Nguyên tắc hoạt động của kit là dựa vào sự thay đổi màu sắc của chỉ thị khi pH mơi trường thay đổi. Trong bài luận văn này, chúng tơi nghiên cứu kit thử nhanh urea sử dụng enzyme urease để thủy phân urea cĩ trong mẫu phân tích nên sản phẩm tạo ra là NH3sẽ làm tăng pH, do đĩ làm đổi màu của chỉ thị.
Đầu tiên chúng tơi tiến hành đi tìm loại chất chỉ thị thích hợp để cho lên kit. Cĩ rất nhiều chất chỉ thị pH được sử dụng trong phịng thí nghiệm nhưng chúng tơi chỉ chọn ra những chất chỉ thị cĩ điểm chuyển màu sang mơi trường base lớn hơn 6.5 vì pH của nước cất khoảng 6.5. Khi dung dịch cĩ mặt NH3sẽ làm pH mơi trường lớn hơn 6.5 và làm đổi màu chỉ thị cho thấy cĩ sự tăng pH. Do đĩ, chúng tơi chọn 4 loại chất chỉ thị sau để khảo sát:
Bromocresol purple: khoảng chuyển màu 5.2 – 6.8
Bromothymol blue: khoảng chuyển màu 6.0 – 7.6
Neutral red: khoảng chuyển màu 6.8 – 8.0
Phenol red: khoảng chuyển màu 6.8 – 8.4
Hĩa chất làm thay đổi màu sắc của chỉ thị dùng trong phân tích urea là NH3 nên chúng tơi tiến hành thí nghiệm với dung dịch NH4OH để chọn ra chất chỉ thị thích hợp. Chỉ thị được cho là thích hợp sử dụng như là một thành phần của kit nên cĩ khả năng phát hiện sự cĩ mặt của NH4OH ở nồng độ càng thấp càng tốt.
Vì dung dịch NH4OH cĩ tính chất bay hơi, sau một số thí nghiệm khảo sát màu sắc của chỉ thị với nồng độ NH4OH giảm dần, chúng tơi chọn nồng độ bắt đầu là 10-3M rồi giảm dần nồng độ chođến khi dung dịch trở nên rất lỗng và chất chỉ thị khơng cịn khả năng phát hiện sự cĩ mặt của NH4OH nghĩa là cho màu sắc giống với màu sắc của chỉ thị trong nước cất (pH = 6.5).
Bảng 3.1: Khảo sát khả năng phát hiện của các loại chất chỉ thị Nồngđộ NH4OH (M) 10 -3 0.5×10-3 0.25×10-3 0.125×10-3 0.0625×10-3 0.03125×10-3 Khả năng phát hiện của BP + + + + + + Khả năng phát hiện của BB + + + + + - Khả năng phát hiện của NR + + + + - - Khả năng phát hiện của PR + + + + - - pH dd NH4OH 9.09 8.75 8.43 8.07 7.78 7.46 + : cĩ, - : khơng
BP: Bromocresol purple, BB: Bromothymol blue, NR: Neutral Red, PR: Phenol red
Kết quả đo pH dung dịch NH4OH khơng phù hợp với cơng thức pH = 14 – ½ (pKb– lgCb). Nguyên nhân là do dung dịch này cĩ tính chất bay hơi.
Ngồi ra, ta cĩ kết quả thí nghiệm màu sắc của chỉ thị trong nước cất và nước máy:
Hình 3.1: Màu sắc của chỉ thị trong nước cất (pH = 6.5)
Vì trong thực tế người ta cĩ thể pha urea trong nước máy (pH = 6.8) như nước dùng để ướp cá, thủy sản…nên ta chọn chất thị cĩ khoảng chuyển màu lớn hơn 6.8 để dễ dàng phân biệt màu sắc của chất chỉ thị ở mơi trường acid và base.
Khoảng chuyển màu và màu sắc của các loại chất chỉ thị như sau:
Bảng 3.1: Khoảng chuyển màu và màu sắc của các chất chỉ thị
Chất chỉ thị Khoảng chuyển màu Màu acid Màu base
Bromocresol purple 5.2 – 6.8 Vàng Tím
Bromothymol blue 6.0 – 7.6 Vàng Xanh
Neutral red 6.8 – 8.0 Đỏ Vàng
Phenol red 6.8 – 8.4 Vàng Đỏ
Từ 4 chất chỉ thị đề ra ban đầu, ta loại Bromocresol purple và Bromothymol Blue vì khoảng chuyển màu khơng lớn hơn 6.8. Khoảng chuyển màu của Neutral red và Phenol red gần giống nhau, tuy nhiên Neutral red trong mơi trường kiềm và trung tính cĩ màu sắc khĩ phân biệt (vàng và cam nhạt), trong khiđĩ Phenol red lại cĩ màu sắc trong 2 mơi trường này rất dễ phân biệt (hồng/đỏ và vàng). Theo kết quả thực nghiệm từ bảng 3.1, ta chọn chất chỉ thị tối ưu sử dụng cho kit là Phenol red.