Đánh giá khả năng tạo chất hoạt hóa bề mặt sinh học của vi khuẩn ứng dụng xử lý môi trường nhiễm kim loại nặng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NGUYỄN THỊ THU HÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG TẠO CHẤT HOẠT HÓA BỀ MẶT SINH HỌC CỦA VI KHUẨN, ỨNG DỤNG XỬ LÝ MÔI TRƯỜNG NHIỄM KIM LOẠI NẶNG LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NGUYỄN THỊ THU HÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG TẠO CHẤT HOẠT HÓA BỀ MẶT SINH HỌC CỦA VI KHUẨN, ỨNG DỤNG XỬ LÝ MÔI TRƯỜNG NHIỄM KIM LOẠI NẶNG Chuyên ngành: KHOA HỌC MÔI TRƯỜNG Mã số : 60 44 03 01 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS KIỀU THỊ QUỲNH HOA TS TRẦN THỊ HUYỀN NGA Hà Nội – Năm 2014 LỜI CẢM ƠN Trước tiên, xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới TS Kiều Thị Quỳnh Hoa, phó Trưởng phịng Phịng Vi Sinh Vật Dầu Mỏ, Viện Cơng nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, đồng hướng dẫn TS Trần Thị Huyền Nga Giảng viên Khoa Mơi trường, tận tình hướng dẫn truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm quý báu cho tơi suốt q trình thực tập làm luận văn tốt nghiệp Để hoàn thành luận văn này, xin cảm ơn cán bộ, học viên, sinh viên thuộc Phịng Vi Sinh Vật Dầu Mỏ, Viện Cơng nghệ Sinh học hỗ trợ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình làm thực nghiệm Đồng thời, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành đến tập thể thầy cô giáo Khoa Môi trường, Trường Đại học Khoa học tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội truyền thụ kiến thức q báu cho tơi suốt q trình học tập Cuối cùng, tơi xin cảm ơn gia đình, bạn bè, người quan tâm giúp đỡ, động viên khuyến khích tơi suốt thời gian qua để tơi hồn thành luận văn tốt Tuy có cố gắng định thời gian trình độ có hạn nên chắn luận văn có nhiều thiếu sót hạn chế định Kính mong nhận góp ý thầy bạn Hà Nội, tháng 12 năm 2014 Học viên cao học Nguyễn Thị Thu Hà CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN KLN Kim loại nặng CHHBMSH Chất hoạt hóa bề mặt sinh học CHHBM Chất hoạt hóa bề mặt TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam CMC Nồng độ mixen tối thiểu HC Hydrocacbon WHO Tổ chức sức khỏe giới EEC Cộng đồng kinh tế Châu Âu DNA Deoxyribonucleoic Acid BTNMT Bộ tài ngun mơi trường HKTS Hiếu khí tổng số DO Diesel Oil DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Hàm lượng KLN chất thải số mỏ vàng điển hình Úc…….5 Bảng 1.2 Phân loại CHHBMSH tạo từ vi sinh vật…………………………….… 14 Bảng 1.3 Một số lồi vi sinh vật có khả tạo CHHBMSH………………….… 19 Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc tế bào 24 chủng vi khuẩn nghiên cứu 38 Bảng 3.2 Khả sinh trưởng tạo CHHBMSH chủng vi khuẩn nghiên cứu…………………………………………………………………………….40 Bảng 3.3 Khả loại Cd Pb CHHBMSH tạo từ chủng CB5a………… 55 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Mối quan hệ nồng độ CHHBMSH hình thành mixen, sức căng bề mặt……………………………………………………………………….26 Hình 1.2 Cơ chế loại kim loại nặng từ đất CHHBMSH………………………… 27 Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc chủng vi khuẩn CB5a…………………………….42 Hình 3.2 Hình thái tế bào chủng CB5a kính hiển vi điện tử quét ……….42 Hình 3.3 Ảnh hưởng nguồn carbon khác đến sinh trưởng tạo CHHHBMSH chủng CB5a……………………………………………………….44 Hình 3.4 Khả tạo CHHBMSH chủng CB5a nguồn carbon khác nhau……………………………………………………………………………… ….44 Hình 3.5 Ảnh hưởng nồng độ glycerol đến sinh trưởng tạo CHHBMSH chủng CB5a……………………………………………………………………… 46 Hình 3.6 Khả tạo CHHBMSH chủng CB5a hàm lượng glycerol nuôi cấy khác nhau…………………………………………………………………….47 Hình 3.7 Ảnh hưởng nguồn nitơ khác đến trình sinh trưởng tạo CHHBMSH chủng CB5a………………………………………………………….48 Hình 3.8 Khả tạo CHHBMSH chủng CB5a nguồn nitơ khác nhau….48 Hình 3.9 Ảnh hưởng hàm lượng Urea đến sinh trưởng tạo CHHBMSH chủng CB5a……………………………………………………………………………50 Hình 3.10 Khả sinh trưởng tạo CHHBMSH chủng CB5a hàm lượng Urea khác nhau…………………………………………………………………………50 Hình 3.11 Ảnh ưởng nhiệt độ đến khả sinh trưởng tạo CHHBMSH chủng CB5a…………………………………………………………………………….51 Hình 3.12 Khả tạo CHHBMSH chủng CB5a nhiệt độ khác nhau… 52 Hình 3.13 Ảnh hưởng pH đến khả sinh trưởng tạo CHHBMSH chủng CB5a……………………………………………………………………………………53 Hình 3.14 Khả tạo CHHBMSH chủng CB5a điều kiện pH môi trường khác nhau………………………………………………………………………………54 MỤC LỤC MỞ ĐẦU……………………………………………………………………… .1 CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU…………………………………………………….3 1.1 Ô nhiễm kim loại nặng……………………………………………………………… 1.1.1 Khái niệm kim loại nặng……………………………………………………………3 1.1.2 Tính độc hại kim loại nặng……………………………………………… 1.1.3 Ô nhiễm Chì (Pb)……………………………………………………………………6 1.1.3.1 Sự phân bố - dạng tồn chì mơi trường………………………………6 1.1.3.2 Nguồn nhiễm…………………………………………………………………………7 1.1.3.3 Tính độc Chì…………………………………………………………………… 1.1.4 Ơ nhiễm Cadimi (Cd)…………………………………………………………… 10 1.1.4.1 Sự phân bố - dạng tồn cadimi môi trường………………… .10 1.1.4.2 Nguồn ô nhiễm……………………………………………………………………… 11 1.1.4.3 Tính độc Cadimi…………………………………………… 11 1.1.5 Hiện trạng nhiễm Chì Cadimi Việt Nam………………………………….12 1.2 Chất hoạt hóa bề mặt sinh học (CHHBMSH)………………………… 13 1.2.1 Khái niệm chất hoạt hóa bề mặt sinh học……………………………………….13 1.2.2 Phân loại chất hoạt hóa bề mặt sinh học………………………………… …….13 1.2.3 Tính chất chất hoạt hóa bề mặt sinh học……………………………… .16 1.2.3.1 Hoạt tính bề mặt……………………………………………………………… 16 1.2.3.2 Khả chịu nhiệt, pH chịu lực ion………………………………….….….17 1.2.3.3 Khả phân hủy sinh học tính độc thấp…………………………….…….17 1.2.3.4 Sự hình thành nhũ hóa chủa CHHBMSH……………………………………… 17 1.2.3.5 Đa dạng cấu trúc hóa học………………………………………………… .18 1.2.4 Vi sinh vật có khả tạo chất hoạt hóa bề mặt sinh học………………… 18 1.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả tạo chất hoạt hóa bề mặt sinh học……… 20 1.2.5.1 Ảnh hưởng nguồn cacbon…………………………………………… 20 1.2.5.2 Ảnh hưởng nguồn nitơ……………………………………………………… 21 1.2.5.3 Ảnh hưởng yếu tố môi trường……………………………………… … 22 1.2.6 Ứng dụng chất hoạt hóa bề mặt sinh học công nghiệp xử lý ô nhiễm môi trường…………………………………………………………………………………….22 1.3 Một số phương pháp xử lý kim loại nặng…………………………………… .23 1.3.1 Xử lý phương pháp hóa học……………………………………………….23 1.3.2 Xử lý phương pháp hóa lý…………………………………………… 23 1.3.3 Xử lý phương pháp sinh học…………………………………………… 24 1.4 Xử lý kim loại nặng chất hoạt hóa bề mặt sinh học……………………… 25 1.4.1 Cở chế xử lý đất nhiễm kim loại nặng CHHBMSH……………………… 25 1.4.2 Tình hình nghiên cứu giới Việt Nam…………………………………27 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…………………………29 2.1 Vật liệu…………………………………………………………………………………29 2.1.1 Chủng giống……………………………………………………………………… 29 2.1.2 Hóa chất……………………………………………………………………… .29 2.1.3 Thiết bị máy móc………………………………………………………………… 30 2.1.4 Mơi trường ni cấy……………………………………………………………… 30 2.2 Phương pháp nghiên cứu…………………………………………………………… 31 2.2.1 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái vi khuẩn……………………… 31 2.2.2 Phương pháp xác định Gram vi khuẩn……………………………………… 32 2.2.3 Phương pháp quan sát hình thái tế bào kính hiển vi quang học 32 2.2.4 Phương pháp quan sát hình thái tế bào kính hiển vi điện tử quét (SEM - Scanning Electron Microscope) 32 2.2.5 Phương pháp phân lập vi khuẩn tạo CHHBSMH môi trường chọn lọc .33 2.2.6 Phương pháp đánh giá khả sinh tổng hợp CHHBMSH chủng vi khuẩn phân lập thơng qua số nhũ hố E24 .33 2.2.7 Đánh giá khả sinh trưởng vi khuẩn dựa vào phương pháp đo độ đục dung dịch nuôi cấy (OD) .34 2.2.8 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện môi trường nuôi cấy lên khả sinh trưởng tạo CHHBMSH 34 2.2.9 Lên men, tách chiết tinh CHHBMSH 35 2.2.10 Loại Cd Pb từ đất nhiễm CHHBMSH………………………… …35 2.2.11 Phân tích trình tự gen 16S rDNA định tên đến lồi chủng CB5a…………… 36 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc, đặc điểm gram chủng vi khuẩn phân lập 38 3.2 Khả tạo CHHBMSH chủng vi khuẩn 40 3.3 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào chủng vi khuẩn CB5a……………41 3.4 Định tên lồi chủng CB5a…….…………………………………………………….43 3.5 Ảnh hưởng yếu tố mơi trường đến khả tạo CHHBMSH chủng vi khuẩn nghiên cứu……………………………………………………………………… 43 3.5.1 Ảnh hưởng nguồn cacbon lên trình sinh trưởng tạo CHHBMSH chủng vi khuẩn nghiên cứu………………………………………………………… 43 3.5.2 Ảnh hưởng nồng độ Glycerol……………………………………………… 45 3.5.3 Ảnh hưởng nguồn nitơ …………………………………………………… 47 3.5.4 Ảnh hưởng nồng độ Urea đến trình sinh trưởng tạo CHHBMSH chủng CB5a…………………………………………………………………………… 49 3.5.5 Ảnh hưởng nhiêt độ nuôi cấy……………………………………………… 51 3.5.6 Ảnh hưởng pH đến khả sinh trưởng tạo CHHBMSH chủng CB5a………………………………………………………………………………….52 3.6 Nghiên cứu khả xử lý đất nhiễm Cd Pb từ đất CHHBMSH tạo chủng CB5a……………………………………………………………… 54 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ………………………………………………………… 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………………………………… 57 MỞ ĐẦU Ô nhiễm kim loại nặng vấn đề môi trường quan tâm Việt Nam giới Ô nhiễm kim loại nặng gia tăng với phát triển q trình cơng nghiệp hóa hoạt động khai thác khoáng sản Kim loại nặng Pb, Cd, Cr, Cu, As, Zn, Hg Ni xem nguyên tố gây ô nhiễm Sự tích tụ kim loại nặng độc hại đất nước gây ảnh hưởng tiêu cực tới người, sinh vật môi trường xung quanh Đặc biệt, người, bệnh thường gặp vùng ô nhiễm kim loại nặng bệnh viêm đường hô hấp, quái thai, gan, thận, ung thư, sẩy thai, thai chết lưu Các phương pháp thường sử dụng để xử lý đất nhiễm kim loại nặng bao gồm: kết tủa, hấp phụ, trao đổi ion, ổn định hóa, chơn lấp Tuy nhiên, phương pháp kết tủa, hấp phụ, trao đổi ion thường có giá thành cao, gây ô nhiễm thứ cấp sử dụng nhiều hóa chất, phương pháp ổn định hóa chơn lấp lại địi hỏi nhiều diện tích để xử lý Với đặc tính tính hịa tan, ổn định tạo phức bền với kim loại, chất hoạt hóa bề mặt sinh học (CHHBMSH) tạo vi sinh vật có tiềm xử lý hiệu kim loại từ môi trường ô nhiễm CHHBMSH hợp chất sinh học vi sinh vật (vi khuẩn, nấm men, nấm mốc) tạo chứa hai nhóm chức ưa nước kị nước phân tử Vì vâỵ, chúng tập trung tác động tương hỗ với làm giảm sức căng bề mặt, đồng thời làm giảm lực hút tĩnh điện bề mặt tiếp giáp hai pha (lỏng –lỏng; lỏng – rắn) giúp CHHBMSH (tích điện âm) dễ dàng tiếp xúc tạo phức bền vững với kim loại nặng (tích điện dương) Ưu điểm việc ứng dụng CHHBMSH để xử lý kim loại nặng tính tương hợp, khả phân hủy sinh học, an tồn với mơi trường, giá thành rẻ tận dụng chất thải làm nguồn carbon, nitơ, không tạo nhiều cặn dư thừa gây ô nhiễm thứ cấp cho môi trường chịu yếu tố môi trường (pH, nhiệt độ, ) khắc nghiệt Do ưu điểm vượt trội kể trên, nghiên cứu xử lý kim loại nặng CHHBMSH thu hút quan tâm OD 600nm 70 4.5 60 Chỉ số nhũ hóa E24 (%) 50 3.5 40 2.5 30 1.5 20 10 0.5 0 Thời gian (ngày) 0g/l E24 0.5g/l E24 1g/l E24 2g/l E24 3g/l E24 4g/l E24 5g/l E24 6g/l E24 7g/l E24 8g/l E24 0g/l OD 0.5g/l OD 1g/l OD 2g/l OD 3g/l OD 4g/l OD 5g/l OD 6g/l OD 7g/l OD 8g/l OD Hình 3.9 Ảnh hưởng hàm lượng Urea đến sinh trưởng tạo CHHBMSH chủng CB5a Hình 3.10 Khả sinh trưởng tạo CHHBMSH chủng CB5a hàm lượng Urea khác 50 3.5.5 Ảnh hưởng nhiêt độ nuôi cấy Các điều kiện môi trường nuôi cấy nhiệt độ ảnh hưởng đến khả hoạt động enzym tham gia vào q trình sinh trưởng tạo CHHBMSH Do đó, sau khảo sát khả tạo CHHBMSH chủng CB5a, tiến hành đánh giá ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng khả tạo CHHBMSH chủng Chủng CB5a nuôi cấy môi trường khống có bổ sung 2g urea/l 2% glycerol nhiệt độ: 25, 30, 37, 42oC Kết hình 3.11 3.12 cho thấy, chủng vi khuẩn CB5a có khả sinh trưởng tạo CHHBMSH tốt khoảng nhiệt độ từ 30 đến 37oC, tốt 37oC với số E24 63% mật độ tế bào cực đại OD = 4,02 sau ngày nuôi lắc Ở nhiệt độ 25oC chủng CB5a sinh trưởng với số nhũ hóa E24 đạt 27% Ở 42oC chủng CB5a sinh trưởng yếu khơng tạo CHHBMSH Vì vậy, chúng tơi chọn 37oC nhiệt độ thích hợp cho nghiên cứu OD 600nm 70 4.5 60 Chỉ số nhũ hóa E24 (%) 3.5 50 40 2.5 30 1.5 20 10 0.5 25 oC E24 30 oC E24 37 oC E24 42 oC E24 25 oC OD 30 oC OD 37 oC OD 42 oC OD 0 Thời gian (ngày) Hình 3.11 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh trưởng tạo CHHBMSH chủng CB5a 51 Hình 3.12 Khả tạo CHHBMSH chủng CB5a nhiệt độ khác 3.5.6 Ảnh hưởng pH đến khả sinh trưởng tạo CHHBMSH chủng CB 5a pH môi trường nhân tố quan trọng ảnh hưởng tới sinh trưởng tạo CHHBMSH vi sinh vật Do vậy, tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng pH đến trình sinh trưởng tạo CHHBMSH chủng CB5a với giá trị pH khác nhau: 4; 5; 6; 7; 8; 9; 10; 11 Chủng CB5a nuôi cấy mơi trường khống bổ sung 2% (v/v) glycerol, 2g urea/l 37oC với giá trị pH từ đến 11 52 OD 600nm 70 4.5 60 3.5 50 Chỉ số nhũ hóa E24 (%) 40 2.5 30 1.5 20 10 0.5 0 Thời gian (ngày) pH4 E24 pH5 E24 pH6 E24 pH7 E24 pH8 E24 pH9 E24 pH10 E24 pH11 E24 pH4 OD pH5 OD pH6 OD pH7 OD pH8 OD pH9 OD pH10 OD pH11 OD Hình 3.13 Ảnh hưởng pH đến khả sinh trưởng tạo CHHBMSH chủng CB5a Kết hình 3.13 3.4 cho thấy, chủng CB5a có khả tạo CHHBMSH cao dải pH ÷ sau ngày ni cấy với số nhũ hóa E24 đạt cực đại dao động từ 54,2 đến 60% Ở pH7, sinh trưởng tạo CHHBMSH chủng CB5a cao với số E24 60% mật độ tế bào 4,01 Ở pH4, chủng CB5a sinh trưởng kém, số E24 đạt 48% với mật độ tế bào 3,02 Ở pH10 pH11 chủng CB5a có tốc độ sinh trưởng tạo CHHBM thấp số E24 đạt 32% 28% với mật độ tế bào 2,6 2,2 Do đó, chúng tơi chọn pH cho thí nghiệm 53 Hình 3.14 Khả tạo CHHBMSH chủng CB5a điều kiện pH môi trường khác 3.6 Nghiên cứu khả xử lý đất nhiễm Cd Pb CHHBMSH tạo chủng CB5a Mẫu đất nhiễm Chì Cadimi lắc với CHHBMSH tạo chủng CB5a ngày 37oC, 180 vòng/phút Sau ngày xử lý, mẫu ly tâm mang phân tích hàm lượng Chì Cadimi đất Kết sau phân tích Bảng 3.5 cho thấy hiệu loại Cd Pb CHHBMSH tạo chủng vi khuẩn CB5a tương đối cao Hàm lượng Cd mẫu đất nhiễm Cd sau xử lý 66,66 mg/kg, giảm 78% so với hàm lượng Cd ban đầu (303mg/kg) Và hàm lượng Pb lại mẫu đất nhiễm Pb sau xử lý 54 80,09mg/kg, giảm 89% so với hàm lượng Pb ban đầu (899,9mg/kg) Trong đó, 5,6% Cd 9% Pb loại học (được xác định mẫu đối chứng đất nhiễm kim loại lắc với nước khử ion) Bảng 3.3 Khả loại Cd Pb CHHBMSH tạo từ chủng CB5a Thí nghiệm loại Pb Cd CHHBMSH tạo từ chủng CB5a Mẫu đất Đất tự nhiên Đất nhiễm Pb Đât nhiễm Cd Mẫu đối chứng Kim loại tổng số Trước xử lý Sau xử lý Trước xử lý Sau xử lý Trước xử lý Sau xử lý Cd (mg/kg) 0,81