Thiết lập phương pháp chế tạo bộ kit thử nhanh định lượng hàm lượng urê trong mẫu nước, nước thải và thực phẩm

Enzyme urease (EC 3.5.1.5)

• Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng của urease

Sự mất hoạt tính này tỷ lệ với lượng alk(en)yl thiosulfinates có trong dịch chiết, thời gian ủ với enzyme nhưng không phụ thuộc vào loại nhóm alk(en)yl trong thiosulfinates. Dịch chiết tỏi nên được bảo quản ở 4oC để duy trì khả năng ức chế vì thiosulfinates không bền và biến đổi theo thời gian thành các hợp chất bền hơn như polysulfides và thiosulphonates) [7]. Afast, Aslow– biên độ tính theo phần trăm hoạt tính bắt đầu của pha nhanh và pha chậm (%). kfast, kslow– hằng số vận tốc bậc 1 của pha nhanh và pha chậm. Khi nồng độ thiosulfinates trong dịch chiết tỏi tăng thì giá trị kfast và kslow tăng theo nhưng giá trị biên độ Afastvà Aslowgần như không thay đổi. Động học 2 pha như trên cũng đã được tìm thấy trong các nghiên cứu về sự ức chế enzyme urease từ 2 loài thực vật khác là Cajanus cajan và Citrullus vulgaris) bởi 5.5’- dithiobis-2-nitrobenzoic acid, p-chloromercuribenzoate, N-ethylmaleimide, acetohydroxamic acid và các kim loại nặng [29][30][41][42].

Các phương pháp thu nhận urease

• Nguồn thu nhận

Rabinkov và cộng sự (1998) đã nghiên cứu ảnh hưởng của allicin lên hoạt tính của các protein chứa nhóm thiol là papain và dehydrogenase và thấy rằng sự ức chế có tính chất bất thuận nghịch và phụ thuộc vào thời gian, nguyên nhân là do sự liên kết với nhóm –SH của enzyme. Gupta và Porter (2001) đã chứng minh rằng sự ức chế enzyme squalene monooxygenase bởi dịch chiết tỏi tươi cũng có tính chất bất thuận nghịch và phụ thuộc vào thời gian, nguyên nhân cũng là do sự liên kết chất ức chế với nhóm –SH ở trung tâm hoạt động của enzyme [15].

Các phương pháp xác định hoạt tính urease

Bằng phương pháp thẩm tích, dùng các màng bán thấm bằng vật liệu có kích thước lỗ màng nhỏ có thể cho các chất có phân tử lượng nhỏđi qua do chênh lệch áp suất và giữ lại các chất có phân tử lượng lớn.  Hoạt tính riêng của chế phẩm (specific activity): bằng số lượng đơn vị hoạt độ có trong 1đơn vị thể tích protein (đối với chế phẩm lỏng) hoặc trong 1 đơn vị khối lượng protein (đối với chế phẩm rắn).

Ứng dụng của enzyme urease

Enzyme urease được sử dụng để phân tích hàm lượng các kim loại nặng có trong nước đặc biệt là thủy ngân và qua đó nói lên mức độ ô nhiễm của nguồn nước. Do đó, việc sử dụng enzyme urease để xác định hàm lượng urea trong máu, nước tiểuđãđược các bác sĩ sử dụng do tính đặc hiệu của urease và cho kết quả nhanh, chính xác, ít tốn kém và dễ thực hiện.

Toồng quan veà urea

Nồng độ cao của urea (ureamia) có thể sinh ra các rối loạn thần kinh (bệnh não). Thời gian dài bị uremia có thể làmđổi màu da sang màu xám.  Sử dụng trong chẩn đoán khác:. Các loại urea chứa cacbon 14 - đồng vị phóng xạ, hay cacbon 13 - đồng vị ổn định) được sử dụng trong xét nghiệm thở urea, được sử dụng để phát hiện sự tồn tại của Helicobacter pylori trong dạ dày và tá tràng người. Nguyên nhân có thể do người ta cho urea vào nước mắm, hoặc là trong quá trình chế biến nước mắm đã hình thành urea một cách tự nhiên, cũng có thể là do lượng urea còn tồn tại trong sản phẩm hải sản trước khi đưa vào chế biến nước mắm,mà cũng có thể do có một vài loại cá nhưcá nhám chẳng hạn, bên ngoài da của nó cũng tiết ra urea.

Kit thử nhanh trong phân tích urea

7 Kit kiểm tra nhanh nitrite trong sản phẩm thịt đã chế biến < 5 8 Kit kiểm tra nhanh nitrate sử dụngđể bảo quản thực phẩm < 5 9 Kit kiểm tra nhanh salixylic trong một số loại thực phẩm < 5 10 Kit kiểm tra nhanh các thực phẩm sử dụng formol bảo quản < 5 11 Kit kiểm tra nhanh methanol trong các loại rượu < 5. Nói chung, hàm lượng urea cao có liên quan tới bệnh viêm thận, thiếu máu cục bộ ở thận, tắt nghẽn đường tiết niệu và các bệnh ngoài thận khác như nhồi máu cơ tim, bệnh gan và tiểu đường.

Nguyeõn lieọu

 Các mẫu nước mắm (Trung tâm Y tế Dự phòng), sữa (Trung tâm thu mua sữa của Vinamilk, quận Gò Vấp), nước đá ướp thủy sản (chợ Bình Điền, quận 7).

Phương pháp nghiên cứu

Nguyên tắc:cố định lên giấy 1 lượng chất chỉ thị với những nồng độ khác nhau, 1 lượng cố định enzyme urease và thí nghiệm với dung dịch urea để chọn ra lượng chất chỉ thị có khả năng tạo ra màu sắc dễ quan sát.  Nước cất+ EDTA 5mM: EDTA được bổ sung có tác dụng kết hợp ion kim loại tạp nhằm làm giảm sự ảnh hưởng của các ion nàyđến hoạt tính của urease vì có thể chúng sẽ là các chất ức chế do có cùng hóa trị với cofactor là Ni của urease.

Khảo sát các loại chất chỉ thị màu

Vì dung dịch NH4OH có tính chất bay hơi, sau một số thí nghiệm khảo sát màu sắc của chỉ thị với nồng độ NH4OH giảm dần, chúng tôi chọn nồng độ bắt đầu là 10-3M rồi giảm dần nồng độ chođến khi dung dịch trở nên rất loãng và chất chỉ thị không còn khả năng phát hiện sự có mặt của NH4OH nghĩa là cho màu sắc giống với màu sắc của chỉ thị trong nước cất (pH. Khoảng chuyển màu của Neutral red và Phenol red gần giống nhau, tuy nhiên Neutral red trong môi trường kiềm và trung tính có màu sắc khó phân biệt (vàng và cam nhạt), trong khiđó Phenol red lại có màu sắc trong 2 môi trường này rất dễ phân biệt (hồng/đỏ và vàng).

Khảo sát lượng chất chỉ thị thích hợp cho lên kit

Vì trong thực tế người ta có thể pha urea trong nước máy (pH = 6.8) như nước dùng để ướp cá, thủy sản…nên ta chọn chất thị có khoảng chuyển màu lớn hơn 6.8 để dễ dàng phân biệt màu sắc của chất chỉ thị ở môi trường acid và base. Lượng dung dịch phenol red trờn một kit là 10àl để đảm bảo dải chỉ thị khụng bị loang và tạo một diện tớch màu khoảng 1.5cm ì (0.5 – 0.7)cm đủ để quan sỏt sự chuyển màu bằng mắt thường.

Khảo sát dung môi pha urease

Điều này có thể là do nguồn nước cất của phòng thí nghiệm chứa rất ít kim loại tạp, do đó EDTA thay vì có tác dụng kết hợp với các ion kim loại này lại kết hợp với ion Ni2+ nằm ở trung tâm hoạt động của enzyme urease dẫn tới làm giảm hoạt tính của enzyme này (như đồ thị). Sự có mặt đồng thời EDTA và ion Ni2+trong dung môi pha urease với mục đích ban đầu là kết hợp tác dụng bắt các ion kim loại tạp trong nước của EDTA và hoạt hóa enzyme urease của Ni2+ nhưng kết quả đo hoạt tính ngược lại hoàn toàn.

Khảo sát lượng enzyme thích hợp cho lên kit

EDTA được bổ sung không những kết hợp với các ion Ni2+tự do mà còn kết hợp luôn với ion Ni2+nằm trong trung tâm hoạt động của urease do đó làm giảm mạnh hoạt tính của enzyme này. Cơ chế tiếp xúc của enzyme urease và urea trong nghiên cứu của chúng tôi là cho dòng dung dịch urea chạy từ từ lên kit đặt đứng hoặc nghiêng theo lực hút mao quản của giấy kit.

Khảo sát giới hạn phát hiện của kit, xây dựng thang màu bán định lượng urea và đường chuẩn pH

Trong trường hợp khụng quan sỏt rừ sự thay đổi màu sắc của chỉ thị sau khi nhỳng hoặc trường hợp nồng độ urea thấp hơn 50ppm, để định tính sự có mặt của urea ta có thể lắc sao cho kit thử ngập trong dung dịch mẫu thử và quan sát xem dung dịch có chuyển sang màu hồng hay không, nếu có chứng tỏ trong dung dịch có urea. Trong trường hợp mẫu thử ban đầu có pH cao hơn điểm chuyển màu của phenol red (pH > 8.4) nghĩa là làm cho màu sắc của chỉ thị trên kit trắng hóa hồng thì ta không thể định tính và bán định lượng sự có mặt của urea bằng màu sắc chỉ thị.

Khảo sát thời gian hiện màu của kit

Đối với dung dịch urea nồngđộ cao, dòng urea chưa cầnđi hết kitđã làmđổi màu chỉ thị nên thời gian hiện màu không quá 15 phút (nồng độ urea 5000ppm). Nguyên nhân là do sữa là một dung dịch keo chứa nhiều thành phần chất tan bên trong nên lực hút mao quản của mạng cellulose cấu tạo nên giấy kit không đủ lớn để kéo dòng chất lỏng lên nhanh như đối với dung dịch urea.

Khảo sát thời gian sử dụng của kit

Lượng hoạt tớnh enzyme urease cho lờn kit là 9.663 (àmol NH3/phỳt.kit) nhưng sau khi chấm lờn kit và đo lại hoạt tớnh thỡ giỏ trị hoạt tớnh giảm đi gần ẵ. Điều này cho thấy trong thời gian 10 ngày, hoạt tính của enzyme urease gần như không thay đổi nghĩa là kit có thể bảo quản hơn 10 ngày cho đến khi sử dụng với điều kiện ở nhiệt độ thấp (nhiệt độ tủ lạnh) để tránh sự mất hoạt tính của enzyme.

Khảo sát khả năng phát hiện của kit trong mẫu thực

Kết quả kiểm tra chỉ được công nhận từ phòng thí nghiệm nhưng việc kiểm tra chỉ được tiến hành khi sản phẩm có nguy cơ bị giảm chất lượng hoặc nhiễm các hóa chất cấm. Nếu kết quả kiểm tra cho thấy chất lượng nguồn thủy hải sản không tốt thì cơ quan chức năng và bà con sẽ tiến hành điều tra xem nguyên nhân xuất phát từ chợ hay từ các tỉnh, do người nuôi, người thu mua hay người vận chuyển, bên cạnh đó giảm thời gian giữa 2 lần kiểm tra.