th nhiờn liu ca nc ny Ti Na Uy, d ỏn sn xut ethanol v cỏc sn phm Lipids, Proteins, Iodine t rong bin theo qu ti tr ca BALs R&D bt u t cui nm 2010 Ti Hn Quc, d ỏn 275 triu USD 10 nm sn xut 400 triu gallon vo nm 2020 xp x 13% nhu cu tiờu th nc D ỏn s nuụi trng rong bin trờn din tớch 8.600 u thỏng 11/2008 mt d ỏn hp tỏc c ký gia Hn Quc v Indonesia nhm trng rong cỏc o Maluku, Belitung v Lombok sn xut biodiesel theo cụng ngh Italia [12] Tng t, mt d ỏn gia chớnh ph Philippin v Vin K thut cụng ngh Hn Quc, u t triu USD trng 250 acre rong bin v sn xut ethanol t cụng ngh Hn Quc Theo kt qu ph lc v hỡnh 3.3 ta thy hm lng carbohydrat hũa tan sau thy phõn bin ng theo cỏc mc pH Hm lng carbohydrat hũa tan tng dn pH tng dn khong pH = 4,0 5,0, sau ú s gim dn pH tng t 5,0 5,5 Ti pH = 5,0 cho hm lng lng carbohydrat hũa tan sau thy phõn t ln nht l 12,20 0,04 mg/ml 3.3.2 Kho sỏt nh hng ca nhit n quỏ trỡnh thy phõn rong Lc Chỳng tụi tin hnh kho sỏt nhit thy phõn iu kin c nh ba yu t l pH = 5,0, thi gian 36 gi, nng enzyme ml/g Kt qu c th hin ph lc v hỡnh 3.4 Hỡnh 3.4 nh hng ca nhit n quỏ trỡnh thy phõn Theo kt qu ph lc v hỡnh 3.4 ta thy hm lng carbohydrat hũa tan sau thy phõn tng dn nhit tng Ti to = 45oC hm lng lng carbohydrat hũa tan sau thy phõn t ln nht l 12,02 0,19 mg/ml Tuy nhiờn tip tc tng nhit trờn 45oC thỡ hm lng lng carbohydrat hũa tan gim dn 3.3.3 Kho sỏt nh hng ca thi gian n quỏ trỡnh thy phõn rong Lc Chỳng tụi tin hnh kho sỏt thi gian thy phõn iu kin c nh ba yu t l pH = 5,0, nhit 45oC, nng enzyme ml/g Kt qu c th hin ph lc v hỡnh 3.5 37 Hỡnh 3.5 nh hng ca thi gian n quỏ trỡnh thy phõn Theo kt qu ph lc v hỡnh 3.5 ta thy hm lng carbohydrat hũa tan tng dn theo thi gian thy phõn, nhiờn t 30h tr i thỡ hm lng lng carbohydrat hũa tan tng chm Hm lng lng carbohydrat hũa tan sau thy phõn 36h l 12,17 0,18 mg/ml 3.4 Ti u húa iu kin thy phõn rong lc thu nhn dch thy phõn cú hm lng ng cao Sau tin hnh cỏc thớ nghim thm dũ, chỳng tụi chn cỏc yu t thi gian nhit v pH ti u húa iu kin thy phõn rong Lc bng ch phm enzyme nh phng phỏp quy hoch húa thc nghim Khong xỏc nh ca cỏc yu t nh sau: Cỏc bin s Thi gian: X1 [24-40] Nhit : X2 [40-50] n v Gi o C pH Cỏc khong cỏch gi a cỏc bin s 0,5 [4.5-5.5] 38 Mc thớ nghim: Mc thớ nghim X1 X2 X3 Mc gc 32 45 Khong bin i 0,5 Mc di 24 40 4,5 Mc trờn 40 50 5,5 Ch tiờu cn ti u: hm lng carbonhydrat hũa tan ca dch thy phõn cú y max Ma trn thc nghim c thit lp theo phng phỏp yu t y vi s thớ nghim N = 2k = 23 = N: s thớ nghim s mc thớ nghim s yu t nh hng - Lp ma trn thc nghim: Dựng 24 bỡnh tam giỏc 50ml, cõn cho vo mi bỡnh 5g nguyờn liu cú m 13% B sung vo bỡnh 50ml dung dch 0,3% acid H2SO4 Dựng que thy tinh trn u ri nỳt cỏc bỡnh bng bụng khụng thm nc v hp tin x lý ti 121oC 15 phỳt Hp xong ngui b sung cỏc nng enzyme theo t l ml/1g nguyờn liu Cỏc bỡnh tam giỏc c gi iu kin nhit 40 v 500C v pH= 4,5 v 5,5 Sau 24 v 40 gi mang xỏc nh hm lng carbonhydrat ca dch thy phõn Bng 3.3 Ma trn thc nghim Stn X1 -1 -1 -1 -1 X2 -1 -1 1 -1 -1 X3 -1 -1 -1 -1 1 Y1 10,6 11,2 11,4 12,2 10,8 12,1 11,6 39 Y2 10,7 11,3 11,5 12,4 11,1 12,3 11,5 Y3 10,8 11,1 11,3 12,3 10,8 11,9 11,1 Y 10,7 11,2 11,4 12,3 10,9 12,1 11,4 1 12,3 12,2 12,1 12,2 Bng 3.4 Kt qu mụ hỡnh hi quy tuyn tớnh trờn excel Mụ hỡnh hi quy tuyn tớnh Cỏc thụng s ca mụ hỡnh hi quy Giỏ tr Biu hin ca cỏc giỏ tr (0 0,9) tin cy cao Do vy phng trỡnh c lp chun cho cỏc ch s phõn tớch Ph lc Ph mu ca dch ng chun v cỏc mu thớ nghim xỏc nh theo phng phỏp Dubois 49 Ph lc Cỏc mc nng ng glucose pha loóng v giỏ tr OD tng ng o ti bc súng 620 nm Nng dung dch Giỏ tr o OD (620 nm) Glucose chun (àg/ml) Ln Ln Ln Trung bỡnh 0 0 20 0,130 0,132 0,141 0,134 40 0,342 0,345 0,348 0,345 60 0,537 0,541 0,547 0,542 80 0,780 0,786 0,791 0,786 100 0,948 0,952 0,960 0,953 Ph lc Lp biu ng chun t cỏc kt qu o c ca mu chun xỏc nh theo phng phỏp Dubois S dng phn mm Excel ta lp c phng trỡnh ng chun Y = 0,009X + 0,0067 (R2 = 0,9971) Phng trỡnh ng chun ny cú h s R (1> R> 0,9) tin cy cao Do vy phng trỡnh c lp chun cho cỏc ch s phõn tớch 50 Ph lc nh hng ca pH n quỏ trỡnh thy phõn Hm lng carbonhydrat hũa tan (mg/ml) Ln o Trung lch bỡnh chun 10,98 11,16 0,17 11,44 11,36 11,40 0,12 12,24 12,16 12,20 12,20 0,14 11,84 11,80 11,82 11,82 0,12 pH 4,0 11,31 11,18 pH 4,5 11,60 pH 5,0 pH 5,5 pH Ph lc nh hng ca nhit n quỏ trỡnh thy phõn Hm lng carbonhydrat hũa tan (mg/ml) Ln o Trung lch bỡnh chun 4,04 4,00 0,04 8,29 8,40 8,27 0,15 11,91 12,09 12,24 12,08 0,17 45oC 12,40 12,53 12,78 12,57 0,19 50oC 11,96 12,07 12,20 12,07 0,12 30oC 3,96 35oC 8,11 40oC Nhit Ph lc nh hng ca thi gian n quỏ trỡnh thy phõn Hm lng carbonhydrat hũa tan (mg/ml) Ln o Trung lch bỡnh chun 6,93 6,73 0,19 10,73 10,87 10,72 0,16 10,89 11,02 11,16 11,02 0,13 36 h 11,98 12,18 12,33 12,16 0,18 40h 12,32 12,18 12,28 12,26 0,16 12 h 6,56 6,69 24 h 10,56 30 h Thi gian 51 ... Nghiên cứu điều kiện thủy phân rong Lục chế phẩm enzym thô thu từ vi sinh vật” để ứng dụng sản xuất cồn nhiên liệu Mục đích: Nghiên cứu điều kiện thủy phân rong Lục chế phẩm enzym thô thu từ chủng... nhiệt độ đến trình thủy phân rong Lục 37 3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng thời gian đến trình thủy phân rong Lục 37 3.4 Tối ƣu hóa điều kiện thủy phân rong lục để thu nhận dịch thủy phân có hàm lƣợng... thu từ chủng vi sinh vật Đối tƣợng nghiên cứu: Rong lục Chaetomorpha sp Phạm vi nghiên cứu: Xác định thông số công nghệ thủy phân rong Lục chế phẩm enzym thô thu từ chủng vi sinh vật Ý nghĩa khoa