nghiên cứu điều kiện thủy phân chitin thu nhận nacetyldglucosamine, sử dụng enzyme endochitinase và βhexosaminidase tái tổ hợp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM oOo GIANG TRUNG DŨNG NGHIÊN CỨU ðIỀU KIỆN THỦY PHÂN CHITIN THU NHẬN N-ACETYL-D-GLUCOSAMINE, SỬ DỤNG ENZYME ENDOCHITINASE VÀ β-HEXOSAMINIDASE TÁI TỔ HỢP LUẬN VĂN THẠC SỸ CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SAU THU HOẠCH HÀ NỘI, NĂM 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM oOo GIANG TRUNG DŨNG NGHIÊN CỨU ðIỀU KIỆN THỦY PHÂN CHITIN THU NHẬN N-ACETYL-D-GLUCOSAMINE, SỬ DỤNG ENZYME ENDOCHITINASE VÀ β-HEXOSAMINIDASE TÁI TỔ HỢP CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SAU THU HOẠCH Mà SỐ : 60-54-10 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN HOÀNG ANH PGS.TS LÊ THANH HÀ HÀ NỘI, NĂM 2014 LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan rằng, số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa ñược sử dụng Tôi xin cam ñoan, giúp ñỡ cho việc thực luận văn ñã ñược cảm ơn thông tin trích dẫn luận văn ñã ñược ghi rõ nguồn gốc Hà nội, ngày 25 tháng năm 2014 Học viên Giang Trung Dũng Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page i LỜI CẢM ƠN ðể hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, cố gắng thân, nhận ñược nhiều quan tâm, giúp ñỡ tổ chức cá nhân Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc ñến thầy giáo TS Nguyễn Hoàng Anh, Phó trưởng khoa Công nghệ Thực phẩm, Học viện Nông nghiệp Việt Nam cô giáo PGS.TS Lê Thanh Hà, viện Sinh học Công nghệ thực phẩm, trường ðại học Bách khoa Hà Nội ñã tận tình hướng dẫn, truyền ñạt cho kiến thức quý báu lĩnh vực chuyên môn luận văn, ñộng viên giúp ñỡ thực hoàn thành công trình nghiên cứu khoa học Tôi xin trân trọng cảm ơn thầy giáo TS Hoàng Hải Hà, khoa Công nghệ thực phẩm bạn ðỗ Hải Quỳnh, học viên K22, Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam ñã nhiệt tình giúp ñỡ suốt trình thực ñề tài Tôi xin trân trọng cảm ơn giúp ñỡ thầy cô giáo, cán khoa Công nghệ Thực phẩm, khoa Công nghệ sinh học, phòng thí nghiệm Trung tâm khoa Thú Y- Học viện Nông nghiệp Việt Nam ñã tạo ñiều kiện thuận lợi cho thực ñề tài tốt nghiệp Tôi xin trân trọng cảm ơn lãnh ñạo Huyện ủy – UBND huyện Mường Khương, lãnh ñạo công chức phòng Nông nghiệp PTNT huyện Mường Khương, tỉnh Lào Cai ñã tạo ñiều kiện, hỗ trợ giúp ñỡ trình học tập, nghiên cứu Học viện Nông nghiệp Việt Nam Tôi xin trân trọng cảm ơn bạn bè ñã bên, ñộng viên khuyến khích trình thực ñề tài nghiên cứu ðặc biệt, xin bày tỏ tình cảm sâu sắc ñến bố, mẹ vợ người thân trong gia ñình ñã quan tâm ñộng viên trình học tập nghiên cứu hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp Một lần xin chân thành cảm ơn! Hà nội, ngày 25 tháng năm 2014 Học viên Giang Trung Dũng Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ii MỤC LỤC Lời cam ñoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt vi Danh mục bảng Danh mục hình PHẦN ðẶT VẤN ðỀ 1.1 ðặt vấn ñề 1.2 Mục ñích - yêu cầu 1.2.1 Mục ñích 1.2.2 Yêu cầu PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tìm hiểu chung chitin 2.1.1 Nguồn gốc tồn chitin tự nhiên 2.1.2 Tính chất lý hóa chitin 2.2 Tìm hiểu chung GlcNAc 2.2.1 Công thức cấu tạo 2.2.2 Tính chất GlcNAc 2.2.3 Vai trò GlcNAc 2.2.4 Phương pháp sản xuất 2.3 Vi khuẩn Bacillus licheniformis Lactococcus lactis khả ứng dụng ñể sản xuất enzyme 11 2.3.1 ðặc ñiểm hình thái Bacillus licheniformis Lactococcus lactis 11 2.3.2 ðặc ñiểm sinh lý Bacillus licheniformis Lactococcus lactis 11 2.3.3 Ứng dụng Bacillus licheniformis Lactococcus lactis 12 2.4 Giới thiệu enzyme endochitinase 14 2.4.1 Khối lượng phân tử chế xúc tác endochitinase 14 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iii 2.4.2 Ảnh hưởng nhiệt ñộ pH ñến hoạt ñộng endochitinase 15 2.4.3 Nguồn thu nhận endochitinase 15 2.5 Tìm hiểu enzyme β-hexosaminidase 16 2.5.1 Cơ chế xúc tác β-hexosaminidase 16 2.5.2 Một số ñặc tính β-hexosaminidase 17 2.5.3 Vai trò β-hexosaminidase 18 PHẦN 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 3.1 Vật liệu 19 3.1.1 ðối tượng nghiên cứu 19 3.1.2 ðịa ñiểm nghiên cứu 19 3.1.3 Thời gian nghiên cứu 19 3.1.4 Dụng cụ, hóa chất 19 3.2 Nội dung nghiên cứu 23 3.3 Phương pháp nghiên cứu 23 3.3.1 Nuôi cấy thu sinh khối tế bào 23 3.3.2 Xác ñịnh mức ñộ biểu gene mã hóa cho endochitinase βhexosaminidase phương pháp ñiện di SDS-PAGE 24 3.3.3 Tinh enzyme hệ thống sắc ký lỏng FPLC 25 3.3.4 Phương pháp tinh enzyme muối (NH4)2SO4 26 3.3.5 Phương pháp tạo chất colloidal chitin 26 3.3.6 Phương pháp xác ñịnh hoạt tính endochitinase 27 3.3.7 Phương pháp xác ñịnh hoạt tính β-hexosaminidase 28 3.3.8 Phương pháp xác ñịnh hàm lượng protein phương pháp Bradford 29 3.3.9 Xác ñịnh nhiệt ñộ tối thích ñộ bền nhiệt endochitinase βhexosaminidase 29 3.3.10 Xác ñịnh pH tối thích ñộ bền pH endochitinase βhexosaminidase 30 3.3.11 Xác ñịnh sản phẩm thủy phân sắc ký mỏng TLC 30 3.4 31 Phương pháp thống kê xử lý kết Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iv PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 32 Nuôi cấy 02 chủng E.coli tái hợp xác ñịnh mức ñộ biểu gen mã hóa cho endochitinase β-hexosaminidase 32 4.1.1 Nuôi cấy chủng E.coli tái tổ hợp thu sinh khối 32 4.1.2 Xác ñịnh mức ñộ biểu gene mã hóa cho endochitinase βhexosaminidase 32 4.2 Tinh endochitinase β-hexosaminidase 33 4.2.1 Tinh endochitinase 33 4.2.2 Tinh β-hexosaminidase 36 4.3 Xác ñịnh số ñặc tính thủy phân colloidal chitin endochitinase thủy phân pNP-GlcNAc β-hexosaminidase 38 4.3.1 Xác ñịnh nhiệt ñộ tối ưu ñộ bền nhiệt endochitinase 38 4.3.2 Xác ñịnh nhiệt ñộ tối ưu ñộ bền nhiệt β-hexosaminidase 40 4.3.3 Xác ñịnh pH tối ưu ñộ bền pH endochitinase 42 4.3.4 Xác ñịnh pH tối ưu ñộ bền pH β-hexosaminidase 45 4.4 Phân tích thành phần chitooligosaccharide GlcNAc sản phẩm thủy phân 4.4.1 47 Xác ñịnh khả thủy phân colloidal chitin endochitinase 47 phương pháp TLC 4.4.2 Xác ñịnh khả thủy phân oligosaccharides β-hexosaminidase phương pháp TLC 4.5 48 Xây dựng quy trình thủy phân chitin thu GlcNAc cách kết hợp hai enzyme 48 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52 5.1 Kết luận 52 5.2 Kiến nghị 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DNS Dinitrosaicylic acid GlcNAc N-acetyl-β-D-glucosamine FPLC Fast protein liquid chromatography LB Luria bertani RPM Revolutions per minute PAGE Polyarylamide gel electrophoresis pNP-GlcNAc p-nitrophenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide IPTG Isopropyl -thio-β-D-galactopyranoside TEMED N,N,N’,N’-tetramethylethynediamine TLC Thin layer chromatography SDS Sodium Dodecyl Sulfate w/v Khối lượng/thể tích Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vi DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1: Dụng cụ sử dụng nghiên cứu 20 Bảng 3.2: Thành phần gel cô gel tách 24 Bảng 4.1: Hoạt tính enzyme endochitinase tái tổ hợp thu ñược tinh sắc ký FPLC tính theo lít dịch nuôi cấy 34 Bảng 4.2: Hoạt tính endochitinase tái tổ hợp thu ñược tinh nồng ñộ muối amonisunfat khác tính theo lít dịch nuôi cấy 35 Bảng 4.3:Hoạt tính β-hexosaminidase tái tổ hợp thu ñược tinh sắc ký FPLC tính cho lít dịch nuôi cấy 36 Bảng 4.4: Hoạt tính β-hexosaminidase tái tổ hợp thu ñược tinh nồng ñộ muối amonisunfat khác tính cho lít dịch nuôi cấy 37 Bảng phụ lục 1: Phản ứng DNS với nồng ñộ GlcNAc khác 58 Bảng phụ lục 2: Nồng ñộ dung dịch pNP 59 Bảng phụ lục 3.1: Phản ứng CBB G-250 với abumin 60 Bảng phụ lục 3.2: ðường chuẩn protein 60 Bảng phụ lục 4: Ảnh hưởng nhiệt ñộ ñến hoạt tính endochitinase 61 Bảng phụ lục 5: ðộ bền nhiệt endochitinase 37 0C 50 0C 61 Bảng phụ lục 6: Ảnh hưởng nhiệt ñộ ñến hoạt tính β-hexosaminidase 62 Bảng phụ lục 7: ðộ bền nhiệt β-hexosaminidase 62 Bảng phụ lục 8: Ảnh hưởng pH ñến hoạt tính endochitinase 63 Bảng phụ lục 9: ðộ bền pH endochitinase 64 Bảng phụ lục 10: Ảnh hưởng pH ñến hoạt tính β-hexosaminidase 64 Bảng phụ lục 11: ðộ bền pH β-hexosaminidase 65 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1:Cấu trúc phân tử chitin [51] Hình 2.2: Công thức cấu tạo GlcNAc [47] Hình 2.3: Vị trí phân thủy phân endochitinase 15 Hình 2.4: Vị trí thủy phân liên kết β-hexosaminidase 17 Hình 4.1: ðịnh tính khả sinh endochitinase vi khuẩn tái Bacillus licheniformis DSM13 tổ hợp ñiện di SDS-PAGE 32 Hình 4.2: ðịnh tính khả sinh β-hexosaminidase vi khuẩn Lactococcus lactis ssp.lactis IL1403 tái tổ hợp ñiện di SDS-PAG 33 Hình 4.3: Sắc ký ñồ tinh endochitinase tái tổ hợp 34 Hình 4.4: Sắc ký ñồ tinh β-hexosaminidase tái tổ hợp 36 Hình 4.5: ðồ thị ảnh hưởng nhiệt ñộ ñến hoạt tính endochitinase 39 o o Hình 4.6: ðộ bền endochitinase 37 C 50 C 40 Hình 4.7: Ảnh hưởng nhiệt ñộ ñến hoạt tính β-hexosaminidase 41 Hình 4.8: ðồ thị xác ñịnh ñộ bền nhiệt β-hexosaminidase 30oC 37oC 42 Hình 4.9: Ảnh hưởng pH ñến hoạt tính endochitinase 43 Hình 4.10: ðồ thị biểu diễn ñộ bền pH endochitinase 44 Hình 4.11: Ảnh hưởng pH ñến hoạt tính β-hexosaminidase 45 Hình 4.12: ðồ thị biểu diễn ñộ bền pH β-hexosaminidase 46 Hình 4.13: Sắc ký mỏng sản phẩm phân giải colloidal chitin 2% (A) 20 % (B) endochitinase thời gian thủy phân khác M Hỗn hợp chitooligosaccharide chuẩn 47 Hình 4.14: Sắc ký mỏng sản phẩm phân giải 50 mM diacetyl chitobiose (A) 50mM diacetyl chitotriose (B) β-hexosaminiase 48 Hình 4.15: Quy trình sản xuất GlcNAc từ chitin, sử dụng enzyme endochitinase β-hexosaminidase tái tổ hợp 49 Hình phụ lục 1: ðồ thị ñường chuẩn GlcNAc 58 Hình phụ lục 2: ðồ thị ñường ñường chuẩn pNP 59 Hình phụ lục 3: ðồ thị ñường chuẩn protein 60 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page viii Bảng phụ lục 8: Ảnh hưởng pH ñến hoạt tính endochitinase Hoạt tính Hoạt tính (U/ml) tương ñối (%) 4,0 0,243 18,672b 4,5 0,315 24,148b 5,0 0,345 26,475b 5,5 0,471 36,117b 6,0 0,574 44,071b 6,5 0,751 57,650b 7,0 1,200 91,983a 7,5 1,303 100a 8,0 1,230 94,397a 8,5 0,694 53,283b 9,0 0,382 29,318b 9,5 0,324 24,863b 10,0 0,191 14,654b pH * Các chữ giống cột thể không khác có ý nghĩa mức 5% Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 62 Bảng phụ lục 9: ðộ bền pH endochitinase pH5 Thời gian (ngày) U/ml HTTð (%) pH U/ml pH HTTð (%) U/ml HTTð (%) pH8 U/ml pH HTTð (%) U/ml HTTð (%) 0,34 100a 0,56 100a 1,16 100a 1,21 100a 0,38 100a 0,5 0,32 91,67b 0,55 98,03a 1,13 97,98b 1,17 96,71b 0,35 91,91b 0,28 81,50c 0,54 96,89a 1,12 96,83c 1,13 93,02c 0,29 77,31c 0,26 75,19d 0,53 94,55b 1,10 95,10d 1,12 91,98c 0,24 64,47d 0,22 65,21e 0,48 85,43c 1,06 91,64e 1,07 88,43d 0,21 56,64e 0,21 59,59f 0,45 81,36d 0,99 85,65f 0,99 81,38e 0,11 29,02g 10 0,14 41,09g 0,41 73,20e 0,92 79,11g 0,90 74,15f 15 0,32 57,31f 0,76 67,27h 0,74 61,07g 16 0.24 43,58g 0,66 56,83i 0,62 51,18h 18 0.21 38,25h 0,52 45,28j 0,46 38,02i * Các chữ giống cột thể không khác có ý nghĩa mức 5% Bảng phụ lục 10: Ảnh hưởng pH ñến hoạt tính β-hexosaminidase pH Hoạt tính (U/l) Hoạt tính tương ñối (%) 4,0 3,623 15,660d 4,5 6,257 27,250c 5,0 15,940 69,370b 5,5 21,577 93,890a 6,0 22,980 100a 6,5 18,447 67,220b 7,0 8,457 36,830c 8,0 4,433 19,290d 9,0 2,703 11,730d *Các chữ giống cột thể không khác có ý nghĩa mức 5% Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 63 Bảng phụ lục 11: ðộ bền pH β-hexosaminidase Thời gian giờ) pH U/ml HTTð (%) pH 5.5 U/ml HTTð (%) pH U/ml HTTð (%) pH 6.5 U/ml HTTð (%) pH U/ml HTTð (%) 16,30 100a 21,15 100a 23,18 100a 18,90 100a 8,46 100a 14,95 93,17b 20,75 98,11b 22,61 97,55b 17,84 94,57b 7,67 90,75b 12,40 77,73c 19,78 93,52c 21,05 90,82c 16,19 85,81c 6,19 73,18c 8,98 59,05d 18,34 86,72d 18,40 79,40d 13,14 69,67d 4,63 54,84d 6,94 41,64e 17,69 83,65e 17,99 77,62e 11,10 58,86e 2,98 35,28e 10 4,48 29,75f 17,04 80,56g 17,52 75,59f 8,55 45,34f 1,81 21,45f 15 15,09 71,38h 14,43 62,24g 4,62 24,50g 20 8,86 41,90i 7,93 34,22f * Các chữ giống cột thể không khác có ý nghĩa mức 5% Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 64 XỬ LÝ SỐ LIỆU THỐNG KÊ Enzyme endochitinase Nhiệt ñộ tối thích BALANCED ANOVA FOR VARIATE KQ FILE TOPT 29/ 6/** 16:58 PAGE VARIATE V003 KQ LN SOURCE OF VARIATION SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT 29947.8 3743.47 ****** 0.000 * RESIDUAL 18 4.53492 251940 * TOTAL (CORRECTED) 26 29952.3 1152.01 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TOPT 29/ 6/** 16:58 PAGE MEANS FOR EFFECT CT CT 30 37 40 45 50 55 60 65 70 NOS 3 3 3 3 DF KQ 39.7067 61.2867 66.4967 96.5033 100.000 94.3967 45.7467 11.1700 6.51667 SE(N= 3) 0.289793 5%LSD 18DF 0.861017 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TOPT 29/ 6/** 16:58 PAGE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE KQ GRAND MEAN (N= 27) NO OBS 27 57.980 STANDARD DEVIATION C OF V |CT SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 33.941 0.50194 0.9 0.0000 | | | | ðộ bền nhiệt 37 0C BALANCED ANOVA FOR VARIATE KQ FILE T370C 29/ 6/** 17: PAGE VARIATE V003 KQ LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT 11164.1 1240.45 ****** 0.000 * RESIDUAL 20 12.7073 635363 * TOTAL (CORRECTED) 29 11176.8 385.406 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 65 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE T370C 29/ 6/** 17: PAGE MEANS FOR EFFECT CT CT 10 12 14 16 18 NOS 3 3 3 3 3 KQ 100.000 94.8483 85.5523 83.9217 78.7073 73.6190 69.5337 60.9307 44.4710 37.8767 SE(N= 3) 0.460204 5%LSD 20DF 1.35759 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE T370C 29/ 6/** 17: PAGE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE KQ GRAND MEAN (N= 30) NO OBS 30 72.946 STANDARD DEVIATION C OF V |CT SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 19.632 0.79710 1.1 0.0000 | | | | ðộ bền nhiệt 50 0C BALANCED ANOVA FOR VARIATE KQ FILE T500C 29/ 6/** 17:21 PAGE VARIATE V003 KQ LN SOURCE OF VARIATION SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT 8224.70 1644.94 ****** 0.000 * RESIDUAL 12 4.72853 394044 * TOTAL (CORRECTED) 17 8229.43 484.084 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE T500C 29/ 6/** 17:21 PAGE MEANS FOR EFFECT CT CT 10 NOS 3 3 3 DF KQ 100.000 93.3010 71.0673 56.3400 51.2037 42.3770 SE(N= 3) 0.362420 5%LSD 12DF 1.11674 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE T500C 29/ 6/** 17:21 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 66 PAGE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE KQ GRAND MEAN (N= 18) NO OBS 18 69.048 STANDARD DEVIATION C OF V |CT SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 22.002 0.62773 0.9 0.0000 | | | | pH tối thích SINGLE EFFECT ANOVA FOR UNBALANCED DATA FILE PHOPT 3/ 7/** 16:47 PAGE ANOVA FOR SINGLE EFFECT - CT -VARIATE TREATMENT MS - DF RESIDUAL MS - DF F-RATIO F-PROB KQ 4955.6 98.169 32 50.48 0.000 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE PHOPT 3/ 7/** 16:47 PAGE MEANS FOR EFFECT CT CT 10 NOS 6 6 6 KQ 21.4099 31.2960 50.8607 95.9916 73.8403 27.0901 14.6545 SE(N= 6) 4.04493 5%LSD 32DF 11.6515 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE PHOPT 3/ 7/** 16:47 PAGE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE KQ GRAND MEAN (N= 39) NO OBS 39 47.356 STANDARD DEVIATION C OF V |CT SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 29.413 9.9080 20.9 0.0000 | | | | ðộ bền pH SINGLE EFFECT ANOVA FOR UNBALANCED DATA FILE PH5 29/ 6/** 16:32 PAGE ANOVA FOR SINGLE EFFECT - CT -VARIATE TREATMENT MS - DF RESIDUAL MS - DF F-RATIO F-PROB KQ 1426.4 7.7048 15 185.13 0.000 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE PH5 29/ 6/** 16:32 PAGE MEANS FOR EFFECT CT CT NOS 3 KQ 95.8348 81.4953 75.1917 65.2103 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 67 10 3 59.5897 41.0870 SE(N= 4) 1.38787 5%LSD 15DF 4.18353 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE PH5 29/ 6/** 16:32 PAGE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE KQ GRAND MEAN (N= 21) NO OBS 21 73.463 STANDARD DEVIATION C OF V |CT SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 19.036 2.7757 3.8 0.0000 | | | | ðộ bền pH SINGLE EFFECT ANOVA FOR UNBALANCED DATA FILE PH6 29/ 6/** 16:28 PAGE ANOVA FOR SINGLE EFFECT - CT -VARIATE TREATMENT MS - DF RESIDUAL MS - DF F-RATIO F-PROB KQ 1793.5 5.9215 21 302.89 0.000 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE PH6 29/ 6/** 16:28 PAGE MEANS FOR EFFECT CT CT 10 15 16 18 NOS 3 3 3 3 KQ 99.0130 96.8863 94.5487 85.4317 81.3563 73.1963 57.3120 43.5830 38.2500 SE(N= 3) 1.40493 5%LSD 21DF 4.13186 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE PH6 29/ 6/** 16:28 PAGE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE KQ GRAND MEAN (N= 30) NO OBS 30 76.859 STANDARD DEVIATION C OF V |CT SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 22.340 2.4334 3.2 0.0000 | | | | ðộ bền pH SINGLE EFFECT ANOVA FOR UNBALANCED DATA FILE PH7 29/ 6/** 16:22 PAGE ANOVA FOR SINGLE EFFECT - CT -VARIATE TREATMENT MS - DF RESIDUAL MS - DF F-RATIO F-PROB Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 68 KQ 1230.4 0.62821 21 1958.52 0.000 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE PH7 29/ 6/** 16:22 PAGE MEANS FOR EFFECT CT CT 10 15 16 18 NOS 3 3 3 3 KQ 98.9905 96.8293 95.1003 91.6440 85.6500 79.1070 67.2697 56.8293 45.2753 SE(N= 3) 0.457606 5%LSD 21DF 1.34581 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE PH7 29/ 6/** 16:22 PAGE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE KQ GRAND MEAN (N= 30) NO OBS 30 81.569 STANDARD DEVIATION C OF V |CT SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 18.435 0.79260 1.0 0.0000 | | | | ðộ bền pH SINGLE EFFECT ANOVA FOR UNBALANCED DATA FILE PH8 29/ 6/** 16: PAGE ANOVA FOR SINGLE EFFECT - CT -VARIATE TREATMENT MS - DF RESIDUAL MS - DF F-RATIO F-PROB KQ 1495.1 1.2518 21 1194.34 0.000 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE PH8 29/ 6/** 16: PAGE MEANS FOR EFFECT CT CT 10 15 16 18 NOS 3 3 3 3 KQ 98.3528 93.0237 91.9783 88.4323 81.3757 74.1503 61.0720 51.1830 38.0223 SE(N= 3) 0.645965 5%LSD 21DF 1.89977 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE PH8 29/ 6/** 16: PAGE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 69 VARIATE KQ GRAND MEAN (N= 30) NO OBS 30 77.594 STANDARD DEVIATION C OF V |CT SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 20.331 1.1188 1.4 0.0000 | | | | ðộ bền pH SINGLE EFFECT ANOVA FOR UNBALANCED DATA FILE PH9 29/ 6/** 16:18 PAGE ANOVA FOR SINGLE EFFECT - CT -VARIATE TREATMENT MS - DF RESIDUAL MS - DF F-RATIO F-PROB KQ 2466.7 8.4049 13 293.48 0.000 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE PH9 29/ 6/** 16:18 PAGE MEANS FOR EFFECT CT CT NOS 3 3 KQ 95.9558 77.3087 64.4697 56.6400 29.0233 SE(N= 4) 1.44956 5%LSD 13DF 4.42878 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE PH9 29/ 6/** 16:18 PAGE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE KQ GRAND MEAN (N= 18) NO OBS 18 69.892 STANDARD DEVIATION C OF V |CT SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 24.224 2.8991 4.1 0.000 | | | | Enzyme β-hexosaminidase Nhiệt ñộ tối thích BALANCED ANOVA FOR VARIATE KQ FILE TOPT 3/ 7/** 16:50 PAGE VARIATE V003 KQ LN SOURCE OF VARIATION SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT 14894.0 2127.72 665.59 0.000 * RESIDUAL 16 51.1476 3.19673 * TOTAL (CORRECTED) 23 14945.2 649.791 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TOPT 3/ 7/** 16:50 PAGE MEANS FOR EFFECT CT CT 25 30 37 NOS 3 DF KQ 61.1980 82.3867 100.000 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 70 40 45 50 55 60 3 3 92.8170 69.6523 56.1330 35.2943 24.1737 SE(N= 3) 1.03227 5%LSD 16DF 3.09475 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TOPT 3/ 7/** 16:50 PAGE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE KQ GRAND MEAN (N= 24) NO OBS 24 65.207 STANDARD DEVIATION C OF V |CT SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 25.491 1.7879 2.7 0.0000 | | | | ðộ bền nhiệt 30 0C BALANCED ANOVA FOR VARIATE KQ FILE BEN30OC 29/ 6/** 17:35 PAGE VARIATE V003 KQ LN SOURCE OF VARIATION SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT 10 16030.8 1603.08 715.68 0.000 * RESIDUAL 22 49.2790 2.23995 * TOTAL (CORRECTED) 32 16080.1 502.503 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE BEN30OC 29/ 6/** 17:35 PAGE MEANS FOR EFFECT CT CT 10 15 20 30 40 50 NOS 3 3 3 3 3 DF KQ 100.000 98.8813 95.3407 93.9047 91.2663 87.5327 72.6573 66.3933 57.3830 45.9497 33.1737 SE(N= 3) 0.864090 5%LSD 22DF 2.53424 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE BEN30OC 29/ 6/** 17:35 PAGE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE GRAND MEAN (N= 33) NO OBS STANDARD DEVIATION C OF V |CT SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp | | | | Page 71 KQ 33 76.589 22.417 1.4966 2.0 0.0000 ðộ bền nhiệt 37 0C BALANCED ANOVA FOR VARIATE KQ FILE BEN37OC 29/ 6/** 17:38 PAGE VARIATE V003 KQ LN SOURCE OF VARIATION SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT 9426.89 1346.70 404.93 0.000 * RESIDUAL 16 53.2127 3.32579 * TOTAL (CORRECTED) 23 9480.10 412.178 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE BEN37OC 29/ 6/** 17:38 PAGE MEANS FOR EFFECT CT CT 10 15 20 NOS 3 3 3 3 DF KQ 100.000 97.5563 90.8390 79.3960 77.6267 75.6100 64.2800 34.2110 SE(N= 3) 1.05290 5%LSD 16DF 3.15661 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE BEN37OC 29/ 6/** 17:38 PAGE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE KQ GRAND MEAN (N= 24) NO OBS 24 77.440 STANDARD DEVIATION C OF V |CT SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 20.302 1.8237 2.4 0.0000 | | | | pH tối thích SINGLE EFFECT ANOVA FOR UNBALANCED DATA FILE PHOPT 29/ 6/** 18:54 PAGE ANOVA FOR SINGLE EFFECT - CT -VARIATE TREATMENT MS - DF RESIDUAL MS - DF F-RATIO F-PROB KQ 5654.9 81.812 21 69.12 0.000 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE PHOPT 29/ 6/** 18:54 PAGE MEANS FOR EFFECT CT CT NOS 6 3 KQ 21.4988 81.6293 90.1422 36.8073 19.2923 11.7673 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 72 SE(N= 5) 4.04504 5%LSD 21DF 11.8964 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE PHOPT 29/ 6/** 18:54 PAGE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE KQ GRAND MEAN (N= 27) NO OBS 27 50.490 STANDARD DEVIATION C OF V |CT SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 33.964 9.0450 17.9 0.0000 | | | | ðộ bền pH BALANCED ANOVA FOR VARIATE KQ FILE PH5 29/ 6/** 18: PAGE VARIATE V003 KQ LN SOURCE OF VARIATION SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT 11947.2 2389.44 300.00 0.000 * RESIDUAL 12 95.5775 7.96479 * TOTAL (CORRECTED) 17 12042.8 708.399 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE PH5 29/ 6/** 18: PAGE MEANS FOR EFFECT CT CT 10 NOS 3 3 3 DF KQ 100.000 93.1687 77.7297 59.0483 41.6410 29.7543 SE(N= 3) 1.62940 5%LSD 12DF 5.02072 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE PH5 29/ 6/** 18: PAGE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE KQ GRAND MEAN (N= 18) NO OBS 18 66.890 STANDARD DEVIATION C OF V |CT SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 26.616 2.8222 4.2 0.0000 | | | | ðộ bền pH 5,5 BALANCED ANOVA FOR VARIATE KQ FILE PH55 29/ 6/** 18:39 PAGE VARIATE V003 KQ LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF SQUARES MEAN SQUARES Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp F RATIO PROB ER LN Page 73 ============================================================================= CT 7348.47 1049.78 622.83 0.000 * RESIDUAL 16 26.9679 1.68549 * TOTAL (CORRECTED) 23 7375.43 320.671 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE PH55 29/ 6/** 18:39 PAGE MEANS FOR EFFECT CT CT 10 15 20 NOS 3 3 3 3 KQ 100.000 98.1143 93.5203 86.7243 83.6507 80.5610 71.3803 42.0850 SE(N= 3) 0.749554 5%LSD 16DF 2.24718 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE PH55 29/ 6/** 18:39 PAGE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE KQ GRAND MEAN (N= 24) NO OBS 24 82.004 STANDARD DEVIATION C OF V |CT SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 17.907 1.2983 1.6 0.0000 | | | | ðộ bền pH BALANCED ANOVA FOR VARIATE KQ FILE PH6 29/ 6/** 18: PAGE VARIATE V003 KQ LN SOURCE OF VARIATION SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT 9593.74 1370.53 ****** 0.000 * RESIDUAL 16 12.8972 806075 * TOTAL (CORRECTED) 23 9606.63 417.680 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE PH6 29/ 6/** 18: PAGE MEANS FOR EFFECT CT CT 10 15 20 SE(N= 3) NOS 3 3 3 3 DF KQ 100.000 97.5450 90.8240 79.3953 77.6223 75.5910 62.2413 34.2210 0.518355 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 74 5%LSD 16DF 1.55404 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE PH6 29/ 6/** 18: PAGE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE KQ GRAND MEAN (N= 24) NO OBS 24 77.180 STANDARD DEVIATION C OF V |CT SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 20.437 0.89782 1.2 0.0000 | | | | ðộ bền pH 6,5 BALANCED ANOVA FOR VARIATE KQ FILE PH65 29/ 6/** 18:41 PAGE VARIATE V003 KQ LN SOURCE OF VARIATION SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT 13614.6 2269.10 ****** 0.000 * RESIDUAL 14 22.0554 1.57538 * TOTAL (CORRECTED) 20 13636.7 681.833 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE PH65 29/ 6/** 18:41 PAGE MEANS FOR EFFECT CT CT 10 15 NOS 3 3 3 DF KQ 100.000 94.5673 85.8097 69.6670 58.8607 45.3367 24.4990 SE(N= 3) 0.724657 5%LSD 14DF 2.19804 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE PH65 29/ 6/** 18:41 PAGE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE KQ GRAND MEAN (N= 21) NO OBS 21 68.391 STANDARD DEVIATION C OF V |CT SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 26.112 1.2551 1.8 0.0000 | | | | ðộ bền pH BALANCED ANOVA FOR VARIATE KQ FILE PH7 29/ 6/** 18: PAGE VARIATE V003 KQ Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 75 LN SOURCE OF VARIATION SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT 14408.5 2881.69 280.33 0.000 * RESIDUAL 12 123.354 10.2795 * TOTAL (CORRECTED) 17 14531.8 854.813 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE PH7 29/ 6/** 18: PAGE MEANS FOR EFFECT CT CT 10 NOS 3 3 3 DF KQ 100.000 90.7517 73.1803 54.8387 35.2807 21.4537 SE(N= 3) 1.85108 5%LSD 12DF 5.70381 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE PH7 29/ 6/** 18: PAGE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE KQ GRAND MEAN (N= 18) NO OBS 18 62.584 STANDARD DEVIATION C OF V |CT SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 29.237 3.2062 5.1 0.0000 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp | | | | Page 76 [...]... endochitinase và β-hexosaminidase tái tổ hợp 1.1 ðặt vấn ñề 1.2 Mục ñích - yêu cầu 1.2.1 Mục ñích Bước ñầu xây dựng quy trình sản xuất GlcNAc từ chitin sử dụng enzyme endochitinase và β-hexosaminidase tái tổ hợp 1.2.2 Yêu cầu - Nuôi cấy 02 chủng E.coli tái tổ hợp và xác ñịnh ñược mức ñộ biểu hiện của gen mã hóa cho endochitinase và β-hexosaminidase - Tinh sạch và xác ñịnh ñược ñặc tính thủy phân chitin. .. số nghiên cứu nhất ñịnh về ứng dụng chitinase ñể sản xuất GlcNAc Tuy nhiên, ở Việt Nam chưa có nghiên cứu nào ứng dụng endochitinase và β-hexosaminidase tái tổ hợp ñể sản xuất GlcNAc Chính vì lý do ñó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 1 tài: Nghiên cứu ñiều kiện thủy phân chitin, thu nhận N-acetyl-D-glucoamine sử dụng enzyme. .. dung nghiên cứu ðể thực hiện ñược mục tiêu của ñề tài ñặt ra, trong nghiên cứu này chúng tôi thực hiện những nội dung chính sau: - Nuôi cấy 02 chủng E.coli tái tổ hợp và xác ñịnh mức ñộ biểu hiện của gen mã hóa cho endochitinase và β-hexosaminidase - Tinh sạch và xác ñịnh hoạt tính riêng của endochitinase và βhexosaminidase tái tổ hợp - Nghiên cứu một số ñặc tính thủy phân colloidal chitin của endochitinase. .. ñạt ñược chúng tôi bước ñầu ñề xuất quy trình sản xuất GlcNAc sử dụng hai enzyme tái tổ hợp endochitinase và β-hexosaminidase 3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Nuôi cấy thu sinh khối tế bào Nuôi cấy thu sinh khối tế bào thu sinh khối theo phương pháp của Nguyễn và cộng sự (2012) 02 chủng tái tổ hợp E.coli chứa gene mã hóa cho endochitinase và β-hexosaminidase ñược nuôi cấy trong môi trường LB lỏng bổ... cứu của Phakapob Settthaketset và cộng sự (2008), sử dụng chitinase từ chủng nấm mốc Aspergillus sp kết hợp với β -chitin từ vỏ mực ñể ứng dụng cho thu nhận GlcNAc Sau 2 ngày thủy phân, pH4, nhiệt ñộ 45 0C lượng GlcNAc tạo ra là 65% [38] Phương pháp sử dụng hệ enzyme từ vi sinh vật trong sản xuất GlcNAc từ chitin ngày càng ñược sử dụng phổ biến và rộng rãi do có hiệu suất thu GlcNAc Học viện Nông nghiệp... cao, không gây ăn mòn thiết bị và thân thiện với môi trường [19] Kỹ thu t DNA tái tổ hợp ñóng vai trò then chốt của lĩnh vực Công nghệ sinh học Kỹ thu t này góp phần cải thiện hoạt tính và khả năng sinh tổng hợp enzyme ñang ñược ứng dụng rộng rãi Enzyme tái tổ hợp sẽ hạn chế ñược nhược ñiểm của enzyme thu nhận từ các chủng vi sinh vật tự nhiên như: mức ñộ biểu hiện của enzyme tự nhiên thường thấp, hoạt... của enzyme endochitinase từ chủng vi khuẩn E.coli tái tổ hợp chứa gene mã hóa cho endochitinase của Bacillus licheniformis DSM13 - Tinh sạch và xác ñịnh ñược ñặc tính thủy phân pNP-N-acetylglucosaminide của chủng vi khuẩn E.coli tái tổ hợp chứa gene mã hóa cho βhexosaminidase của Lactococus lactis ssp.lactis IL1403 - Phân tích ñược thành phần chitooligosaccharide và GlcNAc trong sản phẩm thủy phân. .. LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu 3.1.1 ðối tượng nghiên cứu ðể thực hiện ñề tài này, chúng tôi sử dụng hai chủng E.coli tái tổ hợp của phòng thí nghiệm công nghệ sinh học thực phẩm, Bộ môn Hóa sinh – Công nghệ sinh học thực phẩm, Khoa công nghệ thực phẩm, Học viện Nông nghiệp Việt Nam ñể nuôi cấy, thu nhận enzyme tái tổ hợp, ñó là: một chủng chứa gene mã hóa cho endochitinase từ... và cộng sự (2002) nghiên cứu sản xuất GlcNAc từ α -chitin bởi các enzyme thô từ Aeromonas hydrophila H2330 [43], hiệu suất GlcNAc thu ñược 77% trong thời gian 10 ngày Một nghiên cứu khác của Pichangkura và cộng sự (2002) sử dụng chitinase thô từ vi khuẩn Bacillus lichenifomis SK-1 thủy phân chitin ñể sản xuất GlcNAc, hiệu suất thu sản phẩm GlcNAc ñạt 41% [18] Một nghiên cứu của Kuk và cộng sự (2005)... mạch chitin Enzyme này có ở nhiều loài sinh vật: vi khuẩn, nguyên sinh ñộng vật, nấm, thực vật và ñộng vật [16] Dựa vào khả năng phân cắt, chitinase ñược chia thành 4 loại: endochitinase (mã số EC 3.2.1.14), exochitinase (EC 3.2.1.30), chitobiosidase, và chitobiase [49] 2.4.1 Khối lượng phân tử và cơ chế xúc tác của endochitinase Endochitinase tìm thấy ở thực vật bậc cao và tảo biển có trọng lượng phân