Trước khi nhúng dung dịch urea:
Chuẩn bị các giấy kit FNo3 kích thước 1.5cm × 6cm cĩ 10µl chất chỉ thị và 20µl dung dịch urease 4%. Vị trí dải chỉ thị nên ở gần đầu kit, khơng nên chạm mép trên của giấy kit để cĩ khoảng trống cho tay cầm khi đặt kit tựa vào thành trong của dụng cụ chứa dung dịch urea. Vị trí của dung dịch urease nằm ở nửa dưới của giấy kit và cũng khơng nên chạm mép dưới của kit vì đây là nơi tiếp xúc với dung dịch urea, urease cĩ thể bị kéo trơi, hịa tan trong dung dịch urea dẫn tới làm giảm lượng urease cũng như hoạt tính enzyme trên kit.
Hình 3.3: Vị trí chất chỉ thị và enzyme urease trên kit
Màu sắc của dải chỉ thị trên kit thử sau khi chấm lên đậm dần theo chiều tăng của nồng
độ phenol red như hình sau:
1 2 3 4
Hình 3.4: Kit thử với các nồng độ phenol red khác nhau trước khi nhúng dung dịch urea Nồngđộ PR: 1 – 0.05%, 2 – 0.1%, 3 – 0.2%, 4 – 0.5%
b: Dịng chất lỏng chạm dải chỉ thị và làm đổi màu chỉ thị c: Dịng chất lỏng chạy hết kit
Cụ thể đối với các nồng độ phenol red khác nhau, màu sắc của chỉ thị thay đổi như sau:
1 2 3 4
Hình 3.6: Kit thử với các nồng độ phenol red khác nhau sau khi nhúng dung dịch urea 2% Nồngđộ PR: 1 – 0.05%, 2 – 0.1%, 3 – 0.2%, 4 – 0.5%
Sự thay đổi màu sắc của chỉ thị là do NH3 được sinh ra từ phản ứng thủy phân urea xúc tác bởi enzyme urease cĩ trên kit. Dịng urea đi lên gặp enzyme urease trước, bị thủy phân tạo ra NH3làm tăng pH của dung dịch, sau đĩ di chuyển lên tiếp gặp chỉ thị và làm đổi màu của chỉ thị. Vì dung dịch urea cĩ nồng độ khá cao 2% nên phản ứng thủy phân xảy ra mạnh và tạo ra nhiều NH3, do đĩ dung dịch urea khơng cần chạm dải chỉ thị đã làm đổi màu chỉ thị như hình trên.
Sau khi dịng urea chạy hết kit, NH3được sinh ra tập trung ở đầu kit và làm cho màu sắc của chỉ thị trở nênđậm dần – màu hồng đậm như hình dưới đây:
Hình 3.7: Kit thử sau khi dung dịch urea chạy hết kit
Tất cả mẫu kit thử đều được so sánh với mẫu kit trắng (khơng cĩ urease trên kit). Dung dịch urea khơng bị thủy phân, khơng tạo NH3làm tăng pH nên khơng làm đổi màu của chỉ thị.
Hình 3.8: Kit thử trắng sau khi dung dịch urea chạy hết kit
Thời gian hiện màu của cả 4 mẫu kit thử trên đều ngắn (khoảng 5 – 7 phút). Trong 4 mẫu khi dung dịch urea chưa chạm dải chỉ thị thì màu sắc của phenol red nồng độ 0.5% dễ quan sát nhất (màu đỏ) nên chúng tơi chọn nồng độ chất chỉ thị cho lên kit là 0.5%. Lượng dung dịch phenol red trên một kit là 10µl để đảm bảo dải chỉ thị khơng bị loang và tạo một diện tích màu khoảng 1.5cm × (0.5 – 0.7)cm đủ để quan sát sự chuyển màu bằng mắt thường.