Luận văn tốt nghiệp về việc sử dụng kit thu nhanh trong phân tích urea

Luận văn tốt nghiệp về việc sử dụng kit thu nhanh trong phân tích urea.

iĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINHTRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOAKHOA KỸ THUẬT HOÁ HỌCLUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌCNGHIÊN CỨU CHẾ TẠO KIT THƯÛ NHANHTRONG PHÂN TÍCH UREASVTH : TRỊNH THỊ THANH TÂMMSSV : 60302440CBHD : TS. TRẦN BÍCH LAMBỘ MÔN KỸ THUẬT THỰC PHẨMTP Hồ Chí Minh, 01/2008 NNHHAẬÄNNXXEÉÙTTCCUỦÛAAGGIIAÁÙOOVVIIEÊÂNNHHƯƯƠỚÙNNGGDDAẪÃNN . NNHHAẬÄNNXXEÉÙTTCCUỦÛAAGGIIAÁÙOOVVIIEÊÂNNPPHHAẢÛNNBBIIEỆÄNN . LỜI CÁM ƠN GVHD: TS. Trần Bích LamiiLLƠỜØIICCAẢÛMMƠƠNNTrước hết, em xin gởi lời cám ơn đến thầy cô trường Đại học Bách Khoa, đặc biệt làcác thầy cô Bộ môn Công nghệ Thực phẩm đã truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quýbáu cho chúng em trong suốt gần năm năm ngồi trên ghế giảng đường đại học.Em xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến cô Trần Bích Lam đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡem rất nhiều để em có thể hoàn thành tốt luận văn này.Cuối cùng, tôi xin cảm ơn các bạn lớp HCTP03 đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong thời gianlàm luận văn. Chúc các bạn luôn vui vẻ và thành công trong cuộc sống.SSiinnhhvviieêânnTTrròònnhhTThhòòTThhaannhhTTaââmm MỤC LỤC GVHD: TS. Trần Bích LamiiiMMUỤÏCCLLUỤÏCCĐĐEỀÀMMUỤÏCC::TTrraannggTTRRAANNGGBBÌÌAA iLLƠỜØIICCAẢÛMMƠƠNN iiMMUỤÏCCLLUỤÏCC .iiiDDAANNHHSSAÁÙCCHHHHÌÌNNHHVVEẼÕ . viiDDAANNHHSSAÁÙCCHHBBAẢÛNNGGBBIIEỂÅUU . ixLLƠỜØIIMMƠƠÛÛĐĐAẦÀUU 1CCHHƯƯƠƠNNGG11 . 21.1. Enzyme urease (EC 3.5.1.5) 31.1.1. Danh pháp quốc tế và phân loại 31.1.2. Tính chất vật lý của enzyme urease 31.1.3. Tính chất hóa lý của enzyme urease . 61.1.4. Trung tâm hoạt động 61.1.5. Cơ chế xúc tác 91.1.6. Cơ chất của urease 101.1.7. Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng của urease . 121.2. Các phương pháp thu nhận urease 231.2.1. Nguồn thu nhận . 231.2.2. Một số phương pháp tách chiết và tinh chế enzyme . 261.3. Các phương pháp xác đònh hoạt tính urease . 271.3.1. Xác đònh hoạt tính urease dựa trên việc đònh lượng NH3được giải phóng 29 MỤC LỤC GVHD: TS. Trần Bích Lamiv1.3.2. Xác đònh hoạt tính urease bằng cách đònh lượng CO2được giải phóng . 301.4. Ứng dụng của enzyme urease . 311.4.1. Trong nông nghiệp 311.4.2. Trong thực phẩm . 311.4.3. Trong phân tích hóa sinh 311.4.4. Trong công nghệ môi trường 321.4.5. Trong y học . 321.5. Tổng quan về urea . 321.5.1. Cấu tạo hóa học của urea . 321.5.2. Phát hiện . 331.5.3. Công dụng . 341.5.4. Mức độ nguy hiểm 351.5.5. Các nguồn phát sinh urea . 351.5.6. Các phương pháp xác đònh urea . 391.6. Kit thử nhanh trong phân tích urea 461.6.1. Tình hình các loại kit thử nhanh ở Việt Nam [52] . 461.6.2. Các loại kit phân tích urea . 47CCHHƯƯƠƠNNGG22 . 502.1. Nguyên liệu 512.1.1. Hóa chất 512.1.2. Dụng cụ . 512.2. Phương pháp nghiên cứu . 522.2.1. Sơ đồ nghiên cứu 522.2.2. Phương pháp tìm chất chỉ thò màu tối ưu . 522.2.3. Phương pháp xác đònh lượng chất chỉ thò thích hợp cho lên kit . 542.2.4. Phương pháp chọn dung môi thích hợp dùng để pha urease . 54 MỤC LỤC GVHD: TS. Trần Bích Lamv2.2.5. Phương pháp chọn thể tích chấm enzyme phù hợp . 582.2.6. Phương pháp nghiên cứu lượng enzyme urease thích hợp cho lên kit . 592.2.7. Phương pháp khảo sát giới hạn phát hiện của kit, xây dựng thang màu bán đònhlượng urea và đường chuẩn pH 602.2.8. Phương pháp xác đònh thời gian hiện màu của kit 602.2.9. Phương pháp xác đònh thời gian sử dụng của kit . 602.2.10. Khảo sát khả năng phát hiện của kit trong mẫu thực 612.2.11. Các phương pháp xử lý số liệu . 61CCHHƯƯƠƠNNGG33 . 623.1. Khảo sát các loại chất chỉ thò màu 633.2. Khảo sát lượng chất chỉ thò thích hợp cho lên kit . 653.3. Khảo sát dung môi pha urease 683.3.1. Khảo sát hoạt tính của enzyme urease theo phương pháp Nessler 683.3.2. Khảo sát dung môi dùng để pha urease 703.4. Khảo sát lượng enzyme thích hợp cho lên kit 723.4.1. Khảo sát thể tích chấm enzyme urease lên kit 723.4.2. Khảo sát nồng độ dung dòch enzyme urease cho lên kit . 723.5. Khảo sát giới hạn phát hiện của kit, xây dựng thang màu bán đònh lượng urea và đườngchuẩnpH 763.5.1. Xác đònh khả năng phát hiện của kit . 763.5.2. Xây dựng thang màu bán đònh lượng urea . 773.5.3. Xây dựng đường chuẩn pH để đònh lượng urea 783.6. Khảo sát thời gian hiện màu của kit . 833.7. Khảo sát thời gian sử dụng của kit 853.8. Khảo sát khả năng phát hiện của kit trong mẫu thực 873.8.1. Sữa . 87 MỤC LỤC GVHD: TS. Trần Bích Lamvi3.8.2. Nước mắm . 893.8.3. Thủy sản 90CCHHƯƯƠƠNNGG44 . 954.1. Kết luận 964.2. Kiến nghò: . 97TTAÀØIILLIIEỆÄUUTTHHAAMMKKHHAẢÛOO 98 DANH SÁCH HÌNH VẼ GVHD: TS. Trần Bích LamviiDDAANNHHSSAÁÙCCHHHHÌÌNNHHVVEẼÕChương 1: TỔNG QUANHình 1.1: Tinh thể urease được J.B.Summer chiết tách và kết tinh . 4Hình 1.2: Khối lượng phân tử của urease qua cột lọc gel Agarose A_15m 4Hình 1.3: Cấu trúc của enzyme urease . 6Hình 1.4: Trung tâm hoạt động của urease 8Hình 1.5: Urease từ K.aerogenes và từ Bacillus pasterrii . 8Hình 1.6: Cơ chế xúc tác của enzyme . 9Hình 1.7: Cơ chế xúc tác của urease 10Hình 1.8: Công thức cấu tạo của một số cơ chất chứa phospho của urease 11Hình 1.9: Đồ thò biểu diễn vận tốc phản ứng theo nồng độ cơ chất 12Hình 1.10: Đồ thò hoạt tính urease theo pH trong 3 loại đệm nồng độ M/8 . 14Hình 1.11: Ảnh hưởng của chất kìm hãm cạnh tranh và không cạnh tranh 16Hình 1.12: Cơ chế ức chế của hydroxamic acid với urease . 17Hình 1.13: Công thức hóa học của các α-hydroxyketones (1–13) and α – diketones (14–20) . 19Hình 1.14: Ảnh hưởng của các hợp chất thiols, urea và acid boric tới khả năng ức chế ureasecủa dòch chiết tỏi trước khi ủ 21Hình 1.15: Động học của sự ức chế urease bởi dòch chiết tỏi ở các nồng độ khác nhau . 21Hình 1.16: Cấu trúc phân tử urease của Helicobacter Pylori . 23Hình 1.17: Các loại đậu chứa enzyme urease 25Hình 1.18: Cấu trúc phân tử của urea . 32CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬNHình 3.1: Màu sắc của chỉ thò trong nước cất (pH = 6.5) . 64Hình 3.2: Màu sắc của chỉ thò trong nước máy (pH = 6.8) . 64Hình 3.3: Vò trí chất chỉ thò và enzyme urease trên kit 66 DANH SÁCH HÌNH VẼ GVHD: TS. Trần Bích LamviiiHình 3.4: Kit thử với các nồng độ phenol red khác nhau trước khi nhúng dung dòch urea 66Hình 3.5: Sự thay đổi màu sắc của chỉ thò PR trên kit sau khi nhúng urea . 66Hình 3.6: Kit thử với các nồng độ phenol red khác nhau sau khi nhúng dung dòch urea 2% 67Hình 3.7: Kit thử sau khi dung dòch urea chạy hết kit . 67Hình 3.8: Kit thử trắng sau khi dung dòch urea chạy hết kit 68Hình 3.9: Đồ thò NH3chuẩn dùng để xác đònh hoạt tính urease . 69Hình 3.10: Biểu đồ so sánh hoạt tính urease trong các loại dung môi . 71Hình 3.11: Khảo sát khả năng phát hiện của kit chấm 30µl urease 4% trong dung dòch urea ởcác nồng độ: 1 – 0ppm, 2 – 1000ppm, 3 – 800ppm, 4 – 600ppm 74Hình 3.12: Khảo sát khả năng phát hiện của kit chấm 60µl urease 4% trong dung dòch urea ởcác nồng độ: 1 – 0ppm, 2 – 1000ppm, 3 – 800ppm, 4 – 600ppm, 5 – 400ppm, 6 – 200ppm, 7 –100ppm, 8 – 50ppm . 75Hình 3.13: Sự thay đổi màu sắc của chỉ thò trên kit sau khi nhúng dung dòch urea ở các nồngđộ: 1 – 0ppm, 2 – 50ppm, 3 – 40ppm, 4 – 30ppm, 5 – 20ppm, 6 – 10ppm, 7 – 5ppm 76Hình 3.14: Sự thay đổi màu sắc của chỉ thò trên kit sau khi nhúng dung dòch urea ở các nồngđộ: 1 – 0ppm, 2 – 50ppm, 3 – 100ppm, 4 – 200ppm, 5 – 400ppm, 6 – 600ppm, 7 – 800ppm, 8 –1000ppm 77Hình 3.15: Sự thay đổi màu sắc của chỉ thò trên kit sau khi nhúng dung dòch urea 0.5% và 1%78Hình 3.16: Các bước đònh tính sự có mặt urea trong mẫu thử 78Hình 3.17: Đồ thò đường chuẩn biểu diễn sự thay đổi của pH theo nồng độ urea trong nước . 80Hình 3.18: Đồ thò đường chuẩn biểu diễn sự thay đổi của pH theo nồng độ urea trong nướcmắm . 81Hình 3.19: Đồ thò đường chuẩn biểu diễn sự thay đổi của pH theo nồng độ urea trong sữa . 83Hình 3.20: Đồ thò biễu diễn hoạt tính urease trên kit theo thời gian 86Hình 3.21: Sử dụng kit để phát hiện urea trong sữa 88Hình 3.22: Sử dụng kit để phát hiện urea trong nước mắm . 89Hình 3.23: Cách sử dụng kit thử để phát hiện urea trong mẫu nước đá ướp thủy sản và mẫu cá . 92 [...]... khi sử dụng phải đong, đo hóa chất từ các lọ nhỏ đóng sẵn, vì vậy không loại trừ được sai số chủ quan do người sử dụng gây ra Trong số các kit nội bán trên thò trường chưa có loại kit dùng để phân tích urea trong thực phẩm Với lý do đó, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu chế tạo kit thử nhanh dùng trong phân tích urea trong khuôn khổ bài luận văn này Nội dung nghiên cứu gồm 2 phần chính:  Chế tạo kit. .. chính:  Chế tạo kit thử nhanh dùng để phân tích urea dựa trên nguyên tắc sử dụng enzyme urease để thủy phân đặc hiệu urea  Ứng dụng kit thử để phân tích urea trong các mẫu thực Trang 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN GVHD: TS Trần Bích Lam CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN Trang 2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN GVHD: TS Trần Bích Lam 1.1 Enzyme urease (EC 3.5.1.5) 1.1.1 Danh pháp quốc tế và phân loại [2]  Danh pháp: Urease có tên hệ thống... enzyme urease 69 Bảng 3.4: Hoạt tính của urease trong các dung môi khác nhau 70 Bảng 3.5: Khảo sát thể tích chấm enzyme urease lên kit 72 Bảng 3.6: Khảo sát khả năng phát hiện của kit trong dung dòch urea ở các nồng độ khác nhau 73 Bảng 3.7: Khảo sát khả năng phát hiện của kit trong dung dòch urea ở các nồng độ khác nhau khi tăng số lần chấm urease lên kit ... hiện dành cho mọi người là sử dụng kit thử nhanh để kiểm tra sự có mặt của một hóa chất độc hại trong thực phẩm ngay khi vừa mua về vì đơn giản, dễ sử dụng, giá thành rẻ và thời gian phát hiện ngắn Kit thử nhanh cũng là phương tiện giúp cho công tác kiểm tra nhanh chất lượng thực phẩm ở cấp cơ sở Hiện nay, trên thò trường có bán nhiều loại kit thử nhanh nhưng đa phần là các kit ngoại chưa phù hợp lắm... đóng vai trò quan trọng thì người bán đã sử dụng những thủ thu t không được phép sử dụng như phun hóa chất để làm bóng trái cây, ngâm thòt gia súc hay gia cầm trong dung dòch hàn the, ướp urea cho thủy sản để nhìn bề ngoài trông tươi lâu hơn, cho urea vào trong nước mắm để làm tăng độ đạm…Những thủ thu t “hàng chợ” này không chỉ đánh lừa người tiêu dùng trong việc mua các sản phẩm thực phẩm không còn... N-(3-methyl-2-butenyl)phosphoric triamide (Alk = (H3C)2C=CH, MBPT) (hình 1.e) Trong đó urea là cơ chất đặc hiệu của urease với năng lượng hoạt hóa là 8700 hoặc 11700 calories/g.mol ở 25oC còn đối với các cơ chất như hydroxyurea hoặc dihydroxyurea thì vận tốc nhỏ hơn 120 lần Phân tử urea rất bền Trong khoảng pH = 2 – 12, sự phân hủy urea không enzyme trong dung dòch không phụ thu c pH và có chu kỳ bán hủy là 3.6 năm ở 38oC Người... sát khả năng phát hiện của kit khi thay đổi lượng urease /kit 75 Bảng 3.9: Các thông số chế tạo của kit 76 Bảng 3.10: Khảo sát khả năng phát hiện của kit trong các dung dòch urea có nồng độ thấp 77 Bảng 3.11: Khảo sát sự thay đổi pH của dung dòch urea trước và sau khi cho urease 79 Bảng 3.12: Khảo sát sự thay đổi pH của nước mắm chứa urea trước và sau khi cho urease 80 Bảng 3.14: Khảo... tính càng giảm Trong đệm phosphate, urease hoạt động tốt trong khoảng pH 5 – 9, trong đệm citrate là pH 4 – 8.5, trong đệm acetate là pH dưới 3 – 7.5 Hoạt tính cao nhất của urease theo nghiên cứu của Stacey F Howell and James B Sumner là với dung dòch urea 1% trong đệm citrate M/8 pH 6.5 [16] Như vậy, hoạt tính của urease phụ thu c vào dung dòch đệm, giá trò pH, nồng độ urea, nhiệt độ, nồng độ muối… Bảng... đối với urease đậu rựa và đậu nành Brasil và so sánh với các protein đã biết trước khối lượng phân tử [17] Kết quả cho thấy urease từ đậu nành có 2 peak ứng với 2 phân tử lượng khác nhau đó là 540.000 Da và 420.000 Da, trong khi đó urease từ đậu rựa chỉ xuất hiện 1 peak duy nhất với phân tử lượng là 480.000 Da Hình 1.2: Khối lượng phân tử của urease qua cột lọc gel Agarose A_15m [17] Như vậy, urease... sự thay đổi pH của sữa chứa urea trước và sau khi cho urease 82 Bảng 3.15: Khảo sát thời gian hiện màu của kit 84 Bảng 3.16: Khảo sát hoạt tính của urease trên kit theo thời gian 86 Bảng 3.17: Khảo sát sự có mặt của urea trong sữa 88 Bảng 3.18: Khảo sát sự thay đổi pH của các mẫu nước mắm 90 Bảng 3.19: Khảo sát khả năng phát hiện urea của kit trong thủy sản 93 x LỜI . tạo kit thử nhanh dùng trong phân tích urea trongkhuôn khổ bài luận văn này.Nội dung nghiên cứu gồm 2 phần chính: Chế tạo kit thử nhanh dùng để phân tích. nhanh dùng để phân tích urea dựa trên nguyên tắc sử dụng enzymeurease để thủy phân đặc hiệu urea.  Ứng dụng kit thử để phân tích urea trong các mẫu thực. CHÖÔNG