- Dựa trên các kết quả ựạt ựược chúng tôi bước ựầu ựề xuất quy trình sản xuất GlcNAc sử dụng hai enzyme tái tổ hợp endochitinase và βhexosaminidasẹ
3.3.3.Tinh sạch enzyme bằng hệ thống sắc ký lỏng FPLC
3.3.3.1. Nguyên tắc
Trong phương pháp này các chất mang trên cột chứa các nhóm hoá học có ái lực ựặc biệt với sản phẩm. Vì vậy khi cho một hỗn hợp các chất trong ựó có chứa sản phẩm ựi qua cột, sản phẩm mục tiêu ựược gắn một cách chuyên biệt vào chất mang và tất cả các thành phần khác không có ái lực với chất mang sẽ ựi qua cột nhờ một ựệm rửạ Sau ựó, sản phẩm sẽ ựược thu nhờ dung dịch ựẩy [16].
3.3.3.2. Tiến hành
Cột his-tag (dung tắch cột V = 5 ml), rửa bằng nước cất 2 lần ựể loại cồn. Cân bằng cột bằng dung dịch ựệm gắn kết (binding buffer) với tốc ựộ dòng là 0,5 ml/phút. Tiến hành bơm mẫu V = 5 ml với tốc ựộ dòng 0,3 ml/ phút vào cột. Sau khi mẫu ựược nạp vào cột hết thì tiếp tục chạy ựệm elution loại bỏ tạp chất (protein tạp, DNA, RNẠ..). Tiến hành ựẩy phần protein bám ra khỏi cột bằng dung dịch gradient NaCl 1M. Dịch ra khỏi cột ựược thu 5 ml/ựoạn, tốc ựộ dòng 1ml/phút.
Sinh khối tế bào ựược hòa trong 25 ml ựệm NaH2PO4 50 mM, pH 6, sau ựó phá vỡ tế bào bằng máy siêu âm (sonicator) chu kì 1 phút/lần phá và phá trong 3 lần, giữa mỗi lần nghỉ 30s, trong suốt quá trình dịch enzyme ựược ựặt trong ựá ựể tránh sự biến tắnh protein do nhiệt. Dịch thu ựược ựem ly tâm 16000 rpm ở 4oC trong 30 phút ựể loại xác tế bào và thu dịch enzyme thô.
Chúng tôi tiến hành tinh sạch endochitinase bằng sắc ký trên hệ thống sắc ký lỏng FPLC. Sử dụng cột his-tag 5 ml. Trước khi tinh sạch cột his-tag ựược rửa 2 lần bằng H2O lần ựể loại bỏ cồn. Cân bằng cột bằng dung dịch ựệm Na2HPO4 50 mM, pH 6 với tốc ựộ dòng là 0,5 ml/phút. Tiến hành bơm mẫu V = 5 ml với tốc ựộ dòng 0,3 ml/phút vào cột. Sau khi mẫu ựược nạp vào cột hết thì tiếp tục chạy ựệm NaH2PO4 50 mM, pH 6 loại bỏ tạp chất (protein tạp, DNA, RNẠ..). Tiến hành ựẩy phần protein bám ra khỏi cột bằng dung dịch gradient NaCl 1M + imidazol 500 mM. Dịch ra khỏi
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 26
cột ựược thu 5 ml/ựoạn, tốc ựộ dòng 1ml/phút. Enzyme sau khi tinh sạch ựược lọc qua màng lọc protein ựể loại imidazol và hòa tan trong ựệm NaH2PO4 50 mM, pH 6 với thể tắch 5 ml ựể thực hiện các nghiên cứu tiếp theo [32], [33].