Phương pháp xác định thời gian hiện màu của kit

Nguyên tắc:đo thời gian hiện màu của kit và hiệu chỉnh chiều dài kit (nếu cĩ).

Tiến hành:

 Đo thời gian hiện màu của kit giấy hồn chỉnh 1.5 × 6cm tạo ra từ các thí nghiệm trên trong các dung dịch urea nồng độ khác nhau.

 Thời gian hiện màu nên khơng quá15 phút, nếu cao hơn phải rút ngắn chiều dài kit để dịng chất lỏng chạy nhanh hơn gặp enzyme urease và chất chỉ thị.

 Giấy lọc FNo3, kích thước 1.5cm x 6 cm  Máy quang phổ Hĩa chất  Urease  Urea  Chất chỉ thị  Thuốc thử Nessler Cách tiến hành:

 Hịa tan hết lượng ureaseđược cốđịnh trên kit trong 2ml nước.

 Đo hoạt tính urease bằng phương pháp Nessler theo thời gian. Các kit giấy được bảo quản kín ở nhiệt độ 4oC.

Bảng 2.8:Phương pháp xác định thời gian sử dụng của kit

Ngày Hoạt tính urease (µmol NH3/phút.kit)

Ngày 0 Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3

…

2.2.10. Khảo sát khả năng phát hiện của kit trong mẫu thực

Tiến hành khảo sát sự cĩ mặt của urea (nếu cĩ) trong các mẫu sản phẩm lấy trên thị trường cĩ khả năng nhiễm urea cao. Sử dụng kit để định tính, bán định lượng và đo pH để định lượng urea cĩ thể cĩ trong mẫu.

2.2.11. Các phương pháp xử lý số liệu

C

CHHƯƯƠƠNNGG 33

KẾT QUẢ & BÀN LUẬN

3.1. Khảo sát các loại chất chỉ thị màu

Nguyên tắc hoạt động của kit là dựa vào sự thay đổi màu sắc của chỉ thị khi pH mơi trường thay đổi. Trong bài luận văn này, chúng tơi nghiên cứu kit thử nhanh urea sử dụng enzyme urease để thủy phân urea cĩ trong mẫu phân tích nên sản phẩm tạo ra là NH3sẽ làm tăng pH, do đĩ làm đổi màu của chỉ thị.

Đầu tiên chúng tơi tiến hành đi tìm loại chất chỉ thị thích hợp để cho lên kit. Cĩ rất nhiều chất chỉ thị pH được sử dụng trong phịng thí nghiệm nhưng chúng tơi chỉ chọn ra những chất chỉ thị cĩ điểm chuyển màu sang mơi trường base lớn hơn 6.5 vì pH của nước cất khoảng 6.5. Khi dung dịch cĩ mặt NH3sẽ làm pH mơi trường lớn hơn 6.5 và làm đổi màu chỉ thị cho thấy cĩ sự tăng pH. Do đĩ, chúng tơi chọn 4 loại chất chỉ thị sau để khảo sát:

 Bromocresol purple: khoảng chuyển màu 5.2 – 6.8

 Bromothymol blue: khoảng chuyển màu 6.0 – 7.6

 Neutral red: khoảng chuyển màu 6.8 – 8.0

 Phenol red: khoảng chuyển màu 6.8 – 8.4

Hĩa chất làm thay đổi màu sắc của chỉ thị dùng trong phân tích urea là NH3 nên chúng tơi tiến hành thí nghiệm với dung dịch NH4OH để chọn ra chất chỉ thị thích hợp. Chỉ thị được cho là thích hợp sử dụng như là một thành phần của kit nên cĩ khả năng phát hiện sự cĩ mặt của NH4OH ở nồng độ càng thấp càng tốt.

Vì dung dịch NH4OH cĩ tính chất bay hơi, sau một số thí nghiệm khảo sát màu sắc của chỉ thị với nồng độ NH4OH giảm dần, chúng tơi chọn nồng độ bắt đầu là 10-3M rồi giảm dần nồng độ chođến khi dung dịch trở nên rất lỗng và chất chỉ thị khơng cịn khả năng phát hiện sự cĩ mặt của NH4OH nghĩa là cho màu sắc giống với màu sắc của chỉ thị trong nước cất (pH = 6.5).

Bảng 3.1: Khảo sát khả năng phát hiện của các loại chất chỉ thị Nồngđộ NH4OH (M) 10 -3 0.5×10-3 0.25×10-3 0.125×10-3 0.0625×10-3 0.03125×10-3 Khả năng phát hiện của BP + + + + + + Khả năng phát hiện của BB + + + + + - Khả năng phát hiện của NR + + + + - - Khả năng phát hiện của PR + + + + - - pH dd NH4OH 9.09 8.75 8.43 8.07 7.78 7.46 + : cĩ, - : khơng

BP: Bromocresol purple, BB: Bromothymol blue, NR: Neutral Red, PR: Phenol red

Kết quả đo pH dung dịch NH4OH khơng phù hợp với cơng thức pH = 14 – ½ (pKb– lgCb). Nguyên nhân là do dung dịch này cĩ tính chất bay hơi.

Ngồi ra, ta cĩ kết quả thí nghiệm màu sắc của chỉ thị trong nước cất và nước máy:

Hình 3.1: Màu sắc của chỉ thị trong nước cất (pH = 6.5)

Vì trong thực tế người ta cĩ thể pha urea trong nước máy (pH = 6.8) như nước dùng để ướp cá, thủy sản…nên ta chọn chất thị cĩ khoảng chuyển màu lớn hơn 6.8 để dễ dàng phân biệt màu sắc của chất chỉ thị ở mơi trường acid và base.

Khoảng chuyển màu và màu sắc của các loại chất chỉ thị như sau:

Bảng 3.1: Khoảng chuyển màu và màu sắc của các chất chỉ thị

Chất chỉ thị Khoảng chuyển màu Màu acid Màu base

Bromocresol purple 5.2 – 6.8 Vàng Tím

Bromothymol blue 6.0 – 7.6 Vàng Xanh

Neutral red 6.8 – 8.0 Đỏ Vàng

Phenol red 6.8 – 8.4 Vàng Đỏ

Từ 4 chất chỉ thị đề ra ban đầu, ta loại Bromocresol purple và Bromothymol Blue vì khoảng chuyển màu khơng lớn hơn 6.8. Khoảng chuyển màu của Neutral red và Phenol red gần giống nhau, tuy nhiên Neutral red trong mơi trường kiềm và trung tính cĩ màu sắc khĩ phân biệt (vàng và cam nhạt), trong khiđĩ Phenol red lại cĩ màu sắc trong 2 mơi trường này rất dễ phân biệt (hồng/đỏ và vàng). Theo kết quả thực nghiệm từ bảng 3.1, ta chọn chất chỉ thị tối ưu sử dụng cho kit là Phenol red.

3.2. Khảo sát lượng chất chỉ thị thích hợp cho lên kit

 Trước khi nhúng dung dịch urea:

Chuẩn bị các giấy kit FNo3 kích thước 1.5cm × 6cm cĩ 10µl chất chỉ thị và 20µl dung dịch urease 4%. Vị trí dải chỉ thị nên ở gần đầu kit, khơng nên chạm mép trên của giấy kit để cĩ khoảng trống cho tay cầm khi đặt kit tựa vào thành trong của dụng cụ chứa dung dịch urea. Vị trí của dung dịch urease nằm ở nửa dưới của giấy kit và cũng khơng nên chạm mép dưới của kit vì đây là nơi tiếp xúc với dung dịch urea, urease cĩ thể bị kéo trơi, hịa tan trong dung dịch urea dẫn tới làm giảm lượng urease cũng như hoạt tính enzyme trên kit.

Hình 3.3: Vị trí chất chỉ thị và enzyme urease trên kit

Màu sắc của dải chỉ thị trên kit thử sau khi chấm lên đậm dần theo chiều tăng của nồng

độ phenol red như hình sau:

1 2 3 4

Hình 3.4: Kit thử với các nồng độ phenol red khác nhau trước khi nhúng dung dịch urea Nồngđộ PR: 1 – 0.05%, 2 – 0.1%, 3 – 0.2%, 4 – 0.5%

b: Dịng chất lỏng chạm dải chỉ thị và làm đổi màu chỉ thị c: Dịng chất lỏng chạy hết kit

Cụ thể đối với các nồng độ phenol red khác nhau, màu sắc của chỉ thị thay đổi như sau:

1 2 3 4

Hình 3.6: Kit thử với các nồng độ phenol red khác nhau sau khi nhúng dung dịch urea 2% Nồngđộ PR: 1 – 0.05%, 2 – 0.1%, 3 – 0.2%, 4 – 0.5%

Sự thay đổi màu sắc của chỉ thị là do NH3 được sinh ra từ phản ứng thủy phân urea xúc tác bởi enzyme urease cĩ trên kit. Dịng urea đi lên gặp enzyme urease trước, bị thủy phân tạo ra NH3làm tăng pH của dung dịch, sau đĩ di chuyển lên tiếp gặp chỉ thị và làm đổi màu của chỉ thị. Vì dung dịch urea cĩ nồng độ khá cao 2% nên phản ứng thủy phân xảy ra mạnh và tạo ra nhiều NH3, do đĩ dung dịch urea khơng cần chạm dải chỉ thị đã làm đổi màu chỉ thị như hình trên.

Sau khi dịng urea chạy hết kit, NH3được sinh ra tập trung ở đầu kit và làm cho màu sắc của chỉ thị trở nênđậm dần – màu hồng đậm như hình dưới đây:

Hình 3.7: Kit thử sau khi dung dịch urea chạy hết kit

Tất cả mẫu kit thử đều được so sánh với mẫu kit trắng (khơng cĩ urease trên kit). Dung dịch urea khơng bị thủy phân, khơng tạo NH3làm tăng pH nên khơng làm đổi màu của chỉ thị.

Hình 3.8: Kit thử trắng sau khi dung dịch urea chạy hết kit

Thời gian hiện màu của cả 4 mẫu kit thử trên đều ngắn (khoảng 5 – 7 phút). Trong 4 mẫu khi dung dịch urea chưa chạm dải chỉ thị thì màu sắc của phenol red nồng độ 0.5% dễ quan sát nhất (màu đỏ) nên chúng tơi chọn nồng độ chất chỉ thị cho lên kit là 0.5%. Lượng dung dịch phenol red trên một kit là 10µl để đảm bảo dải chỉ thị khơng bị loang và tạo một diện tích màu khoảng 1.5cm × (0.5 – 0.7)cm đủ để quan sát sự chuyển màu bằng mắt thường.

3.3. Khảo sát dung mơi pha urease

3.3.1. Khảo sát hoạt tính của enzyme urease theo phương pháp Nessler

 Xây dựngđường chuẩn NH3:

Bảng 3.2:Xây dựng đường chuẩn NH3

Lượng NH3(g) 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

3 y = 0.0187x - 0.0226 R2= 0.9978 -0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 O D 4 9 0 n m

Hình 3.9:Đồ thị NH3chuẩn dùngđể xácđịnh hoạt tính urease

Sử dụng phương pháp Nesslerđểđo hoạt tính của enzyme urease sử dụng, chúng tơi thu

được kết quả như sau:

Bảng 3.3:Kết quả đo hoạt tính enzyme urease

Lầnđo 1 2 3

OD 0.816 0.846 0.830

OD tb 0.831 ± 0.015*

Hoạt tính (µmol NH3/phút.mg)** 4.026 (*) Độ lệch chuẩn của 3 mẫu độc lập.

(**) Hoạt tính ureaseđược tính theo cơng thức:

F m 1 10 17 1 1 . 0 1 5 . 0 5 . 1 a b y A         (µmol NH3/phút.mg bột)

Trongđĩ: y – giá trị ODđođược b = -0.0216, a = 0.0186

m – nồngđộ dung dịch ureaseđemđo hoạt tính (mg/ml) F – độ pha lỗng

3.3.2. Khảo sát dung mơi dùng để pha urease

 Mục đích: tìm ra dung mơi thích hợp hịa tan urease để duy trì hoạt tính của enzyme và tránh các ảnh hưởng gây ức chế từ mơi trường.

Chúng tơi tiến hành khảo sát các dung mơi sau:

 Nước cất

 Nước cất + EDTA 5mM

 Nước cất + Ni2+4mM

 Nước cất + EDTA 5mM + Ni2+4mM

EDTA được bổ sung cĩ tác dụng kết hợp ion kim loại tạp nhằm làm giảm sự ảnh hưởng của các ion nàyđến hoạt tính của urease vì cĩ thể chúng sẽ là các chất ức chế do cĩ cùng hĩa trị với cofactor là Ni2+ của urease. Ion Ni2+cĩ mặt trong trung tâm hoạt động của urease nên việc bổ sung cĩ tác dụng hoạt hĩa enzyme.

Đo hoạt tính enzyme urease khi pha trong 4 loại dung mơi trên cho kết quả như sau:

Bảng 3.4:Hoạt tính của urease trong các dung mơi khác nhau

Dung mơi Nước Nước +

EDTA 5mM Nước + Ni2+ 4mM Nước + EDTA 5mM + Ni2+4mM Lần 1 0.816 0.685 0.177 0.118 Lần 2 0.846 0.685 0.176 0.118 OD Lần 3 0.830 0.662 0.159 0.122 OD trung bình 0.831 ± 0.015* 0.677 ± 0.013 0.171 ± 0.010 0.119 ± 0.002 Hoạt tính (µmol NH3/phút.mg) 4.026 3.303 0.912 0.670

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5

Nước Nước + EDTA

5mM

Nước + Ni 4mM Nước + EDTA

5mM + Ni 4mM

Dung mơi

Hình 3.10: Biểuđồ so sánh hoạt tính urease trong các loại dung mơi

Dựa vào biểu đồ trên, chúng tơi nhận thấy hoạt tính urease trong nước cất là cao nhất (cao hơn dung mơi cĩ bổ sung EDTA gần 1.2 lần, dung mơi cĩ bổ sung Ni2+4.4 lần, dung mơi bổ sung EDTA và Ni2+6 lần).

Việc bổ sung EDTA để kết hợp với ion kim loại tạp nhằm tránh ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme urease nhưng kết quả thí nghiệm lại cho kết quả ngược lại. Điều này cĩ thể là do nguồn nước cất của phịng thí nghiệm chứa rất ít kim loại tạp, do đĩ EDTA thay vì cĩ tác dụng kết hợp với các ion kim loại này lại kết hợp với ion Ni2+ nằm ở trung tâm hoạt động của enzyme urease dẫn tới làm giảm hoạt tính của enzyme này (như đồ thị). Một khả năng nữa là EDTA sử dụng chỉ hoạt động tốt trong mơi trường kiềm nên với pH nước cất 6 – 6.5 thì EDTA lại khơng cho tác dụng cĩ lợi như mục đích ban đầu.

Ion Ni2+ được cho vào dung mơi dưới dạng muối NiSO4 nhằm mục đích hoạt hĩa khả năng xúc tác của enzyme urease vì enzyme sau một thời gian bảo quản lượng Ni2+ở trung tâm hoạt động sẽ dần dần bị giảm đi [6]. Việc bổ sung thêm Ni2+cịn cĩ tác dụng bù trừ cho lượng ion bị mất đi này. Tuy nhiên, theo kết quả đo hoạt tính enzyme với sự cĩ mặt của ion Ni2+lại làm giảm hoạt tính của enzyme so với sự khơng cĩ mặt của ion Ni2+. Nguyên nhân là do Ni2+

cũng là một ion kim loại nặng nên ở nồng độ cao nĩ lại ức chế enzyme [46].

H o ạ t tí n h ( µ m o l N H3 /p h ú t. m g )

Sự cĩ mặt đồng thời EDTA và ion Ni2+trong dung mơi pha urease với mục đích ban đầu là kết hợp tác dụng bắt các ion kim loại tạp trong nước của EDTA và hoạt hĩa enzyme urease của Ni2+ nhưng kết quả đo hoạt tính ngược lại hồn tồn. EDTA được bổ sung khơng những kết hợp với các ion Ni2+tự do mà cịn kết hợp luơn với ion Ni2+nằm trong trung tâm hoạt động của urease do đĩ làm giảm mạnh hoạt tính của enzyme này.

Dựa vào kết quả đo hoạt tính enzyme urease trong các 4 loại dung mơi trên, chúng tơi chọn dung mơi để pha urease là nước cất.

3.4. Khảo sát lượng enzyme thích hợp cho lên kit

3.4.1. Khảo sát thể tích chấm enzyme urease lên kit

Chấm các thể tích dung dịch urease khác nhau lên giấy kit kích thước 1.5cm × 6cm (diện tích kit là 900mm2). Quan sát, đo diện tích vệt loang và đo thời gian khơ của dung dịch cho ta kết quả sau:

Bảng 3.5: Khảo sát thể tích chấm enzyme urease lên kit

Thể tích urease (µl) Hình dạng vệt loang Diện tích loang (mm2) Tỷ lệ so với diện tích kit Thời gian khơ (phút) 10 Đường trịn d = 13mm 133 1/6.8 4 20 Hình chữ nhật 18×15mm 270 1/3.3 6 30 Hình chữ nhật 24×15mm 360 1/2.5 9 40 Hình chữ nhật 28×15mm 420 1/2.1 10 50 Hình chữ nhật 33×15mm 495 1/1.8 12

Dựa vào bảng trên, chúng tơi chọn thể tích dung dịch urease cho lên 1 kit là 30µl vì diện tích loang khơng lớn và thời gian khơ khơng quá dài.

nhau cho chúng tơi kết quả về khả năng phát hiện sự cĩ mặt của urea của enzyme urease với khối lượng khác nhau trên kit.

Nồng độ enzyme khảo sát tăng dần từ 0.5% đến 4%. Nồng độ enzyme khơng nên quá cao vì bản chất enzyme urease là protein cĩ phân tử lượng lớn (M = 480 000Da) nên sẽ tạo độ nhớt cao và độ tan thấp ở nồng độ cao. Nồng độ dung dịch urea khảo sát giảm dần từ 1000ppm đến 50ppm. Giới hạn khảo sát là 50ppm vì đây là nồng độ cao nhất cĩ trong thực phẩm khơng ảnh hưởng tới sức khỏe con người.

Cơ chế tiếp xúc của enzyme urease và urea trong nghiên cứu của chúng tơi là cho dịng dung dịch urea chạy từ từ lên kit đặt đứng hoặc nghiêng theo lực hút mao quản của giấy kit. Cách tiếp xúc này cĩ các ưu điểm so với cho enzyme hịa tan vào dung dịch urea:

 Tăng diện tích bề mặt tiếp xúc giữa enzyme urease và urea.

 Dễ quan sát sự thay đổi màu sắc của chỉ thị trên kit.

 Khơng phụ thuộc vào thể tích dung dịch urea, khơng cần thể tích mẫu thử lớn, chỉ cần đủ để chạy lên hết kit.

 Quan sát được sự thay đổi màu sắc của chỉ thị đối với các dung dịch cĩ màu sẫm hoặc đục như nước mắm hoặc sữa.

 Cĩ thể phân tích mẫu thử rắn nhưng phải cĩ dịch chất lỏng trên bề mặt như thủy sản. Kết quả khảo sát khả năng phát hiện của kit được cho bảng sau:

Bảng 3.6:Khảo sát khả năng phát hiện của kit trong dung dịch urea ở các nồng độ khác nhau

Nồng độ urea (ppm) Nồng độ urease (%) 1000 800 600 400 200 100 50 4 + + + - - - - 2 - - - - - - - 1 - - - - - - - 0.5 - - - - - - - +: cĩ, –: khơng

1 2 3 4

Hình 3.11: Khảo sát khả năng phát hiện của kit chấm 30µl urease 4% trong dung dịch urea ở