M: Hỗn hợp chitooligosaccharide chuẩn.
4.5. Xây dựng quy trình thủy phân chitin thu GlcNAc bằng cách kết hợp hai enzyme
enzyme
Từ các kết quả nghiên cứu trên chúng tôi ựề xuất quy trình sản xuất GlcNAc từ chitin sử dụng endochitinase và β-hexosaminidase như hình 4.15.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 49
Hình 4.15: Quy trình sản xuất GlcNAc từ chitin,
sử dụng enzyme endochitinase và β-hexosaminidase tái tổ hợp
Thuyết minh quy trình
- Nguyên liệu: Sử dụng chitin thương mại dạng bột mịn sản xuất trong nước hoặc nhập khẩu của nước ngoàị Sử dụng acid HCl và cồn 960 ựể tạo colloidal chitin. Chitooligosaccharides Colloidal chitin Nồng ựộ 20%, 50 0C, Sản phẩm: GlcNAc
Sinh khối tế bào endochitinase
Phá tế bào và tinh sạch endochtinase bằng 50% (NH4)2SO4
Endochtinase trong ựệm NaH2PO4, pH 6
Sinh khối tế bào β-hexosaminidase Phá vỡ, tinh sạch β-hexosaminidase bằng 60% (NH4)2SO4 Β-hexosaminidase trong ựệm NaH2PO4, pH 6 Chitooligosaccharides 37 0C Diệt endochitinase: 100 0C, 10 phút Diệt β-hexosaminidase: 100 0C, 10 phút Chitin
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 50
- Thủy phân colloidal chitin:
+ Nuôi cấy vi sinh vật thu sinh khối tế bào chứa endochitinase: Sử dụng giống vi sinh vật trên ựĩa thạch ựể hoạt hóa lần 1 trong môi trường LB có bổ sung ampicilin nồng ựộ cuối cùng 100 ộg/ml, nhiệt ựộ ở 37oC trong 16 giờ, sau ựược sử dụng làm giống ựể nuôi thu sinh khối tế bào trong môi trường LB, nhiệt ựộ 37oC, ampicillin 100ộg/ml, nhiệt ựộ nuôi 37oC, lắc 150 rpm, lượng giống tiếp 1%. Khi giá trị OD ựạt khoảng 0,4- 0,5, tiến hành bổ sung chất cảm ứng IPTG vào môi trường nuôi cấy với nồng ựộ cuối cùng là 0,4 mM. để cảm ứng gene biểu hiện enzyme, tế bào tiếp tục ựược nuôi cấy 16 giờ ở 25oC, lắc 150 rpm. Sau ựó, môi trường nuôi cấy ựược ly tâm 6000 rpm ở 4oC trong 15 phút ựể thu sinh khối tế bàọ
Sinh khối tế bào ựược rửa 2 lần bằng ựệm sodium phosphate 50 mM, pH 6 (NaH2PO4, 50 mM, pH 6). Sinh khối tế bào ựược phá vỡ ựể thu enzyme hoặc bảo quản ở -20oC. Sử dụng máy siêu âm (sonicater) ựể phá vỡ tế bào với chu kỳ phá: thời gian phá 1 chu kỳ: thời gian nghỉ giữa 2 chu kỳ = 3 lần: 1 phút: 30 giâỵ Tế bào ựược ựể trong nước ựá trong suốt quá trình phá, tránh bị biến tắnh do nhiệt. Sau khi phá tế bào tiến hành ly tâm 6000 rpm, 4 0C, 30 phút ựể thu dịch enzyme thô. Trước khi ựi tinh sạch cần kiểm tra hoạt tắnh của enzymẹ
+ Tinh sạch endochtinase: Tinh sạch endochitinase bằng muối (NH4)2SO4 với nồng ựộ 50% bão hòa, thời gian tinh sạch 3 giờ. Ly tâm 6000 rpm, 4 0C, 30 phút thu kết tủạ Enzyme ựược hòa trong ựệm NaH2PO4 50 mM, pH 6. Trước khi thủy phân colloidal chitin cần kiểm tra hoạt tắnh riêng của enzymẹ
+ Thủy phân colloidal chitin: Căn cứ vào hoạt tắnh riêng của enzyme sau tinh sạch, xác ựịnh ựược lượng enzyme thắch hợp ựể thủy phân dịch colloidal chitin. Môi trường thủy phân colloidal chitin ựược ựiều chỉnh ở pH 6, nhiệt ựộ 50 0C. Trong quá trình thủy phân, tiến hành khuấy ựể ựảm bảo cho enzyme hoạt ựộng hiệu quả. Sau ựó, phản ứng thủy phân ựược dừng lại bằng cách nâng nhiệt ựộ lên 100 0C, thời gian 10 phút ựể diệt endochitinasẹ
- Thủy phân chitooligosaccharides:
+ Nuôi cấy vi sinh vật thu tế bào và tinh sạch β-hexosaminidase: ựược thực hiện giống như nuôi vi sinh vật thu tế bào và tinh sạch endochitinase, chỉ khác là sử dụng muối (NH4)2SO4 nồng ựộ 60% bão hòa ựể tinh sạch enzymẹ
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 51
+ Thủy phân chitooligosaccharides: Căn cứ vào hoạt tắnh riêng của enzyme sau tinh sạch, xác ựịnh ựược lượng enzyme thắch hợp ựể thủy phân dịch chitooligosacharides. Môi trường thủy phân colloidal chitin ựược ựiều chỉnh ở pH 6, nhiệt ựộ 37 0C. Trong quá trình thủy phân, tiến hành khuấy ựể ựảm bảo cho enzyme hoạt ựộng hiệu quả..
- Thu nhận GlcNAc:
Trước khi kết thúc quá trình thủy phân của β-hexosaminidase tiến hành kiểm tra thành phần dịch chitooligosaccharides ựể quyết ựịnh kết thúc hoặc kéo dài thêm thời gian thủy phân. Dừng phản ứng thủy phân bằng cách nâng nhiệt ựộ lên 100 0C, thời gian 10 phút ựể diệt β-hexosaminidasẹ
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 52