Luận văn tốt nghiệp nghiên cứu sản xuất enzyme celllulase từ nấm mốc - Chương 2

Luận văn tốt nghiệp nghiên cứu sản xuất enzyme celllulase từ nấm mốc - Chương 2.

CHÖÔNG 2: TOÅNG QUAN3 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN2.1 Cấu tạo và tính chất của ligno-celluloseTrong tự nhiên phế liệu chứa ligno-cellulose là nguồn chất hữu cơ thay thế được tạo ra trong quá trình quang hóa ở thực vật. Trong công nghiệp nó được tạo ra trong quá trình sản xuất gỗ, giấy và bột giấy. Ligno-cellulose chiếm khoảng 60% toàn bộ phế liệu từ gỗ được sản xuất trên trái đất.Ligno-cellulose có cấu trúc vững chắc, dày đặc rất khó để phân cắt. Tuy nhiên nó là nguồn giàu carbon và năng lượng hóa học, do đó việc tận dụng nguồn phế liệu ligno-cellulose là vấn đề rất cần thiết để duy trì vòng tuần hoàn carbon toàn cầu. Về mặt hóa học, chúng gồm 2 polymer mạch thẳng cellulose và hemicellulose và một polymer có cấu trúc 3 chiều lignin. Cellulose được bao quanh bởi phân tử hemicellulose và lignin.Hình 2.1– Cấu trúc của ligno-cellulose4 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN2.1.1 Cellulose [2]Cellulose là polysaccharide chủ yếu của thành tế bào thực vật. Trong bông nó chiếm trên 90%, còn trong gỗ hơn 50%. Ngoài ra, người ta còn thấy chúng có nhiều ở tế bào một số loài VSV. tế bào thực vật và ở tế bào một số loài VSV, chúng tồn tại ở dạng sợi. Khi đun sôi với acid sulfuric đặc, cellulose sẽ chuyển thành glucose còn khi thủy phân trong điều kiện nhẹ nhàng sẽ tạo thành disacarit cellobiose. Cellulose không có trong tế bào động vật. Chúng là một homopolimer mạch thẳng, được cấu tạo bởi các β-D-glucose-pyranose. Các thành phần này liên kết với nhau bởi liên kết β-1,4 glucoside. Tinh bột cũng được cấu tạo bởi các glucose này và bằng liên kết α-1,4 glucoside. Điểm khác biệt là tinh bột chứa các gốc glucose phân nhánh còn cellulose chứa các glucose không phân nhánh. Các gốc glucose trong cellulose thường lệch một góc 1800 và có dạng như một chiếc ghế bành. Cellulose thường chứa 10.000-14.000 gốc đường và được cấu tạo như sau:Đầu không khử Đầu khửHình 2.2- Cấu tạo phân tử cellulose.Trọng lượng phân tử của cellulose khoảng từ 50000-2500000 Dalton. Các phân tử cellulose kết hợp với nhau nhờ lực hút Van der war và liên kết hydro.Các phân tử cellulose tạo nên sợi sơ cấp có đường kính khoảng 3nm. Các sợi sơ cấp kết hợp với nhau tạo thành vi sợi. Trong điều kiện tự nhiên, các vi sợi thường không đồng nhất, chúng thường tồn tại 2 vùng:- Vùng kết tinh: các mạch cellulose kết với nhau theo một trật tự đều đặn nhờ liên kết hydro nối nhóm hydroxyl thứ nhất của mạch này với nhóm hydroxyl ở mạch cacbon của mạch khác. û vùng này cellulose rất bền vững dưới tác 5 CHƯƠNG 2: TỔNG QUANđộng của điều kiện bên ngoài. Enzym cellulase chỉ có tác dụng ở bề mặt hệ sợi ở vùng này. - Vùng vô đònh hình: các mạch liên kết với nhau nhờ lực Vander Waals. ƠÛ vùng này cellulose có cấu trúc không chặt và dễ bò tác động bởi các yếu tố bên ngoài. Khi gặp nước, chúng dễ bò trương phồng lên, enzym cellulase rất dễ tác động, làm thay đổi toàn bộ cấu trúc của chúng. Chiều dài phân tử cellulose trong vùng vô đònh hình thường lớn gấp hàng chục lần so với chiều dài của phân tử cellulose kết tinh. Các cây gỗ lâu năm thường chứa lượng cellulose kết tinh nhiều, các cây thảo mộc ngược lại, chứa nhiều cellulose vô đònh hình.Trong phân tử cellulose có nhiều liên kết hydroxyl tồn tại dưới dạng tự do, hydrogen của chúng dễ bò thay thế bởi một số gốc hoá học như metyl hoặc gốc acetyl tạo nên các dẫn xuất ete hoặc este của cellulose. Một trong những dẫn xuất được ứng dụng rất nhiều là CMC, trong đó một số nhóm hydroxyl của cellulose được thay thế bằng gốc –OCH2COOH.Hình 2.3–Cấu trúc của CMCTrong thiên nhiên, khi thực vật và VSV có chứa cellulose bò chết, cellulose của chúng chỉ bò phân hủy bởi cả một tập đoàn VSV. Các loài VSV sẽ thay phiên nhau phân hủy cellulose để tạo ra mùn và từ đó các thành phần cấu tạo của cellulose lại được đi vào các con đường chuyển hóa trong chu trình chuyển hóa vô tận của thiên nhiên.6 CHƯƠNG 2: TỔNG QUANTrong thực vật, cellulose thường tồn tại một lượng rất lớn. Số lượng cellulose thường không đều ở các cơ quan khác nhau trong thực vật. Người ta thấy rằng, lượng cellulose ít nhất ở lá và nhiều nhất ở thân cây, đặc biệt ở sợi bông, cellulose có thể chiếm đến 80-90%. VSV cấu trúc của cellulose không bền và không theo một trật tự như ở thực vật. đó, cellulose thường thuộc loại vô đònh hình. Chính vì thế việc phân hủy chúng thường rất dễ thực hiện.2.1.2 Hemicellulose [1]Hemicellulose là polysaccharide có phân tử lượng nhỏ hơn phân tử lượng của cellulose rất nhiều. Chúng thường được cấu tạo từ 150 gốc đường. Các gốc đường này được nối với nhau bằng các liên kết β-1,4; β-1,3; β-1,6 glucoside. Chúng thường là những mạch ngắn, phân nhánh. Cấu trúc của hemicellulose không bền, chúng không hòa tan trong nước nhưng dễ dàng bò phân giải bởi acid loãng hoặc kiềm. Hemicellulose cũng là thành phần của tế bào thực vật và tồn tại chủ yếu ở các phần như: vỏ hạt, bẹ ngô, cám, rơm rạ, trấu. Khi thủy phân hemicellulose sẽ thu được các monosaccharide thuộc nhóm hexose như manose, galactose, nhóm pentose như arabinose, xilose. Tùy theo trong thành phần của hemicellulose có chứa monosaccharide nào mà nó sẽ có những tên tương ứng như mannan, galactan, và pentozan. Các polysaccharide như mannan, galactan, araban và xilan đều là các chất phổ biến trong thực vật, chủ yếu ở các thành phần của màng tế bào của các cơ quan khác nhau như: gỗ, rơm rạ,… Trong thiên nhiên, loại hemicellulose dễ gặp nhất là xylan. Xylan thường thấy nhiều trong rơm, rạ (chiếm khoảng 30%), cây lá rộng (chiếm khoảng 20-25%). những cây lá kim thường chứa ít xylan. 2.1.3 Lignin [21]Lignin là một hợp chất cao phân tử, chúng có nhiều ở thực vật bậc cao. cây gỗ, lignin chiếm tới 20-30%. Trong thành phần của lignin, carbon chiếm tới 69%, hydro chiếm 7% và oxy chiếm 24%7 CHƯƠNG 2: TỔNG QUANLignin có cấu tạo vô đònh hình, không tan trong nước và trong acid vô cơ. Dưới tác dụng của bisulfite natri và H2SO4 lignin bò phân giải tạo ra các hợp chất thơm. Trong thực vật chúng như chất ximang liên kết các tế bào lại với nhau, làm tăng độ bền cơ học cho tế bào, tăng khả năng chống thấm nước, ngăn chặn các độc tố, các VSV từ bên ngoài.Trong suốt quá trình phát triển của thực vật, lignin được tạo ra, không bò biến đổi sinh lý. Chúng có cấu tạo rất phức tạp, tạo thành từ sự ngưng tụ của các loại rượu khác nhau.8 CHƯƠNG 2: TỔNG QUANHình 2.4–Cấu tạo phân tử lignin2.2 Enzym cellulase [1,2,4,23]2.2.1Phân loại enzym cellulase [4]9 CHƯƠNG 2: TỔNG QUANTên gọi cellulase dùng để chỉ chung cho các enzym tham gia phân cắt hợp chất cellulose. Tất cả các enzym cellulase đều có tác dụng phân cắt liên kết β-1,4 giữa 2 đơn vò glucose và được các nhà khoa học phân ra làm 3 nhóm chủ yếu sau đây: 1,4 β-D-glucan cellobiohydrolase (EC.3.2.1.91) (CBH). Enzym cắt đầu cuối của chuỗi cellulose để tạo thành cellobiose. Enzym này còn có một loạt các tên khác như: cellobiohydrolase, cellobiosidase và avicellase.  1,4 β-D-glucan –4- glucanohydrolase (EC.3.2.1.4) (EG). Enzym này tham gia phân giải liên kết β-1,4 glucoside trong cellulose và β-D-glucanase. Sản phẩm của quá trình phân giải là cellodextrin, cellobiose, và glucose. Enzym này còn có một loạt tên khác như: endoglucanase, endo 1,4 β-D-glucanase, C-cellulase. β-D-glucoside glucohydrolase (EC.3.2.1.21). Enzym này tham gia phân hủy cellobiose tạo thành glucose. Chúng không có khả năng phân hủy cellulose nguyên thủy. Trong các tài liệu khoa học, chúng có tên là cellobiase và β-glucosidase. Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng các enzym EG có tác dụng phân cắt tốt trên cellulose vô đònh hình và đặc biệt có tác dụng trên cellulose biến tính như CMC, HEC. Vì vậy, để xác đònh hoạt tính enzym này người ta thường sử dụng cơ chất là CMC. Còn các enzym CBH thì có tác dụng trên cellulose kết tinh, ít trên cellulose vô đònh hình và hầu như không có tác dụng phân cắt cellulose biến tính. Trong hệ thống enzym CBH thì enzym CBH I tấn công từ đầu khử, trong khi CBH II tấn công vào đầu không khử của chuỗi cellulose. Sự thủy phân cellulose là sự kết hợp của 3 loại enzym trên. Đầu tiên enzym EG tấn công vào giữa mạch cellulose và giải phóng các đầu cuối của chuỗi. Tiếp sau đó các enzym CBH tiếp tục phân cắt để tạo sản phẩm cuối là cellobiose. Việc phân cắt cuối cùng tạo thành glucose là nhờ vào enzym thứ ba β-glucosidase. Vì vậy tuy rằng enzym β-glucosidase không có tác dụng trên chuỗi cellulose nhưng nó vẫn được xếp vào hệ thống enzym cellulase. 10 CHƯƠNG 2: TỔNG QUANBảng 2.1 –Sự phân loại enzym phân cắt 1,4-β-glucansTên hệ thống Tên thường gọi EC No. Cơ chấtLiên kết thủy phânSản phẩm chínhEndo 1,4-β-D-glucan-4-glucanohydrolaseCellulase, endoglucanase (EG)3.2.1.4Cellulose, 1,3-1,4-β-glucans1,4-β 1,4-β-dextrins, 1,3-1,4-β-dextrins1,3-1,4-β-D-glucan-4-glucanohydrolaseLichenase, β-glucanase 3.2.1.73Lichenin, 1,3-1,4-β-glucansKế 1,4-β sau 1,3-β-Hỗn hợp 1,3-1,4-β-dextrins1,3-β-D-glucan-3/4-glucanohydrolaseLaminarinase 3.2.1.6Laminarin, 1,3-1,4-β-glucanKế liên kết 1,4-β- hoặc 1,3-β- và sau 1,3-β-Hỗn hợp 1,3-1,4-β-dextrins1,3-β-D-glucan-3-glucanohydrolaseLaminarinase3.2.1.39Laminarin, pachyman (1,3-1,4-β-glucans)1,3-β 1,3-β-dextrins (1,4-β-dextrins)Exo 1,4-β-D-glucan-cellobiohydrolaseCellobiohydrolase (CBH) 3.2.1.91Cellulose, 1,3-1,4-β-glucans1,4-β Cellobiose ,4-β-D-glucan-glucohydrolaseExoglucanase 3.2.1.741,4-β-glucans1,4-β glucoseβ-glucosidase Cellobiase 3.2.1.21β-D-glucosides 1,4-β1,3-β1,6-βglucose11 CHƯƠNG 2: TỔNG QUANTuy nhiên sự phân loại này chưa thật sự thỏa đáng khi một vài enzym CBH cũng có hoạt tính như enzym EG. Sự phân loại enzym cellulase trở nên phức tạp hơn khi chúng có hoạt tính trên polysaccharide như xylan. Do đó khóa phân loại mới cho những enzym này cũng như các enzym thủy phân liên kết glucoside là dựa trên sự tương đồng về cấu trúc của chúng. Điều này cần những thông tin về trật tự sắp xếp các aminoacid của chúng. Hiện nay người ta phân loại các enzym thủy phân liên kết glycoside thành 111 nhóm, trong đó enzym cellulase có trong 11 nhóm (từ nhóm 5 đến nhóm 10, 12, 26, 44, 45, và 48). [23]. Trong bài này, tên enzym được sử dụng theo cách phân loại cũ.2.2.2Mối quan hệ cấu trúc-chức năng trong enzym cellulase [4]Enzym có cấu trúc 2 phần gồm phần xúc tác và phần liên kết với cơ chất là đặc trưng cho enzym phân cắt cellulose được thu nhận từ cả nấm mốc và vi khuẩn. Sự tồn tại của phần liên kết với cơ chất cũng phổ biến trên những enzym khác tham gia phân cắt cơ chất rắn. Trong enzym của nấm mốc, phần liên kết với cellulose (CBD) được liên kết với phần xúc tác bởi những liên kết tách biệt hoàn toàn giữa 2 phần này. CBD có thể là đầu C hoặc đầu N của enzym. Trong một vài trường hợp như trong enzym E4 của vi khuẩn Thermomonospora fusca, CBD là một phần cấu trúc bên trong của enzym. Một vài vi khuẩn được nghiên cứu sản xuất enzym có cấu trúc 2 phần như trên. Nhưng có điểm khác biệt là các phần được liên kết đồng hoá trò và phần xúc tác tham gia thủy phân cellulose và hemicellulose cũng như vùng liên kết với cơ chất. Hình 2.7– Cấu trúc 2 phần của enzym CBH từ Trichoderma reesei. Phần xúc tác lớn được liên kết với phần liên kết với cellulose nhỏ hơn. 12 [...]... insolens Nấm mốc Enzym Tên mới Kích pI pH tối thích thước(kDa) EGI 5 0-5 5 4,6 4, 5-5 ,5 EGII Cel5A 48 5,5 4, 5-5 ,5 EGIII Cel12A 25 7,4 4, 5-5 ,5 EGIV Cel61A 37 EGV Cel45A 23 2, 8-3 ,0 4, 5-5 ,5 CBHI Cel7A 5 9-6 8 3, 5-4 ,2 4, 5-5 ,5 CBHII Cel6A 5 0-5 8 5, 1-6 ,3 4, 5-5 ,5 BGLI 71 8,7 4,6 BGLII T.reesei Cel7B 52 4,8 4,0 4, 5-5 ,5 EGI 50 5,5 7, 0-8 ,5 EGII Cel5A 50 7,0 7, 0-8 ,5 EGIII Cel12A 26 5 ,2 7, 0-8 ,5 EGV Cel45A 43 5 ,2 7, 0-8 ,5... trường Thông thường để nuôi cấy nấm mốc người ta lắc ở tốc độ 20 0vòng/phút, mức độ thông hơi là1vvm 4.4.4 Hệ thống enzym cellulase từ các VSV [4] b) Cellulase từ nấm mốc  Cellulase từ Trichoderma reesei 22 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN T.reesei là VSV sản xuất cellulase được nghiên cứu nhiều nhất Nó sản xuất 5 loại enzym endoglucanase, 2 loại enzym CBH và 2 loại β-glucosidase Bảng 2. 2– Hệ enzym cellulase của Trichoderma... 1, 3-1 , 4- glucan, ngoài ra chúng cũng có tác dụng trên 1, 3-1 , 4- -glucanase, lichenase và laminarinase 1, 3-1 , 4- -glucan và arabinoxylan là thành phần chủ yếu trong thành tế bào ngũ cốc và 1, 3-1 , 4- -glucan tồn tại số lượng lớn trong lúa mạch và yến mạch Bảng 2. 3-Thành phần hóa học của các loại ngũ cốc Ngũ cốc Lúa mì Lúa mạch Yến mạch Lúa mạch đen Tinh bột(%) 6 0-7 3 5 3-6 7 3 9-5 5 5 0-6 3 5, 5-7 ,8 4, 0-1 1,0 3, 2- 1 2, 6... hóa học của các loại ngũ cốc Ngũ cốc Lúa mì Lúa mạch Yến mạch Lúa mạch đen Tinh bột(%) 6 0-7 3 5 3-6 7 3 9-5 5 5 0-6 3 5, 5-7 ,8 4, 0-1 1,0 3, 2- 1 2, 6 Protein (%) 9-1 7 8-1 3 1 1-1 5 Chất béo(%) 2, 1-3 ,8 0, 9-4 ,6 5, 0-9 ,0 8-1 0,0 8-1 2 2, 0-3 ,5 β-glucan(%) Xylan(%) 0, 5-3 ,8 3, 0-1 0,6 2, 2- 5 ,4 1, 0-3 ,5 Vì vậy, cellulase là enzym hữu ích trong chế biến ngũ cốc Phần lớn cấu trúc βglucan khi hòa tan trong nước tạo độ nhớt rất cao... chóng 25 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN Cellulase từ vi khuẩn trong nhiều trường hợp được nghiên cứu có hoạt tính cao hơn cellulase từ nấm mốc Tuy nhiên, nhìn chung vi khuẩn sản xuất enzym ngoại bào số lượng thấp hơn nấm mốc Vài loại cellulase của vi khuẩn tồn tại như một phần của cellulosome Do đó cellulase từ vi khuẩn được sản xuất ở quy mô công nghiệp cùng với các loại VSV khác thích hợp hơn Những loại sản phẩm... P.pinophilum sản 24 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN xuất chủ yếu là endoglucanase EG II và CBH I của P.janthinellum thì tương đồng với EG II và CBH I của T.reesei Giữa các loài nấm mốc trong dạ cỏ của bò thì Neocallumastix frontalis được nghiên cứu nhiều nhất Nó sản xuất cellulosome – một phức hệ protein bao gồm EG, CBH, và xylanase Loài khác Piromyces sp cũng sản xuất phức hệ cellulase tương tự Đặc biệt là các loài nấm mốc. .. Cellulase từ nấm mốc khác Nhiều loài Aspergilus spp sản xuất enzym cellulase Loài A.aculeatus sản xuất một vài loại cellulase EG V, EG I, và CBH I có cấu trúc tương tự như EG II, EG III và CBH I từ T.reesei Những loài nấm mốc không có hoạt tính cellulase như A.oryzae thì thường được sử dụng là VSV nhận để chuyển gen cellulase từ những loài nấm mốc khác Giống Penicillium cũng có khả năng sản xuất cellulase,... enzym là 550C 27 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN  pH tối thích của enzym là pH=5 Sản xuất cellulase từ Aspergillus fumigatus[8] Bảng 2. 5– Hoạt tính của enzym cellulase từ Aspergillus fumigatus Đo hoạt tính CMCase Nhiệt Nguồn carbon pH độ Đo hoạt tính FPA Hoạt tính (UI/ ml) 0 ( C) pH Nhiệt độ Hoạt tính (UI/ (0C) ml) Xơ dừa 5 40 0 ,29 2 ± 0,005 7 40 0,339 ± 0,003 Mùn cưa 6 50 0 ,27 2 ± 0,003 7 40 0,334 ± 0,0 02 Trong đó... bằng cơ chất là giấy lọc Thời gian nuôi là 5 ngày Sản xuất cellulase từ Bacillus pumilus[9]  Thời gian nuôi cấy tối ưu 24 h  Nhiệt độ tối thích của enzym 600C  pH tối thích của enzym pH=6 Hoạt tính CMCase 0,079UI/ml Sản xuất cellulase từ Aspergillus aculeatus[ 12]  Thời gian nuôi cấy tối ưu 4 ngày Hoạt tính CMCase 5,5UI/ml Sản xuất enzym cellulase từ Chaetomium globosum [16] Sử dụng nguồn carbon là... tính Cx đo được là 183 mUI/ml Sản xuất cellulase từ Aspergillus flavus [7] Trong nghiên cứu này sử dụng 3 nguồn carbon là bã mía, mùn cưa, và lõi bắp Kết quả: hoạt tính CMCase trên cơ chất mùn cưa là 0,0743UI/ml, bã mía là 0,0573UI/ml, lõi bắp là 0,05 02 UI/ml ở thời gian là 12 giờ Cơ chất mùn cưa cho hoạt tính enzym cao nhất Sản xuất cellulase từ Thermomonospora curvata [20 ] Cơ chất sử dụng là sợi cotton . 1, 4- -D-glucan-4-glucanohydrolaseCellulase, endoglucanase (EG)3 .2. 1.4Cellulose, 1, 3-1 , 4- -glucans1, 4- 1, 4- -dextrins, 1, 3-1 , 4- -dextrins1, 3-1 , 4- -D-glucan-4-glucanohydrolaseLichenase,. 1, 3-1 , 4- -dextrins1, 3-1 , 4- -D-glucan-4-glucanohydrolaseLichenase, β-glucanase 3 .2. 1.73Lichenin, 1, 3-1 , 4- -glucansKế 1, 4- sau 1, 3- -Hỗn hợp 1, 3-1 , 4- -dextrins1, 3- -D-glucan-3/4-glucanohydrolaseLaminarinase