Kit thử nhanh trong phân tích urea

1.6.1. Tình hình các loại kit thử nhanh ở Việt Nam[54]

Hiện nay trên thị trường cĩ bán nhiều loại kit thử nhanh. Đặc điểm chung của các loại kit thử nhanh là:

 Độ nhạy và chính xác cao.

 Thời gian phát hiện sự cĩ mặt của hĩa chất độc hại ngắn.

 Đơn giản, dễ sử dụngđối với người tiêu dùng.

 Giá thành rẻ.

Tuy nhiên, trên thị trường nước ta chủ yếu là các loại kit ngoại, kit nội tương tự dành cho

người tiêu dùng chưa nhiều vàđặc biệt là chưa cĩ kit nội dùng phân tích urea trong thực phẩm.

Các kit ngoại thì chưa phù hợp lắm với điều kiện của Việt Nam, khi sử dụng phải đong, đo hố

chất từ các lọ nhỏ đĩng sẵn, vì vậy khơng loại trừ được sai số chủ quan do người sử dụng gây ra.

Vì vậy, Viện Kỹ thuật Hố Sinh và Tài liệu nghiệp vụ (Tổng Cục Kỹ thuật – Bộ Cơng an)đã

chế tạo bộ 15 kitdùng để kiểm tra sự cĩ mặt của hĩa chất độc hại trong thực phẩm. Lượng hố

chất trong các kit thử của Viện đãđược định lượng sẵn, do vậy loại bỏ được sai số chủ quan khi

sử dụng các kit ngoại cùng loại. Các loại kit thử nhanh của Viện cĩ chung một đặc điểm là phát

hiện sự hiện diện của một loại hố chất độc hại trong thực phẩm thơng qua sự thay đổi màu sắc

của thuốc thử nằm sẵn bên trong kit, do vậy cĩ thể dễ dàngđọc kết quả bằng mắt thường.Giá của

Bảng 1.11:Các loại kit thửnhanh chếtạo bởi Tổng cục Kỹthuật (BộCơng an)

STT Tên kit/test và tính năng chính Thời gian phát

hiện (phút)

1 Kit kiểm tra nhanh thuốc trừ sâu trong rau quả 50 2 Kit kiểm tra, phát hiện nhanh axít vơ cơtrong giấm ăn < 5 3 Kit kiểm tra hàn the trong giị, chả, thịt tươi sống... < 5 4 Kit kiểm tra nhanh hypoclorid trong thực phẩm < 5 5 Kit kiểm tra nhanh phẩm màu tổng hợp thuộc loại acid base < 5 6 Kit kiểm tra nhanh dầu mỡ bị oxy hố quá mức < 5 7 Kit kiểm tra nhanh nitrite trong sản phẩm thịt đã chế biến < 5 8 Kit kiểm tra nhanh nitrate sử dụngđể bảo quản thực phẩm < 5 9 Kit kiểm tra nhanh salixylic trong một số loại thực phẩm < 5 10 Kit kiểm tra nhanh các thực phẩm sử dụng formol bảo quản < 5 11 Kit kiểm tra nhanh methanol trong các loại rượu < 5 12 Kit kiểm tra chì trong thực phẩm, đồ uống < 5 13 Kit kiểm tra nhanh asen trong thực phẩm, đồ uống < 5 14 Kit kiểm tra nhanh muối thuỷ ngân hoà tan trong thực phẩm, đồ uống < 5

15 Bộ kiểm tra đường saccharose trongđồ uống < 5

1.6.2. Các loại kit phân tích urea[47]

 Urea Diagnostic Kit (UDK) của CinnaGen Inc. (Cơng ty tiên phong trong lĩnh vực cơng nghệ sinh học ở Iran)

Số cataloge:BK8146C

Mơ tả:

 UDK được sử dụng để xác định hàm lượng urea trong các chất lỏng sinh học như serum, plasma và nước tiểu. Việc định lượng urea dựa trên phương pháp đo màu.

 Urea trong các chất lỏng sinh học phản ứng với enzyme urease tạo thành sản phẩm phức chất cĩ màu. Sự khử hợp chất này tạo ra phức màu xanh lá cây. Mật độ quang học của màu sắc được tạo ra cĩ mối quan hệ tuyến tính với nồng độ urea trong dung dịch. UDK của CinnaGen cĩ bán ở dạng sử dụng bằng tay và dạng tự động.

Đặc tính:

 Nguyên tắc: dựa trên phương pháp đo màu

 Tuyến tính tới 200mg/dl

 Thể tích mẫu phân tích: 10ml

 Đo ở bước sĩng nhìn thấy được: 578nm

 Cĩ 2 dạng: bằng tay và tự động

 Tương thích với serum chuẩn thương mại mới nhất

 Mẫu phân tích: serum, plasma và nước tiểu

 Số lượng phân tích: 200 lần QuantiChromTMUrea Assay Kit Số catalog:DIUR-500

Mơ tả:

Urea được sinh ra chủ yếu từ gan và bài tiết ra ngồi bởi thận. Urea là sản phẩm chính cuối cùng của sự trao đổi protein trong cơ thể động vật. Nĩ là phương tiện chủ yếu để bài tiết ammonia độc ra khỏi cơ thể. Việc xác định urea rất hữu ích cho người thầy thuốc để đánh giá hoạt động của thận bệnh nhân. Nĩi chung, hàm lượng urea cao cĩ liên quan tới bệnh viêm thận, thiếu máu cục bộ ở thận, tắt nghẽn đường tiết niệu và các bệnh ngồi thận khác như nhồi máu cơ tim, bệnh gan và tiểu đường. Hàm lượng urea thấp cho thấy bị suy gan cấp tính.

Đặc tính:

 Khoảng phân tích: 0.006 - 100mg/dL

 Thời gian phân tích: 20 phút Urea (BIO-VAR Ltd)

Số catalog: DK0031

Nguyên tắc:

(NH2)2CO + H2O 2NH3+ CO2

NH3+ salicylate-nitroprusside-hypochlorite-NaOHphức cĩ màu

Mơ tả:Kit chứa 4 lọ nhỏ (3 lọ dung tích 20ml, 1 lọ dung tích 5ml) đựng các hĩa chất 1 – Salicylate-Na-nitroprusside (concentrate) 2 – Hypochlorite-NaOH (concentrate) 3 – Urease 4 – Urea chuẩn Đặc tính:  Số lượng phân tích: 200 lần

C

CHHƯƯƠƠNNGG 22

NGUYÊN LIỆU & PHƯƠNG PHÁP

2.1. Nguyên liệu

2.1.1. Hĩa chất

 Enzyme urease (Merck)

 Thuốc thử Nessler

 Các loại chất chỉ thị: Bromocresol purple, Bromothymol Blue, Neutral red, Phenol red

 EDTA, Ethanol

 NaOH, HCl, NiSO4, Urea, NH4Cl, K2HPO4, KH2PO4

 Các mẫu nước mắm (Trung tâm Y tế Dự phịng), sữa (Trung tâm thu mua sữa của Vinamilk, quận Gị Vấp), nước đá ướp thủy sản (chợ Bình Điền, quận 7).

2.1.2. Dụng cụ

 Becher, erlen, ống nghiệm

 Bình định mức, ống đong, pipette, micropipette

 Máy đo quang phổ UV – VIS

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu

Chọn chất chỉ thị tối ưu và nồng độ thích hợp cho phản ứng nhận màu của kit

· Bromocresol purple · Bromothymol blue · Neutral red · Phenol red

§ Xác định lượng chất chỉ thị thích hợp

§ Khảo sát ảnh hưởng của dung mơi pha urease

§ Xác định lượng urease tối ưu

§ Xác định lượng urea thấp nhất cĩ thể phát hiện được

§ Khảo sát thời gian hiện màu của kit

Tổng quan về enzyme urease, urea và kit

thử nhanh

Thiết lập các thơng số của kit

Xây dựng thang màu bán định lượng urea cĩ trong thực phẩm

Khảo sát thời gian sử dụng của kit

Tiến hành trên mẫu thực phẩm và thống kê kết quả

2.2.2. Phương pháp tìm chất chỉ thị màu tối ưu

Nguyên tắc: sử dụng các loại chất chỉ thị cho phản ứng hiện màu trong dung dịch NH4OH với các nồngđộ khác nhau.

Dụng cụ:

 Ống nghiệm, becher, pipette, bìnhđịnh mức,đũa khuấy

 Chọn 4 loại dung dịch chất chỉ thị cĩ pH chuyển màu gần với pH của nước, nồng độ 0.2% trong cồn 70o:

Bảng 2.1:Khoảng chuyển màu và màu sắc của các chất chỉ thị

Chất chỉ thị Khoảng chuyển màu Màu acid Màu base

Bromocresol purple 5.2 – 6.8 Vàng Tím

Bromothymol blue 6.0 – 7.6 Vàng Xanh

Neutral red 6.8 – 8.0 Hồng Vàng

Phenol red 6.8 – 8.4 Vàng Hồng

 Chuẩn bị dung dịch NH4OH với các nồng độ khác nhau theo bảng sau, kết hợp đo pH bằng pH kế. Cho vài giọt chất chỉ thị vào dung dịch NH4OH và quan sát màu sắc. Chỉ thị cĩ khả năng phát hiện dung dịch NH4OH ở nồngđộ thấp hơn sẽđược chọn.

Bảng 2.2:Khảo sát phản ứng hiện màu trong dung dịch NH4OH

Ống số 1 2 3 4 5 6

Nồngđộ NH4OH (M) 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 0

Phản ứng hiện màu Cĩ / khơng

Giải thích:

Giá trị pH của 1 dung dịch baseđược tính theo cơng thức sau: pH = 14 – ½ (pKb– lgCb)

Suy ra nồngđộ dung dịch base tính pH: pK 2(14 pH) b

b 10

C   

Đối với dung dịch NH3: Kb= 1.75×10-5. Theo cơng thức trên: Khi pH = 6: Cb = 5.7.10-12M

Khi pH = 8.8: Cb = 2.3.10-6M

Khoảng chuyển màu cĩ thể thay đổi một ít phụ thuộc nồng độ chất chỉ thị trong dung dịch và nhiệtđộ mơi trường.

2.2.3. Phương pháp xác định lượng chất chỉ thị thích hợp cho lên kit

Nguyên tắc:cố định lên giấy 1 lượng chất chỉ thị với những nồng độ khác nhau, 1 lượng cố

định enzyme urease và thí nghiệm với dung dịch urea để chọn ra lượng chất chỉ thị cĩ khả năng tạo ra màu sắc dễ quan sát.

Dụng cụ:  Giấy lọc FNo3 kích thước 1.5cm x 6cm  Becher, micropipette Hĩa chất:  Urease  Urea  Chất chỉ thịđã chọn từ 2.2.2 Cách tiến hành:

 Cho lên kit giấy 10l chất chỉ thị với các nồngđộ khác nhau theo bảng sau:

Bảng 2.3:Khảo sát nồng độ chất chỉ thị thích hợp cho lên kit

Giấy số 1 2 3 4

Nồngđộ (%) 0.01 0.1 0.2 0.5 Khối lượng chất chỉ thị (µg) 1 10 20 50

 Cho 20µl dung dịch urease 4% lên kit giấy.

 Nhúng kit giấy vào dung dịch urea 2%, chờ một thời gian và quan sát màu sắc. Chọn lượng chất chỉ thị nào cho màu sắc dễ nhận thấy.

2.2.4. Phương pháp chọn dung mơi thích hợp dùng để pha urease

(NH2)2CO + H2O2NH3+ CO2

K2HgI4+ 3 KOH + NH3OHg2NH2I + 7 KI + 3 H2O

Dụng cụ:

 Ống nghiệm, pipette, becher

 Máy quang phổ, cuvet

Hĩa chất

- Dung dịch NH4Cl chứa 10µg NH3/ml

- Dung dịch urea 2%: cân 1g ureađịnh mứcđến 50ml bằngđệm phosphate 1/15M pH 7. - Dung dịch urease

- Đệm phosphate 1/15M pH 7 - Thuốc thử Nessler: cĩ 2 cách pha Cách 1: 10g KI + 15ml nước cất

15g HgI2

Dung dịch NaOH 50%

Hịa tan 10g KI trong 15ml nước cất, thêm 15g HgI2, khuấyđều cẩn thận và thêm 80ml dung dịch NaOH 50%, khuấyđều, thêm nước cất định mức tới 500ml (nước cất phải loại hết CO2 vì nồng độ CO2 đủ lớn cĩ thể gây kìm hãm thủy phân urea). Để 1 ngày đêm trong phịng, lọc qua bơng thủy tinh nhậnđược dung dịch trong suốt.

Cách 2: 35g KI + 100ml nước cất nĩng 17g HgCl2 + 300ml nước cất

Dung dịch NaOH 20% (18g NaOH + 72ml nước cất)

Đổ KI vào bình định mức 100ml,đổ từ từ HgCl2 vàođến khi kết tủa khơng tan nữa thì dừng, dùng dung dịch NaOH 20%định mức đến 100ml, cho tiếp 1 – 2 giọt HgCl2 tạo kết tủa

đỏ.Để dung dịch lắng trong qua 1đêm rồi lọc qua bơng thủy tinh, bảo quản trong lọ tối.

Tiến hành:

- Cho vào ống nghiệm 0.4ml nước cất và 0.5ml dung dịch urea 2% pha trong dung dịch

- Giữ ống nghiệm trong tủ ấmđến khiđạt 30oC. Sauđĩ, thêm 0.1 dung dịch urease, lắc

đều, để phản ứng trong 10 phút. Thời gian phản ứng cĩ thể lâu hơn tùy thuộc lượng urease cĩ ít hoặc nhiều trong loạiđệm khảo sát.

- Khử hoạt tính của enzymeđể kết thúc phản ứng bằng cách thêm 0.5ml dung dịch HCl 1M.

- Xác định lượng NH3 như sau: lấy 0.15ml hỗn hợp phản ứng cho vào ống nghiệm, thêm 5ml nước cất, 0.5ml thuốc thử Nessler. Để mẫu ổn định màu trong 15 phút. Lắcđều,đo OD ở 490nm .

- Mẫuđối chứng: tiến hành tương tự như trên nhưng khử hoạt tính của enzyme trước khi cho urea bằng 0.5ml dung dịch HCl 1M. Tiến hành tiếp theo như mẫu thí nghiệm. - Tính OD = ODmẫu - ODmẫuđối chứng. Dựa vào đồ thị chuẩn để định lượng NH3 tạo

thành. Vẽ sắc kýđồ hoạt tính enzyme ở các phânđoạn sau khi qua cột sắc ký.

Lậpđồ thi NH3chuẩn:

Chuẩn bị dung dịch gốc NH4Cl cĩ chứa 10µg NH3/ml (cân 0.15735g NH4Cl pha trong 100ml nước, lấy 2ml dung dịch nàyđịnh mức lên 100ml). Lấy 9 ống nghiệm, cho vào mỗi ống các chất theo thứ tự sau: a b y x b ax y     

Bảng 2.4:Phương pháp lập đường NH3chuẩn Ống 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Thể tích NH4Cl (ml) 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 Lượng NH3(µg) 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Thể tích nước (ml) 5.5 5 4.5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 Thuốc thử Nessler (ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

- Để mẫu ổnđịnh màu trong 15 phút, lắcđều,đo OD ở 490nm.

- Vẽđồ thị NH3chuẩn: trục hồnh ghi nồngđộ NH3(µg NH3), trục tung ghi OD (A).

Xácđịnh hoạt tính urease:

Đơn vị hoạt độ của enzyme urease được tính theođơn vị hoạt độ quốc tế (IU), là lượng enzyme cĩ khả năng xúc tácđể chuyển hĩa 1 µmol urea tạo thành NH3sau 1 phút ởđiều kiện tiêu chuẩn. Tuy nhiên trong bài báo cáo này, chúng tơi khơng sử dụng đơn vị IU để xác định hoạt tính urease mà thay bằng “µmol NH3/mg bột urease” để thuận lợi cho việc tính tốn.

Từ phương trìnhđường chuẩn NH3, chúng tơi xácđịnhđược các giá trị sau: - Hoạt tính urease A: F 10 17 1 1 . 0 1 5 . 0 5 . 1 a b y A        (µmol NH3/phút.ml) F m 1 10 17 1 1 . 0 1 5 . 0 5 . 1 a b y A         (µmol NH3/phút.mg bột) - Tổng hoạt tính: At= AVt(µmol NH3/phút) At= Amt(µmol NH3/phút) Trongđĩ: F:độ pha lỗng

mt: tổng khối lượng bột urease (mg) Vt: tổng thể tích dung dịch urease (ml)  Khảo sát dung mơi dùng để pha urease:

Nguyên tắc: pha dung dịch urease trong các loại dung mơi khác nhau và đo hoạt tính urease trong các dung mơi đĩ để chọn ra loại dung mơi thích hợp cĩ khả năng duy trì và ổn định hoạt tính của enzyme.

Dụng cụ và hĩa chất:tương tự phương pháp Nessler

Tiến hành:

- Pha dung dịch urease nồng độ 2mg/ml trong 4 loại dung mơi sau:

 Nước cất

 Nước cất+ EDTA 5mM: EDTA được bổ sung cĩ tác dụng kết hợp ion kim loại tạp nhằm làm giảm sự ảnh hưởng của các ion nàyđến hoạt tính của urease vì cĩ thể chúng sẽ là các chất ức chế do cĩ cùng hĩa trị với cofactor là Ni của urease.

 Nước cất + Ni2+4mM: ion Ni2+ cĩ mặt trong trung tâm hoạt động của urease nên việc bổ sung cĩ tác dụng hoạt hĩa enzyme.

 Nước cất + EDTA 5mM + Ni2+4mM: kết hợp tác dụng của cả EDTA và Ni2+. Đo hoạt tính urease trong từng dung mơi theo phương pháp Nessler. Dung mơi nào cho giá trị hoạt tính urease cao sẽ được chọn. Dung dịch ureaseđược bảo quản ở 4oC.

2.2.5. Phương pháp chọn thể tích chấm enzyme phù hợp

Nguyên tắc:cho lên kit giấy enzyme urease (hoặc nước để tiết kiệm enzyme) với những thể tích khác nhau và chọn lượng thể tích phù hợp sao cho khơng quá loang trên bề mặt giấy và thời gian khơ ngắn.

Bảng 2.5:Phương pháp chọn thể tích chấm enzyme phù hợp

Thể tích urease (µl) Diện tích loang (cm×cm) Thời gian khơ (phút)

10 20 30 40 50

2.2.6. Phương pháp nghiên cứu lượng enzyme urease thích hợp cho lên kit

Nguyên tắc: cho lên kit giấy enzyme urease với các hoạt tính khác nhau lên giấy và thí nghiệm với các dung dịch urea nồngđộ khác nhau.

Dụng cụ, hĩa chất:tương tự 2.2.3

Cách tiến hành:

 Cho lên kit giấy thể tích enzyme urease đã chọn từ 2.2.5 với các nồng độ khác nhau và 10l chất chỉ thị và nồng độ đã chọn từ 2.2.2 và 2.2.3 lên kit giấy và thí nghiệm với các nồng độ urea khác nhau theo bảng sau:

Bảng 2.6:Phương pháp nghiên cứu lượng enzyme thích hợp cho lên kit

Nồng độ urea (ppm) Nồng độ urease (%) 1000 800 600 400 200 100 50 4 2 1 0.5

 Quan sát khả năng phát hiện của từng kit thử. Nồng độ urease nào cĩ khả năng phát hiện sự cĩ mặt của urea trong dung dịch ở nồng độ 50ppm thì ta chọn hoạt tính urease tương ứng

với nồng độ đĩ sử dụng cho kit, đồng thời ghi lại màu sắc của chỉ thị trong từng trường hợp để xây dựng thành thang màu.

2.2.7. Phương pháp khảo sát giới hạn phát hiện của kit, xây dựng thang màubán định lượng urea và đường chuẩnpH bán định lượng urea và đường chuẩnpH