Các phương pháp phân tích urea cĩ thể phân loại thành 2 nhĩm phương pháp: trực tiếp và gián tiếp.
- Gián tiếp: gồm các phương pháp cĩ sự thủy phân bằng enzyme cơ chất urea trước khi thăm dị.
- Trực tiếp: gồm các phương pháp tạo ra sản phẩm cĩ màu sắc mà khơng cĩ sự thủy phân trước đĩ nhưng phương pháp này thường mở rộng bao gồm các phương pháp khơng cĩ sự thủy phân bởi enzyme,đo áp suất, chỉ số khúc xạ,đo hồng ngoại hay hấp thu UV…
Phương pháp DMAB (Tiêu chuẩn ngành 28 TCN 184: 2003,AOAC-967, 1997:[51]
Phạm vi áp dụng:
Tiêu chuẩn này quyđịnh phương phápđịnh tính urea trong sảnphẩm thủy sản.Giới hạn phát
hiện của phương pháp là 0,5 %.
Nguyên tắc:
Mẫu sản phẩm được chiết với dung dịch nước. Urea cĩ trong dịch chiết phản ứng với thuốc
thử p - dimethylaminobenzaldehyde (DMAB) tạo phức màu vàng chanhđặc trưng.
- Cân phân tích,độ chính xác 0,1mg.
- Giấy lọc Whatman số 40.
- Bếp điện.
- Máy nghiền đồng thể.
- Bình tam giác dung tích 50 ml.
- Đũa thủy tinh.
- Mặt kính đồng hồ.
Hĩa chất:phải là loại tinh khiết được sử dụng để phân tích, gồm:
- P-dimethylaminobenzaldehyde. - Ethanol, 95%.
- Acid chlohydrideđậm đặc, 12M.
Pha chế thuốc thử - dung dịch p-dimethylaminobenzaldehyde (DMAB): hịa tan 8.00 g DMAB trong 500ml ethanol rồi thêm 50ml acid chlohydric. Bảo quản dung dịch nơi tránh ánh sáng. Dung dịch sử dụng được trong vịng 1 tháng. Pha lỗng dung dịch 10 lần trước khi sử
dụng và chỉ sử dụng trong ngày.
Cách tiến hành:
- Chuẩn bị mẫu:
+ Đồng nhất khoảng 200 g mẫu thủy sản bằng máy nghiền đồng thể.
+ Cân 25 g mẫu đã xay nghiền đưa vào bình tam giác dung tích 50 ml. Thêm 25 ml nước cất
rồi khuấy trộn đều bằng đũa thủy tinh. Sau đĩ,đậy miệng bình bằng mặt kính đồng hồ.
+ Đun từ từ bình tam giác trên bếp điệnchođến sơi. Chú ý, khi đun phải lắc đều. Làm nguội
mẫu rồi dùng giấy lọc Whatman để lọc lấy dịch trong.
Tiến hành:
+ Nhỏ 5 - 6 giọt dịch mẫu vào trong ống nghiệm chứa 5 ml dung dịch thuốc thử urea. Dun nĩng dung dịch trong 1 phút. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Quan sát màu dung dịch.
Sử dụng huyền phù tế bào vi khuẩn Helibacter pylori như nguồn enzyme urease thơđể thủy phân urea tạo ammonia làm thayđổi pHđổi màu chất chỉ thị.
Hĩa chất:
- BromoCresol purple: 8mg BCP hịa tan trong 1.48 ml NaOH 10mM, định mức tới 100ml bằng nước cất. Thêm EDTA vàođể nồng độ EDTA là 0.2mM.Điều chỉnh pH hỗn hợp tới 5.1 bằng NaOH 0.1M. Bảo quản ở 4oC cho tới khi sử dụng.
- Huyền phù tế bào vi khuẩn Helibacter pylori: Nuơi vi khuẩn H.pylori trên thạch chocolate ở 37oC, tỷ lệ CO2/khơng khí là 1/9 (v/v),độ ẩm 98% (v/v) trong 3 ngày. Rửa tế bào khỏi đĩa thạch bằng đệm phosphate (phosphate buffer saline PBS, 0.05M, pH 7.2). Sauđĩ rửa 3 lần bằng PBS. Tiến hành ly tâm tốc độ 12000 v/p trong 10 phút và bảo quản ở -70oC cho tới khi sử dụng.
Cách tiến hành:
- Cho 10µl dung dịch mẫu trộn với 990µl dung dịch BCP, chỉnh pH tới 5.1 bằng HCl 0.1M.
- Cho 2µl huyền phùH.pyloritương ứng với hoạt tính là 1U.
- Ủ hỗn hợp trong 20 phút nhưng khơng quá 3 giờ ở nhiệtđộ phịng, đo quang phổ màu dung dịch tạo thành ở bước sĩng 588nm.
Để xây dựngđường chuẩn, sử dụng các dung dịch chuẩn urea cĩ nồngđộ từ 0 tới 50µM. Với phương pháp này, đường chuẩn urea cĩ thể tuyến tính tới 8.3mM. Bên cạnh đĩ, do khơng cần ly tâm và kết tủa nên phép phân tích này cĩ thểđược phát triểnđể sử dụng với 96- well microplates.
Phương pháp DAM (DIACETYLMONOXIME) Nguyên tắc:
Phương pháp này dựa trên tính oxy hĩa khử của diacetyl momoxime (cịn gọi là 2,3 butadion-monoxime) đối với urea tạo dẫn xuất diazine. Trong mơi trường acid và đun nĩng, với sự hiện diện của ion Fe3+, urea phản ứng với DAM tạo ra phức chất màu hồng. Màu của phức càngđậm (đỏ tím) khi nồngđộ urea càng cao.
Thiosemicarbazide cĩ tác dụngđệm và giữ cho bền màu nhờ >C=S. Nĩ cho phép khơng cần khử tạp chất protein và giúp cho phản ứngđược nhạy hơn nên giúp cho nồngđộ urea xét nghiệm sẽ tuyến tính theo mậtđộ quang OD.
Hĩa chất:
- Dung dịch urea chuẩn 15 mg/dl - Mẫu thử (serum hay plasma) - Nước cất
- Thuốc thử DAM, thuốc thử hiện màu Ferrithiocyanate
- Thiosemicarbazide
Dụng cụ:
- Ống nghiệm, pipette, cuvet
- Máy đo quang phổ, bể đun nước, bể nước đá lạnh
Tiến hành:
- Chuẩn bị 3 ống nghiệm lần lượt chứa 0.05ml nước cất, 0.05ml dung dịch chuẩn, 0.05ml mẫu thử.
- Cho vào mỗi ống 3ml thuốc thử DAM và lắc đều. - Cho thuốc thử hiện màu và lắc đều lần nữa.
- Đặt các ống nghiệm vào bể nước đã đun sơi, chờ trong 15 phút. - Làm nguội các ống nghiệm trong bể nước đá lạnh khoảng 2 phút. - Để chờ ở nhiệt độ phịng trong 1 phút.
- Đo quang phổ ở bước sĩng 520nm.
Tính kết quả:
Hàm lượng N_urea (BUN) trong mẫu thử được tính theo cơng thức: 357 . 0 BUN OD OD BUN std std t (mmol/l)
Trong đĩ: ODt: mật độ quang học mẫu thử ODstd: mật độ quang học mẫu chuẩn
Phương pháp Rappoport
Nguyên tắc: tương tự như phương pháp Nessler. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hĩa chất:
- Dung dịch urease trongđệm phosphate pH 7 - Dung dịch urea chuẩn 100mg/100ml
- Dung dịch acid tungstic:
A – dung dịch tungstate 2.2%: 2.2g Na2WO4.2H2O + 1000ml nước cất
B – dung dịch acid H2SO40.15N: 4.17ml H2SO4đậmđặcđịnh mức thành 1l. Trong ngày dùng, trộn A và B với thể tích bằng nhau.
- Thuốc thử Nessler
Tiến hành:
Bảng 1.9: Xác định hàm lượng urea theo phương pháp Rappoport
Hĩa chất Mẫu trắng (ml) Mẫu chuẩn urea (ml) Mẫu thí nghiệm (ml)
Dd urease 0.5 0.5 0.5 Dd urea chuẩn 0.1 Dd serum 0.1 Dd nước cất 0.6 0.5 0.5 Lắc ống nghiệm thật kỹ,để ở 40– 45oC trong 15 phút. Acid tungstic 1 1 1
Ly tâm lấy dịch phản ứng sau 3 – 5 phút.
Thuốc thử Nessler 0.5 0.5 0.5
Nước cất 4.5 4.5 4.5
Để 15 phút tạo màu rồiđo ở bước sĩng 490nm.
Từ các giá trịOD của mẫu thí nghiệm và mẫu chuẩn so với mẫu trắng, dựa vàođồ thị NH3chuẩn, tínhđược hàm lượng NH3trong mẫu chuẩn và trong mẫu thí nghiệm.
Tính kết quả:
100 m m C std 3 t 3 NH NH urea (mg/100ml) Trongđĩ: mNH3t: hàm lượng NH3của mẫu thí nghiệm (µg)
mNH3std: hàm lượng NH3của mẫu chuẩn (µg)
Giá trị tham khảo: Huyết thanh người bình thường: 15 – 50mg/100ml. Nước tiểu người bình thường: 20 – 35g/l.
Phương pháp Perkins: Nguyên tắc:
(NH2)2CO + H2O 2NH3+ CO2
Trong mơi trường nước, NH3 + CO2 (NH4)2CO3, dưới tác dụng của dung dịch base yếu NH3được phĩng thích. Dùng hơi nước lơi cuốn NH3và hấp thu trong dung dịch acid tiêu chuẩn 0.1N. Chuẩnđộ acid dư bằng dung dịch kiềm chuẩn 0.1N. Tính ra hàm lượng nitơ urea và hàm lượng urea cĩ trong mẫu.
Phương pháp xácđịnh urea trong huyết thanh: Nguyên tắc:
Enzyme urease thủy phân urea theo phương trình sau: (NH2)2CO + H2O 2NH3+ CO2
NH3 tạo thành sẽ phản ứng với thuốc thử natri nitroprusside Na2Fe(CN)5NO.2H2O và NaClO/NaOH cho hỗn hợp cĩ màu, cườngđộ màu tỷ lệ với nồngđộ NH3.
Dụng cụ:
- Ống nghiệm, pipette, cuvet - Máy quang phổ UV - VIS, bể điều nhiệt
- Thuốc thử 1: 50.66mg natri nitroprusside + 100ml nước cất, lấy 20ml + 1.9928g phenolđịnh mức thành 200ml dung dịch.
- Thuốc thử 2: 0.1639g NaOCl + 1g NaOH + 200ml nước cất.
Tiến hành: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Khuấy 0.1ml huyết thanh với 0.9ml dung dịch muối sinh lý NaCl 0.9%, lắcđều. Sauđĩ, dùng 0.2ml hỗn hợp nàyđể xácđịnh. Chuẩn bị các mẫu theo bảng sau:
Bảng 1.10:Xác định hàm lượng urea theo phương pháp Perkins
Thuốc thử (ml) Mẫu trắng (ml) Mẫu chuẩn urea (ml) Mẫu thí nghiệm (ml)
Dd urease 0.1 0.1 0.1 Dd urea chuẩn 0.2 Dd serum 0.2 Dd NaCl 0.9% 0.2 Lắc ống nghiệm thật kỹ,để ở 37 – 40oC trong 15 phút. Thuốc thử 1 5 5 5 Thuốc thử 2 5 5 5 Lắc thật kỹ,để ở 65 – 70oC,đo mậtđộ quang ở 540nm. Tính kết quả:
Nồngđộ urea và N_urea trong huyết thanhđược tính như sau:
std t urea OD OD 9 C (mg/100ml) std t OD OD 357 . 0 9 (mM) std t urea _ N OD OD 2 . 4 C (mg/100ml) std t OD OD 357 . 0 2 . 4 (mM)
Trong đĩ: ODt– mật độ quang học của mẫu thí nghiệm ODstd– mật độ quang học của mẫu chuan
9, 4.2 – nồng độ urea và N_urea trong dung dịch urea chuẩn 0.357 – hệ số chuyển đổi đơn vị