Luận văn tốt nghiệp nghiên cứu sản xuất enzyme celllulase từ nấm mốc - Chương 4.
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN45 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN4.1. Chọn loài nấm mốc sinh tổng hợp enzym cellulase có hoạt tính cao nhất.Ta có 9 giống nấm mốc lấy từ PTNVS: A.Niger, A.awamori, A.aculactum, A.oryzae, T.konigii, T.hazianum, T.viride, P.citrinum, Rhizopus.sp. 4.1.1.Thí nghiệm 1: Thử nhanh xác đònh loài nấm mốc có hoạt tính enzym cellulase.4.1.1.1.Kết quả thí nghiệm P.citrinum A.awamori46 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN A.aculactum A. NigerHình 4.1-Kết quả thử nhanh hoạt tính cellulase của 4 loài nấm mốc4.1.1.2.Nhận xét và bàn luậnPhương pháp chọn lọc sơ bộ VSV có khả năng sinh hoạt tính cellulase dựa trên sự bắt màu của thuốc thử Congo đỏ với polysaccharide (CMC). Thuốc thử Congo đỏ có khả năng bắt màu với liên kết hidrogen của polysaccharide. Khi CMC bò phân hủy tạo thành các hợp chất có trọng lượng phân tử thấp hơn thì sự bắt màu với Congo đỏ không còn nữa. Vùng trong suốt trên nền đỏ là nơi enzym tác dụng và phân hủy cơ chất. Tuy nhiên màu ở vùng này còn tùy thuộc vào sản phẩm cuối của quá trình thủy phân cellulose. Trong thí nghiệm này vùng thủy phân có màu vàng. Như vậy sản phẩm cuối không chỉ là đường đơn mà còn các chất khác có trọng lượng phân tử cao hơn.Ngoài ra, trong phương pháp này dung dòch enzym thu được từ môi trường lỏng cần được lọc để loại bỏ tế bào nấm mốc trước khi tiến hành thử trên hộp petri. Làm như vậy ta loại bỏ được ảnh hưởng của sợi nấm mốc đến khả năng bắt màu với thuốc thử Congo đỏ.Trong 9 loài nấm mốc ở trên thì chỉ có 4 loài A.Niger, A.awamori, A.aculactum và P.citrinum có xuất hiện vùng màu vàng trên nền đỏ. Vùng này chính là vùng CMC 47 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬNbò phân giải bởi enzym. Như vậy với điều kiện thí nghiệm, trong 9 loài nấm mốc đã chọn thử hoạt tính thì 4 loài này là có khả năng sinh enzym cellulase. Kết quả thu được chỉ là tương đối, bởi vì trong 9 loài nấm mốc mà ta chọn thuộc 4 giốngï: Aspergillus, Trichoderma, Rhizopus và Penicillium. Mỗi giống này có tốc độ sinh trưởng khác nhau. Do đó, thời gian để chúng sinh tổng hợp enzym có hoạt tính cao nhất cũng khác nhau. Mà thí nghiệm này ta chỉ sử dụng ở cùng một thời điểm là 3 ngày, cho nên dựa trên kết quả này ta chỉ chọn được sơ bộ một số loài VSV có hoạt tính enzym cellulase chứ chưa chọn được loài VSV có hoạt tính enzym cellulase cao nhất. Muốn có kết quả chính xác ta cần khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzym theo thời gian.4.1.2.Thí nghiệm 2: Chọn loài nấm mốc có hoạt tính enzym cao nhất Tiếp tục ta nuôi 4 loài nấm mốc này trên môi trường CZ với nguồn cơ chất là CMC 1%. Sau đó ta tiến hành xác đònh hoạt tính enzym bằng phương pháp đo đường khử. Kết quả được đo ở ngày thứ 2, 3, 4, 5.4.1.2.1. Kết quả thí nghiệmBảng 4.1– Hoạt tính CMCase của các loài nấm mốc theo thời gian (UI/ml) Thời gian (ngày) Nấm mốc 2 3 4 5A.Niger0,0400,0530,033 0,028A.awamori0,0470,0670,047 0,032A.aculactum0,0290,0660,047 0,036P.citrinum0,034 0,1020,1230,10048 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN0.000.020.040.060.080.100.120.140 1 2 3 4 5 6Thời gian (ngày)CMCase (UI/ml)A.NigerA.awamoriA.aculactumP.citrinumHình 4.2- Đồ thò biểu diễn hoạt tính CMCase theo thời gian của 4 loài nấm mốc4.1.2.2. Nhận xét và bàn luậnDựa vào đồ thò 4.2 ta thấy rằng nấm mốc P.citrinum có hoạt tính CMCase cao nhất. Trong thí nghiệm này ta thấy các giống Aspergillus có hoạt tính enzym cao ở ngày thứ 3 còn P.citrinum ở ngày thứ 4. Tuy tốc độ phát triển của A.Niger, A.awamori, A.aculactum nhanh hơn P.citrinum nhưng hoạt tính enzym cao nhất của chúng thì lại thấp hơn. So sánh hoạt tính cao nhất của các loài này ta thấy loài A.Niger bằng 43%, A.awamori bằng 55%, A.aculactum bằng 54% hoạt tính của P.citrinum.Trong thực tế người ta thường sản xuất enzym cellulase từ A.Niger, T.reesei, A.awamori. Có rất ít nghiên cứu trên các loài Penicillium do tốc độ phát triển chậm và thường trong quá trình phát triển chúng tạo ra các chất kháng sinh gây khó khăn cho quá trình tinh sạch enzym sau này. Nhưng theo thí nghiệm trên đây thì loài có khả năng sinh hoạt tính enzym cao nhất là P.citrinum, đây có thể là một hướng nghiên cứu mới để sản xuất enzym cellulase. Mặt khác ở đây ta chỉ khảo sát hoạt tính CMCase biểu thò hoạt tính enzym EG. Còn hoạt tính enzym CBH và β-glucosidase thì chưa khảo sát nên ta chỉ có thể kết luận loài này sinh tổng hợp enzym EG cao nhất trong các loài nấm mốc đã chọn.49 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN4.2. nh hưởng nguồn carbon (cellulose) đến khả năng sinh tổng hợp enzym 4.2.1. T hí nghiệm 3: chọn nguồn carbon thích hợp cho nấm mốc P.citrinum Rơm, bã mía, mùn cưa sau khi xử lý được dùng làm nguồn carbon cho vào môi trường nuôi cấy với hàm lượng 1%. Sau 4 ngày ta đo hoạt tính enzym trong dòch nuôi cấy và chọn ra nguồn carbon thích hợp nhất cho nấm mốc P.citrinum.4.2.1.1. Kết quảBảng 4.2- Hoạt tính enzym của nấm mốc P.citrinum trên 3 nguồn carbon khác nhauNguồn carbon Rơm Bã mía Mùn cưaCMCase (UI/ml)0,911 0,755 0,2234.2.1.2. Nhận xét và bàn luậnDựa vào bảng kết quả trên thì cơ chất rơm là tốt nhất đối với loài nấm mốc này. Từ kết quả trên thì môi trường rơm là tốt nhất.Bảng 4.3-Thành phần của nguyên liệu rơm, bã mía, mùn cưa [20]Cơ chất Cellulose (%) Hemicellulase (%)Lignin (%)Rơm 38,2 24,7 23,4Bã mía 50,0 30,0 18,0Mùn cưa 41,9 21,6 27,1Dựa vào bảng trên ta thấy nếu dựa trên hàm lượng cơ chất thì đáng lẽ bã mía phải cho hàm lượng đường và hoạt tính enzym cao hơn. Thế nhưng kết quả thí nghiệm lại hoàn toàn khác.Ta thấy rằng hàm lượng đường và hoạt tính enzym trên nguyên liệu rơm là cao nhất, kế đến bã mía và thấp nhất là mùn cưa. Nghiên cứu của Solomon et al. thủy phân bã mía, mùn cưa và lõi bắp bởi nấm mốc A.flavus thì mùn cưa có hoạt tính enzym cao nhất (0,0743UI/ml), bã mía (0,0573 UI/ml) và lõi bắp (0,0502 UI/ml) [7]. Theo như kết quả nghiên cứu thì hoạt tính CMCase trên mùn cưa là 0,223UI/ml cao hơn kết quả nghiên cứu của Solomon et al. (2003) 3 lần; còn trên bã mía là 0,755 UI/ml cao hơn kết quả của Solomon et al. (2003) 13 lần. Như vậy loài 50 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬNnấm mốc P.citrinum có khả năng sinh hoạt tính CMCase cao hơn rất nhiều so với loài A.flavus trong nghiên cứu của Solomon et al. mặc dù trên cùng một cơ chất. Tuy nhiên điều này cũng phụ thuộc rất nhiều yếu tố. Khi thủy phân cơ chất ligno-cellulose thì thành phần gây cản trở khả năng tiếp xúc enzym với cơ chất cellulose chính là lignin. Lignin có cấu trúc vô cùng vững chắc rất khó phân cắt. Việc tiền xử lý nguyên liệu bằng NaOH là nhằm mục đích phá vỡ liên kết của lignin, nhưng việc xử lý này chỉ làm giảm được ½ lượng lignin. Tuy nhiên nguyên liệu khác nhau khả năng giảm lignin cũng khác nhau. Mặt khác, tỉ lệ vùng kết tinh và vùng vô đònh hình trên nguyên liệu khác nhau thì khác nhau. Cây càng lâu năm thì lượng cellulose kết tinh càng nhiều. Chính vì vậy mà hàm lượng cellulose kết tinh của mùn cưa là cao nhất, kế đến là bã mía và cuối cùng là rơm. Như vậy có thể rằng loài nấm mốc này có khả năng sản sinh lượng lớn enzym EG – một loại enzym cellulase có khả năng phân cắt tốt trên cơ chất cellulose vô đònh hình. Nhìn chung theo kết quả này thì loài nấm mốc P.citrinum hứa hẹn rất nhiều khả năng ứng dụng để sản xuất enzym cellulase trong công nghiệp.4.2.2. T hí nghiệm 4: khảo sát hàm lượng rơm tốt nhất cho vào môi trường nuôi cấyTa tiến hành thí nghiệm ở các nồng độ rơm 0,5%, 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3%, 3,5%. 4.2.2.1 Kết quả thí nghiệmBảng 4.4- Hoạt tính CMCase của P.citrinum với các nồng độ rơm khác nhau51 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬNRơm(%) CMCase(UI/ml)0,50,3831,00,9621,51,1112,01,1502,51,0223,00,9533,50,8320.00.20.40.60.81.01.21.40.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0nồng độ rơm(%)CMCase(UI/ml)Hình 4.3- nh hưởng của nồng độ rơm đến hoạt tính enzym cellulase4.2.2.2 Nhận xét và bàn luậnDựa vào đồ thò trên ta thấy ở nồng độ 2% thì hoạt tính CMCase là cao nhất. Nồng độ rơm cao hơn 2% thì hoạt tính enzym giảm. Đó là do nồng độ cơ chất cao tạo ra áp suất thẩm thấu lớn ức chế khả năng sinh tổng hợp enzym của nấm mốc. Mặt khác sự tạo thành sản phẩm cellobiosa và các cellodextrin mạch ngắn trong quá trình thủy phân cellulose cũng gây ức chế đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm mốc. Cellobiosa có khả năng ức chế cả enzym EG và CBH. Sự giảm hoạt tính cũng có 52 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬNthể là do thiếu nguồn dinh dưỡng khác như nguồn nitơ, nguồn khoáng,…hoặc do sự tạo thành liên kết đặc biệt của enzym với cơ chất làm giảm tính hoạt động của enzym.Theo [10] nghiên cứu sử dụng phế liệu nông nghiệp sản xuất enzym cellulase từ A.Niger thì hàm lượng nguồn carbon tốt nhất là 5%. Có sự khác biệt trong kết quả nghiên cứu là do sự khác nhau về loài nấm mốc. Mỗi loài nấm mốc có khả năng chòu áp suất thẩm thấu khác nhau. Nhưng cũng có thể là do môi trường nuôi cấy khác nhau, nguồn gốc cơ chất khác nhau. Một số nghiên cứu khác như từ vi khuẩn Thermomonospora curvata [20] sử dụng nguồn carbon là sợi cotton thì hàm lượng tối ưu là 0,8%; Chaetomium globosum [16] nguồn carbon là sợi cotton thì tối ưu là 1%. 4.3. nh hưởng nguồn nitơ đến khả năng sinh tổng hợp enzym4.3.1 Thí nghiệm 5: chọn nguồn nitơ Ta tiến hành thí nghiệm trên 3 mẫu: mẫu có bổ sung pepton 0,5%, mẫu có yeast extract 0,5%, và mẫu không bổ sung cả 2 thành phần trên. 4.3.1.1. Kết quả Bảng 4.5- Hoạt tính CMCase của P.citrinum với các nguồn nitơ bổ sung khác nhauCMCase(UI/ml)None 0,572Pepton 1,108Yeast extract1,0924.3.1.2. Nhận xét và bàn luậnDựa vào kết quả trên ta thấy rằng pepton và yeast extract có ảnh hưởng như nhau đến hoạt tính enzym celullase. Vì vậy ta chọn nguồn bổ sung là pepton. Khi không bổ sung pepton hay Yeast extract thì hoạt tính CMCase chỉ bằng 50% khi có bổ sung. Như vậy ta thấy rằng môi trường CZ thiếu nguồn nitơ cho loài nấm mốc khảo sát. 53 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬNNguồn nitơ rất cần cho sự sinh trưởng và phát triển của VSV mặc dù việc bổ sung vào môi trường nuôi cấy với hàm lượng rất nhỏ. Bản thân môi trường CZ cũng có chứa nguồn nitơ dưới dạng muối vô cơ nhưng với hàm lượng rất thấp. Như vậy trong quá trình sinh trưởng và phát triển, ngoài nguồn nitơ vô cơ VSV còn cần bổ sung thêm nguồn nitơ hữu cơ như pepton, yeast extract hay meat extract. 4.3.2 Thí nghiệm 6: chọn hàm lượng pepton bổ sung tốt nhất. Tiến hành thí nghiệm với nồng độ pepton bổ sung vào môi trường nuôi cấy là 0,1%, 0,3%, 0,5%, 0,7%, 0,9%.4.3.2.1. Kết quảBảng 4.6- Hoạt tính CMCase ứng với nồng độ pepton khác nhauPepton(%)CMCase (UI/ml)0.10,5200.30,6450.51,0110.70,8570.90,87454 [...]... 0, 644 0 ,40 0 4 0,600 1,076 1,636 1 ,42 8 1,096 1,0 64 0,8 64 5 0,2 84 0 ,47 6 0,7 84 0,960 0,632 0 ,40 0 0,228 6 0,228 0 ,43 6 0,700 0,908 0,828 0,716 0,520 7 0,220 0,360 0,6 84 0, 848 0,676 0 ,47 6 0,356 8 0,128 0,220 0 ,48 0 0,820 1,036 1,1 24 0,856 pH Sau đây là đồ thò biểu diễn hoạt tính CMCase theo thời gian ứng với các pH khác nhau: pH=3 pH =4 1 .4 1.0 CMCase(UI/ml) CMCase(UI/ml) 1.2 0.8 0.6 0 .4 0.2 0.0 0 1 2 3 4 5... enzym sản xuất từ loài nấm mốc này hứa hẹn rất lớn khả năng ứng dụng trong sản xuất chế phẩm enzym thương mại Theo [22] nghiên cứu sinh tổng hợp enzym của nấm mốc A.Niger nhiệt độ tối thích cho enzym là 40 0C, enzym này ổn đònh hoạt tính ở nhiệt độ . (ngày)pH1 2 3 4 5 6 730,512 0,8361,1921,000 0,720 0, 644 0 ,40 040 ,600 1,0761,6361 ,42 8 1,096 1,0 64 0,8 645 0,2 84 0 ,47 6 0,7 840 ,9600,632 0 ,40 0 0,22860,228 0 ,43 6 0,7000,9080,828. 3, 4, 5, 6, 7, 8. 4. 4.1. Kết quả 55 pH =40 .00.20 .40 .60.81.01.21 .41 .61.80 1 2 3 4 5 6 7 8thời gian (ngày)CMCase(UI/ml)CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬNBảng 4. 7