VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Vật liệu
3.1.1. đối tượng nghiên cứu
để thực hiện ựề tài này, chúng tôi sử dụng hai chủng Ẹcoli tái tổ hợp của phòng thắ nghiệm công nghệ sinh học thực phẩm, Bộ môn Hóa sinh Ờ Công nghệ sinh học thực phẩm, Khoa công nghệ thực phẩm, Học viện Nông nghiệp Việt Nam ựể nuôi cấy, thu nhận enzyme tái tổ hợp, ựó là:một chủng chứa gene mã hóa cho endochitinasetừ Bacillus licheniformis DSM13 (nhóm nghiên cứu chưa công bố) và một chủng chứa gene mã hóa cho β-hexosaminidase từ Lactococcus lactis ssp.lactis
IL1403 [33].
3.1.2. địa ựiểm nghiên cứu
đề tài ựược thực hiện tại các phòng thắ nghiệm: Công nghệ sinh học thực phẩm, bộ môn Hóa sinh Ờ Công nghệ sinh học thực phẩm, khoa Công nghệ thực phẩm; phòng thắ nghiệm Công nghệ vi sinh, khoa Công nghệ sinh học và phòng thắ nghiệm Trung tâm, khoa Thú Y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
3.1.3. Thời gian nghiên cứu
Từ tháng 5/2013 ựến 7/2014.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 20
Bảng 3.1: Dụng cụ sử dụng nghiên cứu
Dụng cụ Mục ựắch sử dụng Xuất xứ
Bể ổn nhiệt (Water Bath JSWB 22T) Ổn nhiệt ựộ, dừng phản ứng enzyme Hàn Quốc
Cân phân tắch Cân hóa chất với ựộ chắnh xác cao Mỹ
Màng lọc protein Cô ựặc protein đức
Máy lắc ổn nhiệt (Eppendort
Thermomixer Comfot) Xác ựịnh hoạt tắnh enzyme đức
Máy li tâm (Herolab Hicen21C) Li tâm thu nhận enzyme đức
Máy li tâm (Mikro 2204 Hettich) Li tâm thu mẫu vòng quay nhỏ đức
Máy li tâm (Mini Spin plus) Li tâm eppendort tốc ựộ lớn đức
Máy khuấy từ (IKA RH basic 2) Khuấy ựều hóa chất, mẫu đức
Máy voltex (Maxit mix II) Làm ựều mẫu nghiên cứu, hóa chất Mỹ
Nồi hấp ALP Hấp khử trùng môi trường nuôi cấy
vi sinh vật, dụng cụ Nhật
Tủ nuôi cấy (Orbital incubator
Shaker gyromax TM 727) Nuôi cấy vi sinh vật Mỹ
Máy quang phổ (UV 1800) Xác ựịnh ựộ hấp thụ quang của mẫu Nhật
Máy ựo pH (Thermo Scientific) Xác ựịnh pH của mẫu hóa chất Singapore
Tủ cấy Air stream CESCO Cấy vi sinh vật vào môi trường Singapore
Tủ sấy Memmert Sấy khô dụng cụ Mỹ
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 21 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hóa chất Mục ựắch sử dụng Xuất xứ
Cao nấm men Nuôi cấy vi sinh vật Trung Quốc
Pepton Nuôi cấy vi sinh vật Trung Quốc
NaCl Nuôi cấy vi sinh vật Trung Quốc
NaH2PO4 Pha đ ựệm sodium phosphate Trung Quốc
Coloidal chitin Cơ chất của endochitinase Việt Nam
pNP-NPG Cơ chất của N-acetyl-β-D-
hexosaminidase
Mỹ
acid 3,5-dinitrosalicylic (DNS) Pha đ nhuộm màu ựường khử Trung Quốc
NaOH Pha đ nhuộm màu ựường khử
Pha dung dịch chuẩn ựộ pH
Trung Quốc KNa tartatẹ4H2O
(C4H4KNạ4H2O)
Pha đ nhuộm màu ựường khử Trung Quốc
Phenol Pha đ nhuộm màu ựường khử Trung Quốc
Na-disulfit (Na2S2O5) Pha đ nhuộm màu ựường khử Trung Quốc
HCl Pha dung dịch chuẩn ựộ pH Trung Quốc
Ethanol 96% Khử trùng thiết bị Trung Quốc
Ethanol 99.5% Pha đ thuốc nhuộm protein Trung Quốc
Acid phosphoric Pha đ thuốc nhuộm protein Trung Quốc
Coomasie brilliant blue Pha đ thuốc nhuộm protein Trung Quốc
Albumin Xây dựng ựường chuẩn protein Trung Quốc
Acid acetic Pha ựệm Britton-Robinson Trung Quốc
Acid boric Pha ựệm Britton-Robinson Trung Quốc
Ampicillin Bổ sung vào môi trường nuôi cấy đức
Chất cảm ứng IPTG Kắch thắch sinh enzyme đức
Và một số dụng cụ dùng trong phòng thắ nghiệm: Micropipette, bình tam giác, ống ựong, cốc ựong, ống nghiệm, ống falcon, ống eppendorf, ựèn cồn.
* Môi trường LB nuôi cấy hai chủng Ẹcoli tái tổ hợp
Môi trường LB lỏng (g/l): Cao nấm men: 10 Pepton: 5 NaCl: 5 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 22
Nước cất vừa ựủ - 1lắt; pH= 6,0; khử trùng 121οC/15 phút.
* Dung dịch ựệm sodium phosphat 0,05M, pH 6: Trộn 87,7 ml dung dịch NaH2PO4 0,05M với 12,3 ml dung dịch Na2HPO4 0,05M, thêm 100ml nước cất, ựo lại pH bằng máy ựo pH [2].
* Dung dịch DNS: Cân 10 g 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic (DNS), cho vào cốc 1000ml, thêm khoảng 400ml nước cất, ựặt cốc lên máy khuấy từ. Thêm dung dịch NaOH (16 g NaOH trong 150ml nước cất) từ từ vào dung dịch DNS, duy trì khuấy ở 60 0C. Tiếp tục thêm 300 g muối K-Na tactrat vào cốc, sau ựó thêm 2 g phenol, tiếp tục khuấy ựến khi dung dịch ựồng nhất hoàn toàn. Làm lạnh dung dịch DNS ựến nhiệt ựộ phòng. Chuyển dung dịch vào bình ựịnh mức 1000ml, thêm nước cất ựến vạch và lắc ựềụ Bảo quản dung dịch DNS trong chai màu nâu có nắp [2].
* Dung dịch ựệm Britton-Robinson: Pha 300 ml dung dịch ựệm Britton-Robinson gồm: 100 ml dung dịch H3BO3 0,04 M, 100 ml dung dịch CH3COOH 0,04 M, 100 ml dung dịch H3PO4 0,04 M. điều chỉnh pH của dung dịch từ pH 2 ựến pH10 bằng dung dịch NaOH 1M [33].
* Hóa chất dùng trong chạy ựiện di SDS-PAGE
Dung dịch A: đệm Tris-HCl 1,5 M, pH 8,8
Dung dịch B: đệm Tris-HCl 0,5 M, pH 6,8
Dung dịch C: Acrylamide 30%, bis-acrylamide 0,8%
Dung dịch D: SDS 10%
Dung dịch APS: Ammonium persulfate 10%
Dung dịch nhuộm PAGE: Coomassie brilliant blue 0,1%, methanol 30% (v/v), acid acetic 10%
Dung dịch tẩy PAGE: Methanol 30% (v/v), acid acetic 10% (v/v)
đệm ựiện di protein: Tris-HCl 20 mM, glycine 192 mM, SDS 0,1%, pH 8,8
đệm 5x tra mẫu protein: Brommophenol blue 0,05%, glycerol 50% pha trong ựệm Tris-HCl 1 M, pH 6,8
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 23
3.2. Nội dung nghiên cứu
để thực hiện ựược mục tiêu của ựề tài ựặt ra, trong nghiên cứu này chúng tôi thực hiện những nội dung chắnh sau:
- Nuôi cấy 02 chủng Ẹcoli tái tổ hợp và xác ựịnh mức ựộ biểu hiện của gen mã hóa cho endochitinase và β-hexosaminidasẹ
- Tinh sạch và xác ựịnh hoạt tắnh riêng của endochitinase và β- hexosaminidase tái tổ hợp.
- Nghiên cứu một số ựặc tắnh thủy phân colloidal chitin của endochitinase và thủy phân pNP-N-acetyl-glucosaminide của β-hexosaminidase:
+ Ảnh hưởng của nhiệt ựộ ựến hoạt tắnh của endochitinase và β- hexosaminidase: Nhiệt ựộ tối ưu, ựộ bền nhiệt.
+ Ảnh hưởng của pH ựến hoạt tắnh của endochitinase và β-hexosaminidase: pH tối ưu, ựộ bền pH.
- Phân tắch thành phần chitooligosaccharide và GlcNAc trong sản phẩm thủy phân.