- Dựa trên các kết quả ựạt ựược chúng tôi bước ựầu ựề xuất quy trình sản xuất GlcNAc sử dụng hai enzyme tái tổ hợp endochitinase và βhexosaminidasẹ
3.3.2.Xác ựịnh mức ựộ biểu hiện gene mã hóa cho endochitinase và β hexosaminidase bằng phương pháp ựiện di SDS-PAGE
hexosaminidase bằng phương pháp ựiện di SDS-PAGE
- Nguyên tắc: Gel polyacrylamide ựược sử dụng ựể ựiện di protein với nồng ựộ 12,5% theo phương pháp ựiện di biến tắnh. Nguyên lý của phương pháp là các phân tử protein trong môi trường có SDS bị duỗi thẳng và tắch ựiện âm, do vậy sẽ di chuyển về cực dương trong ựiện trường với tốc ựộ phụ thuộc vào khối lượng phân tử của chúng.
- Tiến hành: Bản gel ựược ựổ hai lớp, lớp dưới là lớp gel tách ựược ựổ cách mặt trên 1,5 cm, ựể ựông trong 30 phút, ựổ tiếp lớp gel cô ở trên rồi cài lược, ựể 30 phút cho gel ựông hoàn toàn và ổn ựịnh. Thành phần gel ựược mô tả trong bảng 3.2
Bảng 3.2. Thành phần gel cô và gel tách
Thành phần Gel tách (ộộộộl) Gel cô (ộộộộl)
H2O 1940 1180 Dung dịch A 1500 0 Dung dịch B 0 500 Dung dịch C 2500 300 Dung dịch D 60 20 APS 10% 24 10 TEMED 7 5 Tổng 6.031 2.015
Bản ựiện di ựược lắp vào hệ thống ựiện di và chạy với cường ựộ dòng ựiện 20 mA cho lớp gel cô và 30 mA cho lớp gel tách trong khoảng 2 giờ. Sau ựiện di bản gel ựược tách khỏi phiến kắnh rồi nhuộm bằng Coomassie Brilliant Blue trong 3 giờ và bản gel ựược tẩy bằng dung dịch tẩỵ Các protein xuất hiện các vạch băng.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 25
để xác ựịnh mức ựộ biểu hiện gene mã hóa cho enzyme endochitinase và β- hexosaminidase chúng tôi tiến hành ựịnh tắnh khả năng sinh enzyme của các chủng vi khuẩn Ẹcoli tái tổ hợp bằng phương pháp quan sát ựộ ựậm của các vạch protein sau khi nhuộm bằng Coomassie Brilliant Blue [34].