Luận văn nghiên cứu tạo chế phẩm Lactobacillus acidophilus - Chương 2.
Chương 2: Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu Luận văn tốt nghiệp CHƯƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ‐ 24 ‐ Chương 2: Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Luận văn tốt nghiệp Nguyên vật liệu 2.1.1 Địa điểm nghiên cứu - Phòng thí nghiệm Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa - Tp.HCM, số 268 Lý Thường Kiệt, Quận 10, Tp.HCM Phòng thí nghiệm vi sinh, Trường Cao đẳng Kinh tế – Công nghệ Tp.HCM, số 547/M8 Thành Thái, P14, Quận 10, Tp.HCM 2.1.2 Nguyên liệu - Sữa gầy Lactose - Whey powder - Giống vi khuẩn lactic: Lactobacillus acidophilus từ chế phẩm ANTIBIO 2.1.3 Dụng cụ thiết bị - Dụng cụ: Ống nghiệm, giá đỡ ống nghiệm Eppendorf Que cấy vòng, que cấy trải, que cấy thẳng Đóa petri Buret Pipet Micropipet, đầu type Đũa thuỷ tinh Erlen - Becher Thiết bị: Tủ ấm Tủ sấy Nồi hấp autoclave Tủ lạnh Tủ cấy Máy đo pH ‐ 25 ‐ Chương 2: Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu Luận văn tốt nghiệp Máy đồng hoá Máy khuấy từ Thiết bị sấy phun Máy đo độ hấp thu Kính hiển vi Cân điện tử số lẻ, cân phân tích số lẻ Bếp điện 2.1.4 Môi trường hoá chất - Môi trường MRS broth Môi trường MRS – agar Môi trường huyết sữa Môi trường carbonate – agar Môi trường thử khả lên men nguồn carbonhydrate Thuốc thử Uphenmen 2.1.5 Phương pháp xử lý số liệu - Phần mềm Excel Phần mềm R ‐ 26 ‐ Chương 2: Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu 2.2 Luận văn tốt nghiệp Phương pháp nghiên cứu Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu ‐ 27 ‐ Chương 2: Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu Luận văn tốt nghiệp 2.2.1 Phương pháp phân lập chọn giống vi khuẩn L.acidophilus [4, 8] - Nguyên tắc: dựa pha loãng kết hợp với nuôi cấy môi trường dinh dưỡng chọn lọc cho vi sinh vật cần phân lập để tạo chủng - Cách tiến hành: gram mẫu 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 Môi trường MRS agar Cấy giữ giống Môi trường MRS agar Hình 2.2: Quy trình phân lập chọn giống vi khuẩn Lactobacillus acidophilus chủng Bước 1: Phân lập Pha loãng mẫu dung dịch nước muối sinh lý 0,85% nồng độ pha loãng: 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7 Lấy 300μl giống cấy trải môi trường MRS – agar Nuôi ủ tủ ấm 37oC, 24h Bước 2: Chọn lọc giống lần Quan sát mẫu phân lập Chọn khuẩn lạc mọc rời riêng rẽ Cấy ria khuẩn lạc môi trường MRS – agar Nuôi ủ tủ ấm 37oC, 24h ‐ 28 ‐ Chương 2: Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu Luận văn tốt nghiệp Bước 3: Chọn lọc giống lần Quan sát chọn khuẩn lạc mọc rời riêng rẽ Cấy ria môi trường MRS – agar Cấy vào ống nghiệm thạch nghiêng để tiến hành giữ giống Nuôi ủ tủ ấm 37oC, 24h 2.2.2 Khảo sát đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá chủng L.acidophilus 2.2.2.1 Phương pháp xác định hình thái cách nhuộm gram [4] - Nguyên tắc: dựa khả bắt màu tế bào chết màng tế bào với thuốc nhuộm tím kết tinh iod Vi khuẩn gram dương có khả giữ phức chất tạo thành tím kết tinh iod xử lý cồn Vi khuẩn gram âm khả giữ phức chất xử lý cồn - Cách tiến hành: Lấy giọt huyền phù tế bào bôi lên lam kính Cố định vết bôi lửa đèn cồn Nhuộm với tím kết tinh phút Rửa lại vết bôi nước cất Nhuộm với Lugol phút Rửa vết bôi nước cất Tẩy cồn hết màu Rửa lại nước Để khô tự nhiên xem tiêu độ phóng đại X100 2.2.2.2 Thử nghiệm khả sinh acid môi trường CaCO3 – agar [8] - Nguyên tắc: môi trường acid, CaCO3 chuyển từ dạng trắng đục sang Do tế bào vi khuẩn sinh acid thải vào môi trường, acid tạo vòng tan xung quanh khuẩn lạc Đường kính vòng tan - lớn chứng tỏ khả sinh acid nhiều Cách tiến hành: Cấy điểm giống vi khuẩn môi trường CaCO3 Nuôi ủ 37oC 24h Quan sát ghi nhận xuất vòng tan ‐ 29 ‐ Chương 2: Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu Luận văn tốt nghiệp 2.2.2.3 Thử nghiệm khả sinh acid lactic [4] - Nguyên tắc: thuốc thử Uphemen tác dụng với acid lactic đổi màu từ tím sang vàng rơm Sự đổi màu mạnh lượng acid sinh nhiều - Cách tiến hành: Nuôi ủ chủng Lactobacillus acidophilus môi trường huyết sữa 37oC 24h Đem ly tâm 5000 vòng/phút phút, thu lấy dịch tiến hành bố trí thí nghiệm sau: Ống nghiệm 1: 5ml thuốc thử Uphemen + 0,7ml nước cất Ống nghiệm 2: 5ml thuốc thử Uphemen + 0,7ml môi trường không nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus acidophilus Ống nghiệm 3: 5ml thuốc thử Uphemen + 0,7ml acid lactic 2% Ống nghiệm 4: 5ml thuốc thử Uphemen + 0,7ml dịch môi trường nuôi vi khuẩn Quan sát ghi nhận đổi màu ống nghiệm (+): thuốc thử chuyển sang màu vàng rơm (–): thuốc thử giữ màu xanh tím 2.2.2.4 Thử nghiệm khả lên men nguồn carbonhydrate [8] - Nguyên tắc: vi sinh vật khác có khả sử dụng nguồn carbonhydrate khác để sinh trưởng Khi vi sinh vật sử dụng nguồn carbohydrate để lên men làm giảm pH môi trường Do khả lên men đánh giá làm giảm pH môi trường dẫn đến thay đổi màu sắc chất thị pH môi trường Chất thị pH sử dụng Phenol Red có pH 7,4 thị pH môi trường màu đỏ chuyển sang màu vàng pH môi trường giảm xuống 6,8 - Cách tiến hành: Cấy 1ml dịch giống Lactobacillus acidophilus vào 10ml môi trường thử khả lên men nguồn carbonhydrate chứa ống nghiệm như: saccharose, maltose, dextrose, lactose, sorbitol, maltose, mannose, sorbitol, glycerol Hàm lượng nguồn carbonhydrate bổ sung vào môi trường 20g/l Nuôi ủ 37oC 24h ‐ 30 ‐ Chương 2: Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu Luận văn tốt nghiệp Quan sát ghi nhận đổi màu môi trường Nếu môi trường chuyển sang màu vàng vi sinh vật sử dụng nguồn carbonhydrate tương ứng Nếu môi trường giữ nguyên màu đỏ Phenol Red vi sinh vật khả sử dụng nguồn carbonhydrate tương ứng 2.2.2.5 Quan hệ với oxy [9] - Nguyên tắc: nguyên tố oxy có mặt hầu hết thành phần quan trọng tế bào protein, carbonhydrate, lipid Sự có mặt oxy quan trọng tăng trưởng vi sinh vật Vi sinh vật hiếu khí cần oxy cho tăng trưởng, ngược lại vi sinh vật kỵ khí khả sử dụng oxy thiếu enzyme actalase làm tích tụ H2O2 làm chết tế bào Nhiều vi sinh vật có khả phát triển điều kiện có oxy gọi kỵ khí tùy tiện - Cách tiến hành: Sử dụng que cấy thẳng cấy vi khuẩn Lactobacillus acidophilus vào môi trường MRS agar chứa ống nghiệm (khoảng ½ ống nghiệm) Nuôi ủ 37oC 24h Quan sát sinh trưởng mức độ phát triển vi khuẩn dọc theo que cấy 2.2.2.6 Ảnh hưởng pH [22] - Nguyên tắc: Lactobacillus acidophilus sống khoảng pH rộng, chúng sống pH kiềm pH acid Chính đặc điểm yếu tố giúp cho Lactobacillus acidophilus sống hoạt động tốt đường ruột nên thường sử dụng để sản xuất probiotic - Cách tiến hành: Cấy 1ml dịch giống Lactobacillus acidophilus vào 10ml môi trường MRS broth chứa ống nghiệm pH sau: 3,5; 4; 5; 6; 7; Nuôi ủ 37oC 24h Tiến hành đo OD570nm ghi nhận kết ‐ 31 ‐ Chương 2: Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu Luận văn tốt nghiệp 2.2.2.7 Ảnh hưởng nhiệt độ [22] - Nguyên tắc: vi sinh vật loài nhạy cảm với nhiệt độ, khả thích nghi phát triển loài khác Lactobacillus acidophilus sống khoảng nhiệt độ 20 – 50oC - Cách tiến hành: Cấy 1ml dịch giống Lactobacillus acidophilus vào 10ml môi trường MRS broth Nuôi ủ nhiệt độ khác nhau: 20oC, 37oC, 40oC, 50oC 24h Tiến hành đo OD570nm ghi nhận kết 2.2.3 Phương pháp đếm khuẩn lạc [8] - Nguyên tắc: phương pháp cho phép xác định số tế bào vi sinh vật sống diện mẫu tế bào sống có khả phân chia tạo khuẩn lạc môi trường điều kiện nuôi cấy thích hợp - Cách tiến hành: Mẫu pha loãng thành dãy nồng độ khác Chọn nồng độ pha loãng liên tiếp mà dự kiến chứa số khuẩn lạc nằm khoảng 25 – 250 khuẩn lạc đóa Mỗi bậc pha loãng hút thể tích khoảng 0,1ml đem trải đóa Ủ nhiệt độ 37oC 48 sau đem đếm số khuẩn lạc Mật độ tế bào tính theo công thức sau: Trong đó: C (cfu/ml): số tế bào vi khuẩn ml mẫu N (cfu): tổng số khuẩn lạc đếm đóa ni: số đóa cấy nồng độ pha loãng thứ i Vi (ml): thể tích mẫu cấy đóa fi: độ pha loãng thứ i Trong đó: N (cfu/ml): mật độ tế bào thời gian khảo sát No (cfu/ml): mật độ tế bào ban đầu ‐ 32 ‐ Chương 2: Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu Luận văn tốt nghiệp 2.2.4 Phương pháp xác định đường cong sinh trưởng [1] - Nguyên tắc: mật độ tế bào xác định cách gián tiếp thông qua độ đục Khi pha lỏng có chứa nhiều phân tử không tan hình thành hệ huyền phù có độ đục phân tử diện môi trường lỏng cản trở ánh sáng Tế bào vi sinh vật diện môi trường lỏng làm môi trường trở nên đục Độ đục tỉ lệ với mật độ tế bào Do định lượng mật độ tế bào cách gián - tiếp thông qua đo độ đục máy so màu Cách tiến hành: Xây dựng đường cong sinh trưởng Lactobacillus acidophilus môi trường huyết sữa Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus nuôi môi trường huết sữa với tỷ lệ giống 10%, 37oC Khoảng lấy cấy trang môi trường MRS agar Dùng phương pháp đếm khuẩn lạc xác định mật độ tế bào (Cfu/ml) trong mẫu giống ban đầu Vẽ đồ thị đường cong sinh trưởng log(cfu/ml) – trục tung thời gian – trục hoành Xây dựng đường tương quan mật độ tế bào độ đục Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus nuôi môi trường huyết sữa với tỷ lệ giống 10%, 37oC 15 Pha loãng dịch huyền phù chứa vi khuẩn Lactobacillus acidophilus có mật độ thành huyền phù khác có độ đục đo OD570nm cho giá trị OD nằm trong khoảng 0,05 – 0,25 Vẽ đường tương quan tuyến tính log (cfu/ml) – trục tung OD570nm – trục hoành Xác định khoảng tuyến tính trục tung trục hoành ‐ 33 ‐ Chương 2: Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu Luận văn tốt nghiệp 2.2.5 Tối ưu hoá môi trường huyết sữa phương pháp quy hoạch thực nghiệm [5] 2.2.5.1 Khảo sát ảnh hưởng nhân tố sinh trưởng đến phát triển L.acidophilus - Yếu tố peptone: Bố trí thí nghiệm: Bảng 2.1: Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng peptone đến phát triển L.acidophilus STT Trong đó: Môi trường Thể tích môi Thể tích giống nuôi cấy trường (ml) cấy (ml): 10% MTP1 50 MTP2 50 MTP3 50 MTP4 50 5 MTP5 50 MTP6 50 MTP7 50 MTP1: môi trường huyết sữa (3g whey powder + 45ml nước cất) MTP2: môi trường huyết sữa + 0,3g peptone MTP3: môi trường huyết sữa + 0,4g peptone MTP4: môi trường huyết sữa + 0,5g peptone MTP5: môi trường huyết sữa + 0,6g peptone MTP6: môi trường huyết sữa + 0,7g peptone MTP7: môi trường huyết sữa + 0,8g peptone ‐ 34 ‐ Chương 2: Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu Luận văn tốt nghiệp Vẽ đồ thị biểu diễn ảnh hưởng hàm lượng peptone đến phát triển L.acidophilus - Yếu tố yeast extract: Bố trí thí nghiệm: Bảng 2.2: Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng yeast extract đến phát triển L.acidophilus nuôi cấy Thể tích môi trường (ml) Thể tích giống cấy (ml): 10% MTY1 50 MTY2 50 MTY3 50 MTY4 50 5 MTY5 50 MTY6 50 MTY7 50 STT Trong đó: Môi trường MTY1: môi trường huyết sữa (3g whey powder + 45ml nước cất) MTY2: môi trường huyết sữa + 0,05g yeast extract MTY3: môi trường huyết sữa + 0,15g yeast extract MTY4: môi trường huyết sữa + 0,25g yeast extract MTY5: môi trường huyết sữa + 0,35g yeast extract MTY6: môi trường huyết sữa + 0,45g yeast extract MTY7: môi trường huyết sữa + 0,55g yeast extract Vẽ đồ thị biểu diễn ảnh hưởng hàm lượng yeast extract đến phát triển L.acidophilus ‐ 35 ‐ Chương 2: Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu - Luận văn tốt nghiệp Yếu tố K2HPO4 Bố trí thí nghiệm: Bảng 2.3: Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng K2HPO4 đến phát triển L.acidophilus nuôi cấy Thể tích môi trường (ml) Thể tích giống cấy (ml): 10% MTK1 50 MTK2 50 MTK3 50 MTK4 50 5 MTK5 50 MTK6 50 MTK7 50 STT Trong đó: Môi trường MTK1: môi trường huyết sữa (3g whey powder + 45ml nước cât MTK2: môi trường huyết sữa + 0,05g K2HPO4 MTK3: môi trường huyết sữa + 0,075g K2HPO4 MTK4: môi trường huyết sữa + 0,1g K2HPO4 MTK5: môi trường huyết sữa + 0,125g K2HPO4 MTK6: môi trường huyết sữa + 0,15g K2HPO4 MTK7: môi trường huyết sữa + 0,175g K2HPO4 Vẽ đồ thị biểu diễn ảnh hưởng hàm lượng K2HPO4 đến phát triển L.acidophilus ‐ 36 ‐ Chương 2: Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu Luận văn tốt nghiệp 2.2.5.2 Tối ưu hoá môi trường huyết sữa cho phát triển vi khuẩn L.acidophilus phương pháp quy hoạch tuyến tính - Nguyên tắc: Nhờ phân bố tối ưu điểm không gian yếu tố biến đổi tuyến tính toạ độ nên khắc phục khuyết điểm phương pháp phân tích hồi quy cổ điển Sự lựa chọn phương án định cách đặt toán nghiên cứu đặc điểm đối tượng Hoạch định thí nghiệm cho phép biến đổi đồng thời yếu tố thu ước lượng định lượng hiệu ứng hiệu ứng tương tác làm tăng đáng kể hiệu thực nghiệm - Mục đích phương pháo quy hoạch thực nghiệm: tìm điều kiện tối ưu để thực trình lựa chọn thành phần tối ưu hệ nhiều phần tử - Cách tiến hành: Xét k = nhân tố ảnh hưởng đến phát triển L.acidophilus (hàm lượng peptone, hàm lượng yeast extract, hàm lượng K2HPO4) : hàm lượng peptone bổ sung vào môi trường huyết sữa (% so với môi trường) : hàm lượng yeast extract bổ sung vào môi trường huyết sữa (% so với môi trường) : hàm lượng K2HPO4 bổ sung vào môi trường huyết sữa (% so với môi trường) Ta tiến hành thí nghiệm n = mức giá trị nhân tố Vậy số thí nghiệm cần thực là: (thí nghiệm) Hàm mục tiêu Y sinh khối vi khuẩn Lactobacillus acidophilus (cfu/ml) ‐ 37 ‐ Chương 2: Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu Luận văn tốt nghiệp Bố trí thí nghiệm: Bảng 2.4: Bố trí thí nghiệm tối ưu hoá môi trường nuôi cấy L.acidophilus STT Z1 0,8 1,10 0,36 0,8 1,10 0,28 0,8 0,70 0,36 0,8 0,70 0,28 0,44 1,10 0,36 0,44 1,10 0,28 0,44 0,70 0,36 0,44 0,70 0,28 Z2 Z3 Phương trình hồi quy tuyến tính có dạng: - Phương pháp xử lý số liệu: Tìm hệ số phương trình hồi quy theo công thức sau: Thí nghiệm tâm phương án STT Yo Ytb (Yo – Ytb)2 ‐ 38 ‐ Sth Chương 2: Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu ‐ 39 ‐ Luận văn tốt nghiệp Chương 2: Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu Luận văn tốt nghiệp Trong đó: Kiểm định ý nghóa hệ số phương trình hồi quy: STT bj tj Trong đó: Với: Tra bảng tp(f) với p = 0,05 ; f = N(k – 1) = 8(3 – 1) = 16 Sau so sánh với giá trị tj Các hệ số phương trình hồi quy có nghóa tj > tb(f) Kiểm tra tương thích phương trình so với thực tế: STT Y Y* (Y-Y*)2 ‐ 40 ‐ F Chương 2: Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu Luận văn tốt nghiệp Trong đó: Với : hệ số có nghóa phương trình hồi quy Tra bảng F1-p(f1,f2), sau so sánh với F Nếu F < F1-p(f1,f2) phương trình hồi quy tương thích với thực tế Trong đó: p mức ý nghóa; f1 = N – (N: số thí nghiệm; : số hệ số phương trình hồi quy có nghóa); f2 = số yếu tố – 2.2.6 Thử nghiệm sản xuất chế phẩm Lactobacillus acidophilus phương pháp sấy phun [1, 13, 16] - Nguyên tắc: Sấy phun phương pháp chuyển sản phẩm từ dạng lỏng thành dạng dạng bột Vật liệu lỏng bơm đến bình phun phun với tốc độ cao vào buồng chân không Nhiệt độ không khí xung quanh lọc, làm nóng phân tán buồng chân không Không khí nóng làm nước bay bột tạo thành Không khí bên buồng đạt 200oC - Cách tiến hành: Chuẩn bị giống: vi khuẩn Lactobacillus acidophilus nuôi môi trường huyết sữa sau 15 Đem ly tâm với tốc độ 5000 vòng/phút 15 phút để thu sinh khối Chuẩn bị dịch nhũ hóa: chất nhũ hóa bổ sung để bảo vệ vi sinh vật khỏi nhiệt độ cao máy sấy phun thời gian, điều kiện bảo quản sau Mẫu 1: sữa gầy 15g/100ml nước cất + 2% lactose Mẫu 2: sữa gầy 20g/100ml nước cất + 2% lactose ‐ 41 ‐ Chương 2: Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu Luận văn tốt nghiệp Mẫu 3: sữa gầy 20g/100ml nước caát + 2% lactose + 0,05% cao naám men Mẫu 4: sữa gầy 20g/100ml nước cất + 2% lactose + 0,05% cao nấm men, chứa 8% muối Mẫu 5: sữa gầy 20g/100ml nước cất + 2% lactose + 0,05% cao nấm men, chứa 20% muối Mẫu 6: sữa gầy 20g/100ml nước cất + 2% lactose + 0,05% cao nấm men, chứa 25% muối Thực sấy phun: Dịch nhũ hóa trùng 95oC, 30 phút Sinh khối vi khuẩn huyền phù với dịch nhũ hóa Đồng hoá dịch nhũ hoá huyền phù vi sinh vật Quá trình sấy phun thực nhiệt độ đầu vào 135oC nhiệt độ đầu 60oC, tốc độ bơm nhu động: 13 vòng/phút - Xác định độ ẩm mẫu sấy phun: Nguyên tắc: dùng nhiệt làm bay mẫu Cân trọng lượng mẫu trước sau sấy khô, từ tính phần trăm nước có mẫu Cách tiến hành: Cân 10g mẫu (cân xác cân phân tích) Sấy nhiệt độ 105oC đến trọng lượng không đổi Cân trọng lượng mẫu sau sấy Suy độ ẩm mẫu Trong đó: G: trọng lượng cốc sứ G1: trọng lượng cốc sứ + mẫu trước sấy G2: trọng lượng cốc sứ + mẫu sau sấy - Đánh giá khả sống sót vi khuẩn sau trình sấy phun: Xác định mật độ tế bào vi khuẩn trước sau sấy phương pháp đếm tế bào Vẽ đồ thị so sánh mật độ tế bào trước sau saáy phun ‐ 42 ‐ ... số liệu - Phần mềm Excel Phần mềm R ‐? ?26 ‐ Chương 2: Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu 2. 2 Luận văn tốt nghiệp Phương pháp nghiên cứu Hình 2. 1: Sơ đồ nghiên cứu ‐? ?27 ‐ Chương 2: Nguyên.. .Chương 2: Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu 2. 1 Luận văn tốt nghiệp Nguyên vật liệu 2. 1.1 Địa điểm nghiên cứu - Phòng thí nghiệm Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa - Tp.HCM, số 26 8... để tạo chủng - Cách tiến hành: gram mẫu 1 0-1 1 0 -2 1 0-3 1 0-4 1 0-5 1 0-6 1 0-7 Môi trường MRS agar Cấy giữ giống Môi trường MRS agar Hình 2. 2: Quy trình phân lập chọn giống vi khuẩn Lactobacillus acidophilus