Nghiên cứu tối ưu hoá các điều kiện để tách và xác định một số axit amin trong thực phẩm bằng sắc khí lỏng hiệu năng cao HPLC

MỤC LỤC Trang Mở đầu Chương Tổng quan 1.1 Giới thiệu protein axít amin 1.2 Định nghĩa cấu trúc axít amin 13 1.3 Tính chất hóa lý protein axít amin 14 1.4 Tổng quan phương pháp định lượng protein axít amin 17 Chương Nội dung phương pháp nghiên cứu 29 2.1 Nội dung mục tiêu nghiên cứu 30 2.2 Phương pháp nghiên cứu 31 2.3 Thiết bị, dụng cụ hóa chất thuốc thử sử dụng 42 2.4 Phương pháp thu thập mẫu thực phẩm để phân tích 44 46 Chương 3.Kết thảo luận 3.1 Khảo sát chọn loại chất dẫn xuất cho axít amin 47 3.2 Tối ưu hóa điều kiện tách xác định axít amin HPLC 49 3.3 Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng xây dựng đường chuẩn phương pháp phân tích 62 3.4 Tối ưu hóa điều kiện thủy phân mẫu 69 3.5 Lược đồ quy trình phân tích mẫu thực phẩm 84 3.6 Đánh giá thống kê phương pháp phân tích 87 3.7 Phân tích mẫu thực tế Kết luận Danh mục cơng trình tác giả Tài liệu tham khảo Phụ lục Phục lục Phục lục Phục lục 103 133 114 116 125 127 128 133 DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT Viết tắt Tên đầy đủ ACN Acetonitril Ala Alanin AQC Aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamat Arg Arginin Asp Axít Aspartic Cys Cystin FMOC 9-florenylmethylcloroformat GC Sắc ký khí Glu Axít Glutamic Gly Glycin His Histidin HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao Ile Isoleucin KPH Không phát (dưới ngưỡng phát phương pháp) Leu Leucin Lys Lysin Met Methionin Ninhydrin Tricetohydrinđen hydrat OPA Ortho-phthalaldehyd / ortho-phthaldialdehyd Phe Phenylalanin PITC Phenyl isothiocyanat Pro Prolin RP-HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao pha ngược Ser Serin Thr Threonin Tyr Tyrosin Val Valin DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1: Trị số ước lượng lượng địi hỏi axít amin cần thiết 11 Bảng 1.2: Đối chiếu loại axít amin thiết yếu 12 Bảng 1.3: Tổng hợp chất dẫn xuất xác định axít amin RP-HPLC [76] 27 Bảng 3.1: ảnh hưởng pha động đến thời gian lưu axít amin 55 Bảng 3.2: Thành phần tỷ lệ pha động theo chế độ gradient 57 Bảng 3.3: ảnh hưởng nồng độ trietylamin pha động đến thời gian lưu 57 Bảng 3.4: Các điều kiện đo RP-HPLC cho xác định axít amin 61 Bảng 3.5: Tỷ lệ thành phần pha động 62 Bảng 3.6: Giới hạn phát axít amin 64 Bảng 3.7: Giới hạn phát giới hạn định lượng phương pháp 65 Bảng 3.8: Sự phụ thuộc chiều cao píc sắc ký vào nồng độ axít amin 67 Bảng 3.9: ảnh hưởng môi trường đến hiệu suất thủy phân axít amin 70 Bảng 3.10: ảnh hưởng nồng độ HCl đến hiệu suất thu hồi axít amin 71 Bảng 3.11: ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất axít amin 73 Bảng 3.12: ảnh hưởng thời gian thủy phân đến hiệu suất thu hồi 75 Bảng 3.13: Sự phụ thuộc hiệu suất dẫn xuất axít amin vào pH mơi trường 80 Bảng 3.14: Sự phụ thuộc hiệu suất thu hồi vào nhiệt độ tạo dẫn xuất huỳnh quang 82 Bảng 3.15: Sự phụ thuộc hiệu suất axít amin vào thời gian dẫn xuất 83 Bảng 3.16: Độ phương pháp nồng độ thứ (150 - 30ppb) 88 Bảng 3.17: Độ phương pháp nồng độ thứ (790 - 80ppb) 89 Bảng 3.18: Độ phương pháp nồng độ thứ (1490 - 150 ppb) 89 Bảng 3.19: Độ lặp lại (n = 6) hàm lượng axít amin mẫu cá 91 Bảng 3.20: Độ lặp lại (n = 6) thời gian lưu axít amin mẫu cá 92 Bảng 3.21: Độ lặp lại (n = 6) hàm lượng axít amin mẫu cá thu 93 Bảng 3.22: Độ lặp lại (n = 6) thời gian lưu axít amin mẫu cá thu 93 Bảng 3.23: Độ lặp lại (n = 6) hàm lượng axít amin mẫu hạt đậu 94 Bảng 3.24: Độ lặp lại (n = 6) thời gian lưu axít amin mẫu đậu tương 95 Bảng 3.25: Độ lặp lại (n = 6) hàm lượng axít amin mẫu đậu phụ 96 Bảng 3.26: Độ lặp lại (n = 6) thời gian lưu axít amin mẫu đậu phụ 97 Bảng 3.27: Độ lặp lại (n = 6) hàm lượng axít amin mẫu sữa đậu nành 97 Bảng 3.28: Độ lặp lại (n = 6) thời gian lưu axít amin mẫu sữa đậu nành 98 Bảng 3.29: Độ thu hồi nồng độ thứ 100 Bảng 3.30: Độ thu hồi nồng độ thứ hai 101 Bảng 3.31: Độ thu hồi nồng độ thứ ba 102 Bảng 3.32: Hàm lượng axít amin cá nước (g/100g) 104 Bảng 3.33: Hàm lượng axít amin cá nước mặn (g/100g) 105 Bảng 3.34: Hàm lượng trung bình axít amin mẫu hạt đậu tương 109 Bảng 3.35: Hàm lượng trung bình axít amin mẫu đậu phụ 110 Bảng 3.36: Hàm lượng trung bình axít amin mẫu sữa đậu nành 111 Bảng 3.37: Hàm lượng axít amin số loại thịt (g/100g) 114 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Trang Hình 2.1: Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC 32 Hình 2.2: Sắc đồ chất 32 Hình 2.3 Tính bất đối píc 34 Hình 3.1: Sắc đồ tách axít amin dẫn xuất OPA trước cột, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 5m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 340; em = 455) 47 Hình 3.2: Sắc đồ tách axít amin dẫn xuất AQC trước cột, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395) 47 Hình 3.3: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axít amin nồng độ 5mM dẫn xuất với AQC trước cột, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395) 50 Hình 3.4: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axít amin nồng độ 5mM dẫn xuất với AQC trước cột, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dịng 1ml/phút, detectơ PDA (= 254nm) 50 Hình 3.5: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axít amin nồng độ 10 mM, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 5m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex=250; em=395) 52 Hình 3.6: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axít amin nồng độ 10 mM,cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex=250; em=395) 52 Hình 3.7: Sắc đồ chuẩn axít glutamic, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395) 53 Hình 3.8: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axít amin, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395) 53 Hình 3.9: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axít amin nồng độ 10 mM chạy với pha động không thêm trietylamin, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395) 58 Hình 3.10: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axít amin nồng độ 50 mM chạy với pha động có thêm trietylamin 17mM, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395) 59 Hình 3.11: Sắc đồ chạy chuẩn hỗn hợp 17 axít amin, nồng độ 10mM, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1,2ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395), pha động chạy theo chế độ gradient 60 Hình 3.12: Sắc đồ chạy chuẩn hỗn hợp 17 axít amin, nồng độ 10mM, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395), pha động theo chế độ gradient 60 Hình 3.13: Sắc đồ chạy chuẩn hỗn hợp 17 axít amin, nồng độ 10mM, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 0,8ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395), pha động theo chế độ gradient 60 Hình 3.14: Sắc đồ chạy chuẩn hỗn hợp 17 axít amin, nồng độ 10mM, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 0,5ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395), pha động theo chế độ gradient 61 Hình 3.15: Đường chuẩn định lượng Asp từ 0,149 đến 1,493 (g/ml) 68 Hình 3.16: Đường chuẩn định lượng His từ 0,015 đến 0,155 (g/ml) 68 Hình 3.17: Đường chuẩn định lượng Arg từ 0,046 đến 0,461 (g/ml) 68 Hình 3.18: Đường chuẩn định lượng Cys từ 0,149 đến 1,49 (g/ml) 68 Hình 3.19: Đường chuẩn định lượng Arg từ 0,092 đến 0,461 (g/ml) 69 Hình 3.20: Đường chuẩn định lượng Cys từ 0,298 đến 1,49 (g/ml) 69 Hình 3.21: Sắc đồ tách axít amin dịch thuỷ phân mẫu hạt đậu tương, thêm chuẩn nồng độ HCl 4,5M, 125 oC, 24 giờ, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395) 71 Hình 3.22: Sự phụ thuộc hiệu suất thu hồi axít amin vào nồng độ HCl thủy phân 72 Hình 3.23: Sắc đồ tách axít amin dịch thuỷ phân mẫu đậu tương HCl 6M 110 oC, 24 giờ, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395) 73 Hình 3.24: Sự phụ thuộc hiệu suất thu hồi axít amin vào nhiệt độ thủy phân đậu nành HCl 6M 74 Hình 3.25: Sắc đồ tách axít amin dịch thuỷ phân mẫu hạt đậu tương HCl 6M, 125oC, 20 giờ, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395) 74 Hình 3.26: Sự phụ thuộc hiệu suất thu hồi axít amin vào thời gian thủy phân 75 Hình 3.27: Sắc đồ tách axít amin dịch thuỷ phân mẫu sữa đậu nành sau làm giàu cách thuỷ, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395) 78 Hình 3.28: Sắc đồ chuẩn axít amin điều chỉnh pH NaOH 0,5M, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex=250; em=395) 79 Hình 3.29: Sắc đồ chuẩn axít amin điều chỉnh pH Na2B4O7 0,25M, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex= 250; em = 395) 80 Hình 3.30: Sắc đồ tách axít amin dịch thuỷ phân mẫu hạt đậu tương dẫn xuất 65oC, thời gian 10 phút, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395) 81 Hình 3.31: Sắc đồ tách axít amin dịch thuỷ phân mẫu hạt đậu tương dẫn xuất 65oC, thời gian phút, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395) 83 Hình 3.32: Sắc đồ tách axít amin dịch thuỷ phân mẫu cá quả, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395) 104 Hình 3.33: Sắc đồ tách axít amin dịch thuỷ phân mẫu cá thu, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395) 105 Hình 3.34: Sắc đồ tách axít amin dịch thuỷ phân mẫu hạt đậu tương, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395) 107 Hình 3.35: Sắc đồ tách axít amin dịch thuỷ phân mẫu đậu phụ, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395) 108 Hình 3.36: Sắc đồ tách axít amin dịch thuỷ phân mẫu sữa đậu nành, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395) 108 Hình 3.37: Sắc đồ tách axít amin dịch thuỷ phân mẫu thịt gà, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395) 113 MỞ ĐẦU Hiện nay, không riêng nước ta mà nhiều nước thể giới phải tiếp tục giải tình trạng nghèo đói suy dinh dưỡng Trong đó, thừa dinh dưỡng kèm theo bệnh mãn tính tim mạch tiểu đường trở nên thách thức lớn giai đoạn chuyển tiếp Vấn đề thừa cân béo phì phận dân cư đô thị (trẻ em, học sinh, lứa tuổi trung niên) số bệnh mãn tính có liên quan đến dinh dưỡng tăng huyết áp đái tháo đường lên có ý nghĩa sức khỏe cộng đồng [3] Để giải vấn đề cần thiết phải kết hợp nhiều giải pháp chiến lược, đảm bảo chế độ ăn lành mạnh phù hợp giải pháp quan trọng Các nghiên cứu vai trị chất có hoạt tính sinh học chế độ ăn bệnh mãn tính tim mạch, béo phì tiểu đường cần thiết giai đoạn Để thực nghiên cứu này, cần thiết phải xây dựng sở liệu hoạt chất sinh học tự nhiên vitamin axít amin, Giá trị loại thức ăn phụ thuộc vào số lượng chất đạm có thức ăn mà phụ thuộc vào số lượng tỷ lệ cân đối axít amin, nghĩa chất lượng protein thức ăn Đối với nước phát triển, thức ăn động vật mà protein có chất lượng tốt chưa đủ, mà cần bổ sung thêm loại thức ăn thực vật giàu protein lại cần thiết Nó giúp có định hướng để phối hợp thức ăn với nhằm nâng cao chất lượng protein phần hàng ngày người dân Hàm lượng protein (chất liệu thể) mà người cần cung cấp ngày 1g/kg trọng lượng thể Thịt cá có lượng protein ngang (15 - 25g) cho 100g thực phẩm ăn vào Điều cần lưu ý, loại thịt có màu đỏ (thịt bị, thịt cừu, thịt ngựa) có chứa nhiều lipít Một miếng thịt bị 150g chứa nhiều lipít miếng bơ 10g; thịt màu trắng (thịt lợn, thịt bê, thịt gà, thịt vịt) xem lipít lại chất sắt Cá loại thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, lượng protein cá giao động từ 16 - 17g/100g [12] Cá có axít béo cần thiết tốt cho phòng chống bệnh tim mạch Đặc biệt mỡ gan cá có chứa nhiều vitamin A D ngồi cá có nhiều nhóm vitamin B, axít folic, vitamin B12, vitamin E, bên cạnh cá nguồn cung cấp chất khoáng quý, dao động từ - 1,7g/100g, có lên tới 3g/100g, gồm yếu tố vi lượng như: đồng, kẽm, i ốt Mỡ cá khơng có đầy đủ thành phần axít béo khơng no mà cịn chứa axít béo thiết yếu DHA Ngồi mỡ cá cịn chứa axít béo Omega-3, có tác dụng bảo vệ hệ thống tim mạch Việc tiêu thụ axít béo làm giảm nguy xơ cứng động mạch cao huyết áp [12] Theo nhận định FAO mức tiêu thụ cá Việt Nam vào khoảng 18,72 kg/người/năm Cá nguồn thực phẩm quý bổ sung lượng protein đáp ứng nhu cầu sinh hoạt người dân Trong chế độ ăn người Châu Á nói chung Việt Nam nói riêng, thực phẩm từ đậu tương chiếm vị trí quan trọng Theo kết tổng điều tra dinh dưỡng năm 2000 Viện Dinh dưỡng, mức tiêu thụ thực phẩm nhóm đậu, đỗ tăng lên đáng kể năm 2000, với khoảng 6g/người/ngày so với 2,8g/người/ngày năm 1990 Đậu phụ, loại thực phẩm giàu đạm thực vật thơng dụng Việt Nam có mức tiêu thụ tăng lên đến 13,4g/người/ngày năm 2000 so với 6,8g/người/ngày năm 1990 [13] Axít amin thành phần quan trọng thể Axít amin tạo nên tế bào, phục hồi mô, tạo nên kháng thể chống lại vi khuẩn virus Axít amin phần enzym hệ thống hormon Nó tạo nên ARN (axit ribo nucleic), ADN (axit deoxy nucleic) vận chuyển oxy khắp thể tham gia vào hoạt động Axít amin cung cấp cho thể từ thực phẩm giàu protein Protein vào thể chuyển hóa thành 20 axít amin, có axít amin thiết yếu khơng tạo từ thể, isoleucin, leucin, lysin, methionin, phenylalanin, threonin, tryptophan valin Sự thiếu hụt axít amin dẫn đến thể mệt mỏi, hạ đường huyết, dị ứng [81] Trên giới, phương pháp truyền thống phân tích axít amin đưa phát triển Moore Stein [63, 64, 65, 66] tách xác định axít amin tự phương pháp sắc ký trao đổi ion với dẫn xuất sau cột (ninhydrin Ophtalaldehyd) Kỹ thuật áp dụng 40 năm cho kết tốt giới hạn phân tích Mặc dù thời gian qua có nhiều phương pháp áp biological fluids by high-performance liquid chromatography Journal of Chromatography B, 784: p 137 - 144 53 Kang-Lyung Woo, Que-Chung Hwang, Hyung-Su Kim (1996), Determination of amino acids in the foods by reversed-phase high-performance liquid chromatography with a new precolumn derivative, butylthiocarbamyl amino acid, compare to the convention phenylthiocarbamyl derivatives and ionexchange chromatography Journal of Chromatography A, 740, p 31 - 40 54 Kenneth J Carpenter 1994), Protein and energy, Cambridge university press, p 119 - 177 55 Kurie Mitani, Shizuo Narimatsu, Hiroyuki Kataoka (2003) Determination of daidzein and genistein in soybean foods by automated on-line in-tube solidphase microextraction coupled to high-performance liquid chromatography Journal of Chromatography A, 986: p 169 - 177 56 Laskar, S., Sinhababu, A., Hazra, K.M., (2001), A modified spray reagent for the detection of amino acid on thin layer chromatography plates Amino Acids 21, p 201 - 204 57 Liisa M Valsta, Annamari Kilkkinen, Witold Mazur, Tarja Nurmi, AnnaMaija Lampi, Marja-Leena Ovaskainen1, Tommi Korhonen1, Herman Adlercreutz and Pirjo Pietinen (2003) Phytooestrogen database of foods and average intake in Finland British Journal of Nutrition, 89, Suppl 1, S31- S38 58 Lourdes Bosch, Amparo Alegria, Rosaura Farre (2006) Application of the 6aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate (AQC) reagent to the RPHPLC determination of amino acids in infant foods Journal of Chromatography B, 831, p 176 - 183 59 M Ummadi, B C.Weimer (2002), Use of capillary electrophoresis and laserinduced fluorescence for attomole detection of amino acids, Journal of chromatography A, 964, p 243 - 253 60 Mark Messina, Christoper Gardner and Stephen Barnes (2002) Gaining Insight into the Health Effects of Soy but a Long Way Still to Go: Commentary on the Fourth International Symposium on the Role of Soy in Preventing and 126 Treating Chronic Disease Journal of Nutrition, 132: 547S - 551S 61 Mazur, W and H Adlercreutz (1998) Naturally occuring estrogens in food Pure & Applied Chemistry 70: p 1759 - 1776 62 Mindy S Kurzer (2002) Hormonal Effects of Soy in Premenopausal Women and Men Journal of Nutrition, 132: 570S - 573S 63 Moore, S., (1968), Amino acid analysis; aqueous dimethyl sulfoxide as solvent for the ninhydrin reaction Journal of Biological Chemistry 243, 6281- 6283 64 Moore, S., Stein, W.H., (1948), Photometric ninhydrin method for use in the chromatography of amino acids, Journal of Biological Chemistry 176, p 367 388 65 Moore, S., Stein, W.H., (1954), A modified ninhydrin reagent for the photometric determination of amino acids and related compounds, Journal of Biological Chemistry 211, p 907 - 913 66 Moore, W.H Stein, (1951) , Determination amino acid by post-columm derivatization, J Biol Chem 192, 663 67 Morris J Bradley (2004), Legumes: Nutraceutical and Pharmaceutical Uses Published in Encyclopedia of Plant and Crop Science, ISBN: 0-8247-4268-0, p 651 - 655 68 Owen R Fennenma (1985), Food chemistry-second edition, revised and expanded, New York and Basel, p 245 - 370 69 Panasiuk, R., Amarowicz, R., Kostyra, H., Sijtsma, L., (1998), Determination of -amino nitrogen in pea protein hydrolysates: a comparison of three analytical methods, Food Chemistry 62, p 363 - 367 70 Patricia A Murphy, Tongtong Song, Gwen Buseman, and Kobita Barua (1997) Isoflavones in Soy-Based Infant Formulas Journal of Agriculture and Food Chemistry 45, p 4635 - 4638 71 Prochazkova, S., Varum, K.M., Ostgaard, K., (1999), Quantitative determination of chitosans by ninhydrin, Carbohydrate Polymers 38, p 115 122 127 72 R Draisci, L Giannetti, P Boria, L Lucentini, L Palleschi, S Cavalli (1998) Improved ion chromatography-integrated pulsed amperometric detection method for the evaluation of biogenic in food of vegetable or animal origin and in fermented foods Journal of Chromatography A, 798, p 109 - 116 73 Shih-Wen Sun, Yi-Cheng Lin, Yih-Ming Weng, Min-Jane Chen (2006), Effciency improvement on ninhydrin method for amino acid quantification, Journal of food and analysis 19, p 112 - 117 74 Starcher, B (2001), A ninhydrin-based assay to quantitate the total protein content of tissue samples, Analytical Biochemistry 292, p 125 - 129 75 Strydom D J., Andersen T.T., Apostol I., Fox J.W., Paxton R J, Crabb J W (1993), Cystein and trytophan amino acid analysis, Techniques in protein chemistry IV, Hogue Angeletti R Academic Press, San Diego, p 279 - 288 76 Susana Maria Halpine (2006), Amino acid analysis by HPLC, Encyclopedia of chromatography 77 Thomas M Badger, Martin J J Ronis, Reza Hakkak, J Craig Rowlands and Soheila Korourian (2002) The Health Consequences of Early Soy Consumption Journal of Nutrition, 132: 559S - 565S 78 Tom Teerlink, Marcel P Copper, Ingeborg Klaassen, Boudewijin J.M Braakhuit (1997), Simultanaeus analysis of retinol, all trans- and 13 cisretinoic acid and 13-cis-4-oxoretinoic acid in plasma by liquid chromatography using on-column concentration after single-phase fluid extraction, Journal of chromatography B, 694, p 83 - 92 79 Tyson, Don (1999) Metabolism and Analysis amino acids Interpretation Guide 80 U.S Department of Agriculture, Agricultural Research Service (2002) USDA-Iowa State University Database on the Isoflavone Content of Foods, Release 1.3 - 2002 Nutrient Data Laboratory Web site: http://www.nal.usda.gov/fnic/foodcomp/Data/isoflav/isoflav.html 81 Yaru Song, Ming Shenwu, Shulin Zhao, Dongyan Hou, Yi-Ming Liu (2005) Enantiomeric separation of amino acids derivatized with 7-fluoro-4- 128 nitrobenzoxadiazole by capillary liquid chromatography/tandem mass spectrometry Journal of Chromatography A, 1091, p 102 - 109 82 Yiannis C Fiamegos, Constantine D Stalikas (2006) Gas chromatographic determination of amino acids via one-step phase-transfer catalytic pentafluorobenzylation-preconcentration Journal of Chromatography A 83 Yin, J., Tomycz, L., Bonner, G., Wang, D.I.C., (2002), A simple and rapid assay of collagen-like polymer in crude lysate from Escherichia coli Journal of Microbiological Methods 49, p 321 - 323 84 Yukio Yokoyama, Sachiyo Tsuji, Hisakuni Sato (2005), Simultaneous determination of creatinine, creatin, and UV-absorbing amino acids using dual-mode gradient low-capacity cation-exchange chromatography, Journal of Neuroscience Methods 144, pp 63 - 71 129 PHỤ LỤC Chức đặc tính lý hố axít amin 130 Axít amin tạo protein AA chứa nhóm S Axít amin mạch thẳng Axít amin thơm Axít amin trung tính Axít amin vịng Axít amin axit Axít amin trung tính Axít amin bazơ 131 PHỤ LỤC Khảo sát thành phần tỷ lệ pha động rửa giải đẳng dòng (A: dung dịch đệm acetat phosphat pH=5,05; B: ACN) 0.03 A:B = 97 : 0.01 Volts 0.02 0.01 0.00 0.02 Retention Time Area Name 0.00 (Gly) (Glu) (Asp) (Phe) (Arg) (His) (Ser) Volts 0.03 Detector A (Ex:250nm, Em:395nm) amino acids Chuan hon hop MP 97-3.dat 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Minutes A:B = 95 : Detector A (Ex:250nm, Em:395nm) amino acids Chuan hon hop MP 95-5.dat 0.02 Volts 0.04 0.02 0.00 Volts 0.04 Retention Time Area Name 0.00 10 15 20 25 30 35 40 45 Minutes 0.04 A:B = 90 : 10 0.02 0.01 0.00 Volts 0.02 0.03 0.01 0.03 Retention Time Area Height Name 0.00 Volts 0.04 Detector A (Ex:250nm, Em:395nm) amino acids Chuan hon hop MP 90-10.dat 10 15 20 25 30 35 Minutes 132 40 45 50 55 60 PHỤ LỤC MỘT SỐ SẮC ĐỒ PHÂN TÍCH MẪU THỰC Sắc đồ phân tích mẫu cá: 133 134 135 Sắc đồ phân tích đậu tương: 136 Sắc đồ phân tích mẫu thịt: 0.15 Chuẩn hỗn hợp 34.425 Val Met 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 33.750 Volts Lys 30.417 Tyr 30.975 Leu 31.458 34.808 29.275 28.600 27.175 0.05 29.725Cys Pro 26.025 23.783 23.983 24.683 Arg Thr Ala 22.383 Asp 17.125 18.008 Ser 19.225 Glu 20.042 Gly 21.092 His 0.10 0.00 15.608 0.05 Volts NH3 0.10 Retention Time Name 7.5 0.15 Ileu Detector A (Ex:250nm, Em:395nm) amino acids Chuan hon hop_02.11.07.dat 27.5 30.0 32.5 0.00 35.0 Minutes Mẫu thịt gà: 1.3026g + 10ml HCl 6N - thủy phân - định mức 100 - pha loãng 50 lần Detector A (Ex:250nm, Em:395nm) amino acids Mau thit lon_1.0119g-100-1-50.dat 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 22.5 25.0 Volts Ileu Leu 0.05 34.467 34.825 31.458 Val 30.450 23.792 24.000 20.0 Arg Thr 25.400 26.033 26.817 Pro Cys Lys 0.10 33.783 29.292 Tyr 31.000 24.692 His NH3 21.100 22.250 17.125Asp 18.000 Ser 18.850 19.200 Glu 20.033 Gly 0.00 15.575 0.05 Volts 0.10 Retention Time Name Met Ala 0.15 29.717 0.15 Lấy 0,5 ml dịch pha lỗng + 100µl đem + 30 µl dẫn xuất 27.5 30.0 32.5 0.00 35.0 Minutes Detector A (Ex:250nm, Em:395nm) amino acids Mau thit ga_1.3026g-100-1-50.dat 10.0 12.5 15.0 17.5 Volts 0.10 22.5 Minutes 137 25.0 Ileu Leu 33.783 0.05 34.467 34.833 31.475 29.725 Lys Pro Cys 20.0 Arg Thr 25.342 26.008 26.800 23.675 23.900 0.00 7.5 29.300 Ala 24.625 20.758 His 21.575 NH3 19.633 17.458 Ser 18.375 Glu 18.758 Asp 16.550 14.858 0.05 Volts Gly 0.10 Retention Time Name Met Val 0.15 30.450 Tyr 31.008 0.15 Mẫu thịt lợn: 1.0119g + 10ml HCl 6N - thủy phân - định mức 100 - pha loãng 50 lần Lấy 0,5 ml dịch pha lỗng + 100µl đem + 30 µl dẫn xuất 27.5 30.0 32.5 0.00 35.0 PHỤ LỤC ĐƯỜNG CHUẨN ĐỊNH LƯỢNG CỦA CÁC AXÍT AMIN 140000 100000 ChiỊu cao pic (mV) § é hÊp thô (mV) y = 17389x - 11862 R2 = 0,9937 100000 y = 21449x - 13913 R2 = 0,995 120000 80000 60000 40000 20000 80000 60000 40000 20000 0 0.091 0.182 0.365 0.547 0.73 0.159 0.317 0.634 0.952 1.269 1.586 0.912 Nång ®é Glu (mcg/ml) Nång ®é Ser (mcg/ml) Đường chuẩn định lượng Ser từ 0,091 đến 0,912 (g/ml) Đường chuẩn định lượng Glu từ 0,159 đến 1,568 (g/ml) 100000 80000 y = 17683x - 11257 R2 = 0,9954 ChiÒu cao pic (mV) ChiÒu cao pic (mV) 120000 60000 40000 20000 0.079 0.158 0.315 0.473 0631 y = 69592x - 44629 R2 = 0,9953 400000 350000 300000 250000 200000 150000 100000 50000 0.788 0,032 Nång ®é Gly (mcg/ml) 250000 0,191 0,255 0,318 Đường chuẩn định lượng Thr từ 0,032 đến 0,318 (g/ml) 140000 y = 57257x - 39583 R2 = 0,9933 ChiÒu cao pic (mV) ChiÒu cao pic (mV) 300000 0,127 Nång ®é Thr (mcg/ml) Đường chuẩn định lượng Gly từ 0,079 đến 0,788 (g/ml) 350000 0,074 200000 150000 100000 50000 120000 y = 24392x - 16396 R2 = 0,9942 100000 80000 60000 40000 20000 0.029 0.059 0.117 0.176 0.234 0.293 0.088 0.177 0.354 Nång ®é Ala (mcg/ml) 0.53 0.707 0.884 Nång ®é Pro (mcg/ml) Đường chuẩn định lượng Ala từ 0,079 đến 0,788 (g/ml) Đường chuẩn định lượng Pro từ 0,032 đến 0,318 (g/ml) 138 y = 49271x - 33542 R2 = 0,9938 250000 ChiÒu cao pic (mV) ChiÒu cao pic (mV) 300000 200000 150000 100000 50000 0.069 0.138 0.271 0.414 0.552 y = 79214x - 55233 R2 = 0,9937 450000 400000 350000 300000 250000 200000 150000 100000 50000 0.69 0.028 0.056 0.111 0.167 0.222 0.278 Nång ®é Tyr (mcg/ml) Nång ®é Val (mcg/ml) 400000 350000 300000 250000 200000 150000 100000 50000 Đường chuẩn định lượng Val từ 0,028 đến 0,278 (g/ml) 250000 y = 65486x - 50641 R2 = 0,9971 ChiÒu cao pic (mV) ChiÒu cao pic (mV) Đường chuẩn định lượng Tyr từ 0,069 đến 0,69 (g/ml) y = 36827x - 24357 R2 = 0,9946 200000 150000 100000 50000 0.044 0.087 0.175 0.262 0.35 0.437 0.028 0.056 0.111 0.167 0.222 0.278 Nång ®é Met (mcg/ml) Nång ®é Lys (mcg/ml) Đường chuẩn định lượng Met từ 0,044 đến 0,437 (g/ml) Đường chuẩn định lượng Lys từ 0,028 đến 0,278 (g/ml) 500000 400000 500000 y = 87623x - 32516 R2 = 0,9961 ChiÒu cao pic (mV) ChiÒu cao pic (mV) 600000 300000 200000 100000 y = 82351x - 55255 R2 = 0,9942 400000 300000 200000 100000 0.026 0.053 0.106 0.159 0.212 0.265 0.03 Nång ®é Ile (mcg/ml) 0.06 0.119 0.179 0.239 0.298 Nång ®é leu (mcg/ml) Đường chuẩn định lượng Ile từ 0,026 đến 0,265 (g/ml) Đường chuẩn định lượng Leu từ 0,03 đến 0,298 (g/ml) 139 120000 y = 16806x - 11856 R2 = 0,9925 80000 ChiÒu cao pic (mV) ChiÒu cao pic (mV) 100000 60000 40000 20000 80000 60000 40000 20000 0,149 0,299 0,597 0,896 1,195 y = 20689x - 14596 R2 = 0,9925 100000 1,493 0,015 Nång ®é Asp (mcg/ml) 45000 y = 71193x - 50227 R2 = 0,9925 350000 0,124 0,155 y = 7615,7x - 5169,9 R2 = 0,9939 40000 ChiÒu cao pic (mV) 400000 0,093 Đường chuẩn định lượng His từ 0,015 đến 0,155 (g/ml) 450000 ChiÒu cao pic (mV) 0,062 Nång ®é His (mcg/ml) Đường chuẩn định lượng Asp từ 0,149 đến 1,493 (g/ml) 300000 250000 200000 150000 100000 35000 30000 25000 20000 15000 10000 5000 50000 0 0,046 0,092 0,185 0,277 0,369 0,461 0,149 Nång ®é Arg (mcg/ml) 500000 300000 200000 100000 0.036 0.072 0.143 0.215 0.275 0,596 0,894 1,129 1,49 Đường chuẩn định lượng Cys từ 0,149 đến 1,49 (g/ml) y = 86505x - 58592 R2 = 0,9939 400000 0,298 Nång ®é Cys (mcg/ml) Đường chuẩn định lượng Arg từ 0,046 đến 0,461 (g/ml) ChiÒu cao pic (mV) 0,031 0.358 Nång ®é Phe (mcg/ml) Đường chuẩn định lượng Phe từ 0,036 đến 0,358 (g/ml) 140 ... Vì vậy, đề tài thực với mục tiêu nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện để tách xác định số axít amin thực phẩm sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu protein axít amin 1.1.1 Lịch... nitơ axít amin mẫu thử 1.4.5 Các phương pháp tách xác định đồng thời axít amin Nhược điểm phương pháp xác định protein axít amin đề cập xác định tổng số nitơ mà xác định riêng rẽ axít amin Để khắc... cứu tách xác định đồng thời 17 axít amin số nhóm thực phẩm thơng dụng (gồm: số loại thịt, số loại cá nước ngọt, cá nước mặn, hạt đậu tương sản phẩm chế biến từ đậu tương) sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC)