Nghiên cứu điều kiện thủy phân rong lục bằng chế phẩm enzyme thô thu được từ vi sinh vật

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - HÀ THỊ NHÃ PHƢƠNG NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN THỦY PHÂN RONG LỤC BẰNG CHẾ PHẨM ENZYM THÔ THU ĐƢỢC TỪ VI SINH VẬT Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Mã đề tài: CNTP13B-14 LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGUYỄN THANH HẰNG Hà Nội - 2015 LỜI CAM ĐOAN Học viên: Hà Thị Nhã Phƣơng Nơi đào tạo: Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm Người hướng dẫn : PGS TS Nguyễn Thanh Hằng Tên luận văn: Nghiên cứu điều kiện thủy phân rong lục chế phẩm enzym thô thu từ vi sinh vật Nội dung cam đoan: Tơi xin cam đoan, suốt q trình nghiên cứu luận văn thạc sĩ, hướng dẫn bảo tận tình giáo viên hướng dẫn, tơi tiến hành nghiên cứu luận văn cách trung thực, toàn nội dung báo cáo luận văn trực tiếp thực Tất nghiên cứu không chép từ báo cáo khoa học, luận văn tiến sĩ, thạc sĩ hay sách tác giả Học viên Hà Thị Nhã Phƣơng ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS Nguyễn Thanh Hằng tận tình trực tiếp hướng dẫn giúp đỡ tơi suốt q trình thực đề tài Tôi xin trân trọng cảm ơn thầy giáo, cô giáo Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, tạo điều kiện giúp đỡ suốt khóa học thời gian tơi thực đề tài Tôi xin trân trọng cảm ơn Trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội tạo điều kiện cho học tập nghiên cứu suốt q trình học uối c ng, tơi muốn ày t ng cảm ơn gi đ nh, ạn , đ ng nghiệp động vi n, giúp đỡ hoàn thành uận v n Học viên Hà Thị Nhã Phƣơng iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ii LỜI CẢM ƠN iii MỤC LỤC iv DANH MỤC BIỂU ĐỒ vii MỞ ĐẦU Chƣơng I: TỔNG QUAN 1.1 Sự phát triển ethanol nhiên liệu từ nguyên liệu rong biển 1.1.1.Tình hình nghiên cứu sản xuất ethanol nhiên liệu từ rong biển giới 1.1.2 Triển vọng phát triển nhiên liệu sinh học Việt Nam 1.2 Nguyên liệu sản xuất ethanol từ rong biển 1.2.1 Thành phần hóa học loại rong biển 1.2.2 Tiềm từ nguồn nguyên liệu rong biển 10 1.3 Công nghệ sản xuất ethanol từ rong biển 12 1.3.1 Sơ đồ công nghệ sản xuất ethanol từ rong biển 12 1.3.2 Quá trình xử lý nguyên liệu 13 1.3.3 Quá trình thủy phân rong biển 13 1.3.4 Quá trình lên men dịch thủy phân rong biển 19 Chƣơng II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Vật liệu 21 2.1.1 Sinh khối rong Lục 21 2.1.2 Vi sinh vật sinh enzyme thủy phân rong Lục 21 2.1.3 Hoá chất 22 2.1.4 Thiết bị 23 2.2 Phƣơng pháp phân tích 23 2.2.1 Xác định hàm lượng polysaccharid thô từ sinh khối rong Lục 23 iv 2.2.2 Xác định tinh bột thô 24 2.2.3 Xác định Ulvan thô 25 2.2.4 Xác định hoạt độ chế phẩm enzyme 25 2.2.5 Xác định đường khử theo phương pháp Somogyi – Nelson 26 2.2.6 Xác định hàm lượng carbohydrat hòa tan dịch rong Lục thủy phân phương pháp Dubois 27 2.2.7 Phương pháp toán học 28 2.2.8 Thống kê số liệu 29 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 30 2.3.1 Phương pháp nuôi cấy t hợp bốn chủng vi sinh vật thu nhận enzyme thô từ chất rong Lục 30 2.3.2 Tiền xử lý 30 2.3.3 Thủy phân enzyme 30 Chƣơng III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 31 3.1 Thành phần polysaccharid rong Lục 32 3.2 Sản xuất xác định hoạt độ enzym chế phẩm vi sinh vật 33 3.2.1 Giải thích sơ đồ 33 3.2.2 Xác định hoạt độ chế phẩm enzyme thô 35 3.3 Khảo sát trình thủy phân sinh khối rong Lục từ enzyme vi sinh vật 36 3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng pH đến trình thủy phân rong Lục 36 3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến trình thủy phân rong Lục 37 3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng thời gian đến trình thủy phân rong Lục 37 3.4 Tối ƣu hóa điều kiện thủy phân rong lục để thu nhận dịch thủy phân có hàm lƣợng đƣờng cao 38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 PHỤ LỤC 48 v DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các công ty tham gia sản xuất nhiên liệu sinh học từ rong biển [12] Bảng 1.2 Thành phần hóa học loại rong biển [17] Bảng 1.3 Diện tích ni sản lượng rong biển thời điểm khảo sát (2009) dự kiến đến năm 2015 [20] 10 Bảng 1.4 So sánh suất nuôi trồng nguồn sinh khối 11 Bảng 1.5 Thành phần hóa học rong biển đường tạo thành thủy phân loài rong biển [17] .14 Bảng 1.6 Bảng yếu tố ảnh hưởng đến trình thủy phân axit 18 Bảng 1.7 Bảng yếu tố ảnh hưởng đến trình thủy phân enzyme 18 Bảng 3.1 Thành phần polysaccharid rong Lục .32 Bảng 3.2 Hoạt độ chế phẩm enzyme vi sinh vật thủy phân loại polysaccharid 36 Bảng 3.3 Ma trận thực nghiệm 39 Bảng 3.4 Kết mơ hình hồi quy tuyến tính excel .40 Bảng 3.5 Kết tính bước chuyển động (∆j) yếu tố 41 Bảng 3.6 Tối ưu hóa điều kiện thủy phân rong theo Box-wilson 42 vi DANH MỤC BIỂU ĐỒ Hình 1.1 Sơ đồ công nghệ sản xuất ethanol từ rong biển 12 Hình 2.1 Chế phẩm sinh học TRICHOMIX-DT … 22 Hình 2.2 Quy trình xử lý nguyên liệu thủy phân rong biển enzyme 31 Hình 3.1 Sơ đồ sản xuất chế phẩm enzym từ nuôi cấy chủng vi sinh vật …….33 Hình 3.2 Canh trường ni cấy vi sinh chế phẩm enzyme thu 35 Hình 3.3 Ảnh hưởng pH đến trình thủy phân .36 Hình 3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ đến trình thủy phân .37 Hình 3.5 Ảnh hưởng thời gian đến trình thủy phân 38 vii MỞ ĐẦU Kể từ cách mạng công nghiệp giới, nhu cầu lượng giới ngày tăng đáp ứng chủ yếu nguồn nhiên liệu hóa thạch than, dầu khí tự nhiên Tuy nhiên, nhu cầu lượng không ngừng tăng nhanh nguồn tài nguyên nhiên liệu hóa thạch cạn kiệt trữ lượng có hạn mà tăng trưởng nhanh chóng kinh tế có thu nhập thấp, trung bình ngày lớn Mặt khác dân số giới ngày tăng lên, dự kiến lượng tiêu thụ khí đốt, than đá, dầu tăng lên 26% 20 năm Ngồi ra, vấn đề mơi trường kinh tế gặp phải nhiều thách thức liên quan đến việc sử dụng tài nguyên nhiên liệu hóa thạch, bao gồm hiệu ứng nhà kính, nóng lên tồn cầu, rút xuống sông băng, mực nước biển dâng, đa dạng sinh học, dầu thô tăng giá dầu, an ninh lượng Tất yếu tố nhấn mạnh cần thiết phải thay nguồn nhiên liệu hóa thạch nguồn nhiên liệu khác có hiệu kinh tế sử dụng cao có khả phục hồi Nhiên liệu sinh học thay tuyệt vời cho nguồn lượng từ nhiên liệu hóa thạch truyền thống, chúng sản xuất từ nguồn cung sinh khối tái tạo dồi Trong đó, ethanol nhiên liệu sinh học giải pháp ưu tiên sách lượng nhiều nước giới Nhiên liệu sinh học ethanol độc hại, phân hủy tạo chất gây nhiễm so với nhiên liệu dầu khí Các nguồn nguyên liệu nghiên cứu sản xuất ethanol bao gồm loại lương thực, đường mía, lignocellulose từ gỗ, phụ phẩm nông nghiệp… Tuy nhiên nguồn nguyên liệu gây tác động không tốt đến an ninh lương thực, kỹ thuật sản xuất, môi trường sản xuất Do vậy, rong tảo biển đối tượng giới quan tâm lĩnh vực sản xuất ethanol nhiên liệu sinh học Việt Nam nước nằm vùng nhiệt đới gió mùa Đơng Nam châu Á với hệ thống sông suối dày đặc với 3260km bờ biển, 3000 đảo quần đảo, với hệ sinh thái điển hình vùng nước thềm lục địa rộng lớn rạn san hô, rừng ngập mặn, chuỗi đầm phá ven biển hệ cửa sông… chúng nơi sinh sống phát triển hàng vạn lồi thủy sinh vật, có rong tảo biển Rong tảo biển nguồn sinh khối tự nhiên đa dạng chủng loại, phong phú sản lượng Thành phần rong tảo biển có hàm lượng polysacchrid cao, có khả thủy phân thành dạng đường đơn, nguồn chất quan trọng cho vi sinh vật thực trình lên men sản xuất nhiên liệu sinh học Bên cạnh đó, rong biển khơng có lignin, xem rong tảo biển vật liệu dễ phân giải thành glucose thực vật cạn, đặc biệt hàm lượng carbonhydrate số loài rong cao từ 40% - 79,4% (Gelidium amansi) hiệu suất chuyển hóa trình lên men ethanol khoảng 70% Mặt khác, rong biển có sản lượng tự nhiên lớn, vịng đời sinh trưởng ngắn, khả sinh sản sinh trưởng nhanh, phát triển loạt môi trường bao gồm nước ngọt, nước mặn, nước thải đô thị mà không cạnh tranh với đất nông nghiệp; không cần phân bón, khơng gây nhiễm mơi trường; chi phí sản xuất thấp, dễ thu hoạch… Với nhiều ưu điểm vậy, nay, rong biển biết đến nguồn nguyên liệu tiềm để sản suất ethanol nhiên liệu sinh học hệ thứ Trong công nghệ sản xuất ethanol nhiên liệu từ rong biển, q trình thủy phân rong biển đóng vai trò quan trọng nhằm tạo sản phẩm để tiến hành lên men tạo ethanol Do đó, tiến hành đề tài “Nghiên cứu điều kiện thủy phân rong Lục chế phẩm enzym thô thu từ vi sinh vật” để ứng dụng sản xuất cồn nhiên liệu Mục đích: Nghiên cứu điều kiện thủy phân rong Lục chế phẩm enzym thô thu từ chủng vi sinh vật Đối tƣợng nghiên cứu: Rong lục Chaetomorpha sp Phạm vi nghiên cứu: Xác định thông số công nghệ thủy phân rong Lục chế phẩm enzym thô thu từ chủng vi sinh vật Ý nghĩa khoa học đề tài Góp phần tìm nguồn ngun liệu thay cho nguồn nguyên liệu ph biến sản xuất bioethanol ảnh hưởng đến an ninh lương thực chất đốt Giải vấn đề kỹ thuật sản xuất ethanol nhiên liệu từ rong Lục Chƣơng I TỔNG QUAN 1.1 Sự phát triển ethanol nhiên liệu từ nguyên liệu rong biển 1.1.1 Tình hình nghiên cứu sản xuất ethanol nhiên liệu từ rong biển giới Trên giới, tình hình nghiên cứu sản xuất ethanol từ nguyên liệu rong biển nhiều nước quan tâm Brazil nước xây dựng nhà máy sản xuất nhiên liệu sinh học từ rong biển giới vào cuối năm 2013 Bên cạnh đó, số nước có dự án phát triển rong biển cơng nghiệp Tại Nhật, dự án Sunrise [7] sản xuất bioethanol từ rong biển Sargassum ni trồng ngồi biển Nhật Bản Kế hoạch họ bắt đầu vào năm 2012, phát triển công nghệ nuôi rong biển vào năm 2016, thiết lập quy trình sản xuất khoảng năm 2020 Nhật Bản bắt đầu triển khai từ tháng 3/2007, theo họ sử dụng t ng cộng 10.000km2 mặt nước để trồng loài rong mơ Sargassum hondawara nhằm sản xuất năm 20 triệu mét khối bioethanol, nghĩa tương đương với 1/3 nhu cầu tiêu thụ nhiên liệu nước Tại Na Uy, dự án sản xuất ethanol sản phẩm Lipids, Proteins, Iodine từ rong biển theo quỹ tài trợ BAL’s R&D cuối năm 2010 Tại Hàn Quốc, dự án 275 triệu USD 10 năm để sản xuất 400 triệu gallon vào năm 2020 xấp xỉ 13% nhu cầu tiêu thụ nước Dự án nuôi trồng rong biển diện tích 8.600 Đầu tháng 11/2008 dự án hợp tác ký Hàn Quốc Indonesia nhằm trồng rong đảo Maluku, Belitung Lombok để sản xuất biodiesel theo công nghệ Italia [12] Tương tự, dự án phủ Philippin Viện Kỹ thuật công nghệ Hàn Quốc, đầu tư triệu USD để trồng 250 acre rong biển sản xuất ethanol từ công nghệ Hàn Quốc Theo kết phụ lục hình 3.3 ta thấy hàm lượng carbohydrat hòa tan sau thủy phân biến động theo mức pH Hàm lượng carbohydrat hòa tan tăng dần pH tăng dần khoảng pH = 4,0 – 5,0, sau giảm dần pH tăng từ 5,0 – 5,5 Tại pH = 5,0 cho hàm lượng lượng carbohydrat hòa tan sau thủy phân đạt lớn 12,20 ± 0,04 mg/ml 3.3.2 Khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ đến trình thủy phân rong Lục Chúng tiến hành khảo sát nhiệt độ thủy phân điều kiện cố định ba yếu tố pH = 5,0, thời gian 36 giờ, nồng độ enzyme ml/g Kết thể phụ lục hình 3.4 Hình 3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ đến trình thủy phân Theo kết phụ lục hình 3.4 ta thấy hàm lượng carbohydrat hòa tan sau thủy phân tăng dần nhiệt độ tăng Tại to = 45oC hàm lượng lượng carbohydrat hòa tan sau thủy phân đạt lớn 12,02 ± 0,19 mg/ml Tuy nhiên tiếp tục tăng nhiệt độ 45oC hàm lượng lượng carbohydrat hịa tan giảm dần 3.3.3 Khảo sát ảnh hƣởng thời gian đến q trình thủy phân rong Lục Chúng tơi tiến hành khảo sát thời gian thủy phân điều kiện cố định ba yếu tố pH = 5,0, nhiệt độ 45oC, nồng độ enzyme ml/g Kết thể phụ lục hình 3.5 37 Hình 3.5 Ảnh hưởng thời gian đến trình thủy phân Theo kết phụ lục hình 3.5 ta thấy hàm lượng carbohydrat hịa tan tăng dần theo thời gian thủy phân, nhiên từ 30h trở hàm lượng lượng carbohydrat hịa tan tăng chậm Hàm lượng lượng carbohydrat hòa tan sau thủy phân 36h 12,17 ± 0,18 mg/ml 3.4 Tối ƣu hóa điều kiện thủy phân rong lục để thu nhận dịch thủy phân có hàm lƣợng đƣờng cao Sau tiến hành thí nghiệm thăm dị, chúng tơi chọn yếu tố thời gian nhiệt độ pH để tối ưu hóa điều kiện thủy phân rong Lục chế phẩm enzyme nhờ phương pháp quy hoạch hóa thực nghiệm Khoảng xác định yếu tố sau: Các biến số Thời gian: X1 [24-40] Nhiệt độ: X2 [40-50] Đơn vị Giờ o C pH Các khoảng cách gi a biến số 0,5 [4.5-5.5] 38 Mức thí nghiệm: Mức thí nghiệm X1 X2 X3 Mức gốc 32 45 Khoảng biến đ i 0,5 Mức 24 40 4,5 Mức 40 50 5,5 Chỉ tiêu cần tối ưu: hàm lượng carbonhydrat hòa tan dịch thủy phân có y  max Ma trận thực nghiệm thiết lập theo phương pháp yếu tố đầy đủ với số thí nghiệm N = 2k = 23 = N: số thí nghiệm số mức thí nghiệm số yếu tố ảnh hưởng - Lập ma trận thực nghiệm: Dùng 24 bình tam giác 50ml, cân cho vào bình 5g ngun liệu có độ ẩm 13% B sung vào bình 50ml dung dịch 0,3% acid H2SO4 Dùng que thủy tinh trộn nút bình bơng khơng thấm nước hấp tiền xử lý 121oC 15 phút Hấp xong để nguội b sung nồng độ enzyme theo tỷ lệ ml/1g nguyên liệu Các bình tam giác giữ điều kiện nhiệt độ 40 500C pH= 4,5 5,5 Sau 24 40 mang xác định hàm lượng carbonhydrat dịch thủy phân Bảng 3.3 Ma trận thực nghiệm Stn X1 -1 -1 -1 -1 X2 -1 -1 1 -1 -1 X3 -1 -1 -1 -1 1 Y1 10,6 11,2 11,4 12,2 10,8 12,1 11,6 39 Y2 10,7 11,3 11,5 12,4 11,1 12,3 11,5 Y3 10,8 11,1 11,3 12,3 10,8 11,9 11,1 Y 10,7 11,2 11,4 12,3 10,9 12,1 11,4 1 12,3 12,2 12,1 12,2 Bảng 3.4 Kết mơ hình hồi quy tuyến tính excel Mơ hình hồi quy tuyến tính Các thơng số mơ hình hồi quy Giá trị Biểu giá trị (0 0,9) tin cậy cao Do phương trình lập chuẩn cho số phân tích Phụ lục Phổ màu dịch đường chuẩn mẫu thí nghiệm xác định theo phương pháp Dubois 49 Phụ lục Các mức nồng độ đường glucose pha loãng giá trị OD tương ứng đo bước sóng 620 nm Nồng độ dung dịch Giá trị đo OD (620 nm) Glucose chuẩn (µg/ml) Lần Lần Lần Trung bình 0 0 20 0,130 0,132 0,141 0,134 40 0,342 0,345 0,348 0,345 60 0,537 0,541 0,547 0,542 80 0,780 0,786 0,791 0,786 100 0,948 0,952 0,960 0,953 Phụ lục Lập biểu đồ đường chuẩn từ kết đo mẫu chuẩn xác định theo phương pháp Dubois Sử dụng phần mềm Excel ta lập phương trình đường chuẩn Y = 0,009X + 0,0067 (R2 = 0,9971) Phương trình đường chuẩn có hệ số R (1> R> 0,9) tin cậy cao Do phương trình lập chuẩn cho số phân tích 50 Phụ lục Ảnh hưởng pH đến trình thủy phân Hàm lƣợng carbonhydrat hịa tan (mg/ml) Lần đo Trung Độ lệch bình chuẩn 10,98 11,16 0,17 11,44 11,36 11,40 0,12 12,24 12,16 12,20 12,20 0,14 11,84 11,80 11,82 11,82 0,12 pH 4,0 11,31 11,18 pH 4,5 11,60 pH 5,0 pH 5,5 pH Phụ lục Ảnh hưởng nhiệt độ đến q trình thủy phân Hàm lƣợng carbonhydrat hịa tan (mg/ml) Lần đo Trung Độ lệch bình chuẩn 4,04 4,00 0,04 8,29 8,40 8,27 0,15 11,91 12,09 12,24 12,08 0,17 45oC 12,40 12,53 12,78 12,57 0,19 50oC 11,96 12,07 12,20 12,07 0,12 30oC 3,96 35oC 8,11 40oC Nhiệt độ Phụ lục Ảnh hưởng thời gian đến q trình thủy phân Hàm lƣợng carbonhydrat hịa tan (mg/ml) Lần đo Trung Độ lệch bình chuẩn 6,93 6,73 0,19 10,73 10,87 10,72 0,16 10,89 11,02 11,16 11,02 0,13 36 h 11,98 12,18 12,33 12,16 0,18 40h 12,32 12,18 12,28 12,26 0,16 12 h 6,56 6,69 24 h 10,56 30 h Thời gian 51 ... vật? ?? để ứng dụng sản xuất cồn nhiên liệu Mục đích: Nghiên cứu điều kiện thủy phân rong Lục chế phẩm enzym thô thu từ chủng vi sinh vật Đối tƣợng nghiên cứu: Rong lục Chaetomorpha sp Phạm vi nghiên. .. hiệu suất thủy phân 21.6% Kiến nghị • Với kết bước đầu khảo sát điều kiện thủy phân rong lục chế phẩm enzyme thô thu từ chủng vi sinh vật cho thấy khả sử dụng enzyme thu thủy phân rong Lục ứng... rong Lục chế phẩm enzym thô từ chủng vi sinh vật? ??, thu số kết sau: - Đã sản xuất chế phẩm enzyme thu từ chủng vi sinh vật có hoạt độ 4,04 U/1 ml - Đã khảo sát điều kiện thích hợp để thủy phân rong