phĩng
Phương pháp xácđịnh hoạt tính urease ởđậu tương theo TCVN 4847 – 89 (ISO 5506 – 1988):
Nguyên tắc:
Trộn 1 lượng mẫu với dung dịch đệm urea, sau khi giữ hỗn hợp trong 30 phút ở 30oC, trung hịa lượng NH3 giải phĩng ra bằng 1 lượng dư HCl và chuẩn độ ngược bằng dung dịch NaOH thể tích chuẩn 0.1N.
Nhận xét: về nguyên tắc thì phương pháp này cũng giống như phương pháp chuẩn độ formol. Tuy nhiên phương pháp này kém chính xác hơn vì ở giaiđoạn chuẩn độ ngược bằng dung dịch NaOH bị sai số thừa do 1 lượng NaOH phản ứng với muối amoni cĩ trong dung dịch. Phương pháp Nessler:[32]
Nguyên tắc:
Dùng phản ứng màu với thuốc thử Nesslerđể định lượng ammonia được tạo thành trong phản ứng thủy phân urea bởi urease. NH3 tạo thành sẽ phản ứng với thuốc thử Nessler tạo phức màu vàng và cườngđộ màu thayđổi tùy theo lượng NH3tạo ra.
K2HgI4+ 3 KOH + NH3OHg2NH2I + 7 KI + 3 H2O
Tiến hành:
- Lấy 0.4ml nước cất cho vào ống nghiệm và 0.5ml dung dịch urea 3% trong đệm phosphate 0.5M pH=7, giữ trong tủ ấmđến khiđạt 30oC.
- Thêm 0.1 ml dung dịch urease cĩđộ pha lỗng thích hợp, lắc và giữ 30oC trong 5 phút. - Làm ngừng phản ứng bằng cách thêm 0.5ml dung dịch HCl 1M và lắcđều.
- Xác định ammonia như sau: lấy 0.15ml hỗn hợp phản ứng cho vào ống nghiệm, thêm 7ml nước, 0.5ml thuốc thử Nessler và thêm nước vào đến 10ml. Lắcđều và
Phản ứng xảy ra trong mơi trường kiềm pH < 12. Nếu dư KOH sẽ ảnh hưởngđếnđộ chính xác của phản ứng theo chiều thuận. Dư KI sẽ ảnh hưởng đến độ chính xác phản ứng theo chiều nghịch.
Chất màu thuđược rất nhạy với mơi trường phản ứng, càng ít KI càng nhạy với NH3. Khi lượng KI lớn, phản ứng nĩi chung khơng nhạy nữa.độ nhạy phản ứng cịn tỷ lệ với lượng dung dịch HgI2.
Phương pháp chuẩnđộ:[32]
Nguyên tắc:
Dùng dung dịch acid cĩ nồngđộ xácđịnhđể chuẩnđộ ammoniađược tạo thành.
Tiến hành:
- Lấy dung dịch enzyme và 5ml dung dịch urea 2% trong đệm phosphate pH=7 và giữ ở 30oC trong 30 ph.
- Thêm 10 giọt dung dịch methyl red 0.05% và chuẩn độ bằng dung dịch H2SO4
0.1N chođến khi cĩ màu hồng.