2.3.1. Xác định hoạt tính enzym bằng cách đo đường kính vòng thủy phân [3]
6.1.1 Nguyên tắc
Khi enzym tác dụng lên cellulose trong môi trường thạch, cơ chất bị phân giải làm độ đục của môi trường giảm đi, môi trường trở nên trong suốt. Độ trong suốt tỉ lệ với hoạt tính enzym.
6.1.2 Cách tiến hành
Chuẩn bị môi trường có chứa 2% thạch, 1% CMC trong dung dịch đệm photphat pH=5 rồi phân phối vào đĩa petri. Sau khi thạch đông, khoét lỗ nhỏ trên bề mặt thạch cho vào dung dịch enzym vào và giữ ở 400C. Sau 48h đo đường kính phần môi trường trong suốt chỗ enzym tác dụng.
Hoạt độ enzym đo bằng số mm đường kính vòng thủy phân.
2.3.2. Xác định hoạt tính enzym dựa vào sự giảm trọng lượng cơ chất [3]
2.3.2.1Nguyên tắc
Khi enzym tác dụng phân giải cơ chất cellulose thì trọng lượng cơ chất giảm đi. Độ giảm trọng lượng cơ chất tỉ lệ với hoạt tính enzym.
2.3.2.2Cách tiến hành
Dùng giấy Whatman số 1 làm cơ chất.
Chuẩn bị 10ml dung dịch enzym 1% trong dung dịch đệm acetat 0,1M, pH=5.
Cho dung dịch enzym vào bình tam giác dung tích 250ml, thêm 1-1,5g cơ chất, cho vài giọt toluen. Nút kín bình lại, giữ trên máy lắc tần số 160lần/ phút. Ly tâm rửa cellulose còn lại với nước cất nhiều lần, làm khô ở 600C rồi đem cân.
Tiến hành mẫu kiểm tra song song với mẫu thí nghiệm trong đó chỉ có giấy lọc và dung dịch đệm, giữ cùng điều kiện với mẫu thí nghiệm, sau đó ly tâm và rửa cellulose như trên.
Hiệu số lượng cơ chất còn lại giữa 2 bình kiểm tra và thí nghiệm cho biết lượng cơ chất bị phân giải. Hoạt độ enzym được tính bằng số gam cơ chất bị phân giải hoặc phần trăm cơ chất bị phân giải.
2.3.3. Xác định hoạt tính enzym dựa vào sự giảm độ nhớt của dung dịch cơ chất [ 3] Cơ chất được sử dụng ở đây là CMC. Nhớt kế được sử dụng để đo độ nhớt của dung dịch cơ chất trước và sau khi enzym tác dụng. Hoạt tính enzym được biểu diễn bằng sự giảm độ nhớt của dung dịch cơ chất tính theo %.
Cách tiến hành:
Cho 1ml dung dịch enzym vào bình đựng 5ml Na-CMC 0,3% trong dung dịch đệm acetat 0,05M và pH=5,0. giữ hỗn hợp phản ứng 2 phút ở 400C trong nhớt kế.
Đo thời gian chảy của hỗn hợp phản ứng. Mẫu kiểm tra cũng được tiến hành như trên nhưng enzym đã bị đun sôi trước khi đưa vào cơ chất.
2.3.4. Xác định hoạt tính enzym dựa vào lượng đường khử tạo thành [18]
Hoạt tính enzym được tính bằng đơn vị UI/ml môi trường hoặc UI/g cơ chất. Nguyên tắc là khi enzym thủy phân cơ chất cellulose tạo thành đường khử, đo lượng đường khử tạo thành từ đó xác định hoạt tính enzym.
Cách tiến hành:
2ml dung dịch đệm photphat 0,1M, pH=5
Cho cơ chất cellulose vào (nếu cơ chất là CMC thì hàm lượng là 1% tương ứng ta có hoạt tính CMCase; nếu là giấy lọc thì sử dụng 50mg tương ứng ta có hoạt tính FPA)
Tiếp tục cho 1ml dung dịch enzym vào
Cho 1ml DNS vào và đun cách thủy 5 phút. Sau đó đo độ hấp thu ở bước sóng 540nm.
Nếu sử dụng giấy lọc làm cơ chất sau khi đun cách thủy 5 phút, làm nguội nhanh xuống nhiệt độ phòng sau đó lọc và tiến hành đo độ hấp thu ở bước sóng 540nm.
1UI được định nghĩa là lượng enzym thủy phân cơ chất giải phóng ra 1µmol glucose trong 1ml môi trường trong thời gian 1 phút ở điều kiện nhiệt độ thích hợp.