Nghiên cứu khả năng tạo chất hoạt hóa bề mặt sinh học của vi khuẩn nhằm ứng dụng loại CADIMI từ đất ô nhiễm

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TẠO CHẤT HOẠT HÓA BỀ MẶT SINH HỌC CỦA VI KHUẨN NHẰM ỨNG DỤNG LOẠI CADIMI TỪ ĐẤT Ô NHIỄM Người hướng dẫn: TS Kiều Thị Quỳnh Hoa Sinh viên thực hiện: Ngô Thị Hiền Lớp: 11.04 Hà Nội- 2015 LỜI CẢM ƠN Trước tiên, em xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo khoa Công nghệ Sinh học,Viện Đại học Mở Hà Nội tận tình giảng dạy truyền đạt cho em kiến thức năm học trường Em xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới TS Kiều Thị Quỳnh Hoa, Trưởng phòng Phòng Vi sinh vật dầu mỏ, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tận tình hướng dẫn truyền đạt kinh nghiệp quý báu giúpem thực khóa luận tốt nghiệp Em xin cảm ơn tập thể cán Phòng Vi sinh vật dầu mỏ, Viện Công nghệ Sinh học giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho em thực tập phòng Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình, bạn bè người bên cạnh động viên, giúp đỡ em suốt trình học tập hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Hà Nội, ngày….tháng Sinh viên Ngô Thị Hiền ….năm 2015 Khóa luận tốt nghiệp Ngô Thị Hiền MỤC LỤC KÍ HIỆU VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH, ĐỒ THỊ MỞ ĐẦU PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Ô nhiễm cadimi 1.1.1 Tính độc hại cadimi 1.1.2 Nguồn thải cadimi 1.1.3 Tác động cadimi đến môi trường người 1.2 Một số phương pháp xử lý cadimi 1.2.1 Phương pháp hóa học 1.2.2 Xử lý phương pháp hóa lý 1.2.3 Phương pháp sinh học 1.3 Chất hoạt hóa bề mặt sinh học 1.3.1 Khái niệm chất hoạt hóa bề mặt sinh học 1.3.2 Phân loại chất hoạt hóa bề mặt sinh học 1.3.3 Tính chất chất hoạt hóa bề mặt sinh học 12 1.3.4 Ứng dụng chất hoạt hóa bề mặt sinh học đời sống 12 1.3.5 Ứng dụng chất hoạt hóa bề mặt sinh học đến xử lý ô nhiễm Cd 13 1.4 Phương pháp xử lý kim loại nặng chất hoạt hóa bề mặt sinh học 14 1.4.1 Vi khuẩn có khả tạo chất hoạt hóa bề mặt sinh học 14 1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến tổng hợp chất hoạt hóa bề mặt sinh học 14 1.4.2.1 Ảnh hưởng nguồn carbon 14 1.4.2.2 Ảnh hưởng nitơ 14 1.4.2.3 Ảnh hưởng yếu tố pH 15 1.4.2.3 Ảnh hưởng yếu tố nhiệt độ 15 PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Vật liệu 16 2.1.1 Chủng vi khuẩn 16 2.1.2 Hóa chất môi trường nuôi cấy 16 Khóa luận tốt nghiệp Ngô Thị Hiền 2.2 Phương pháp nghiên cứu 17 2.2.1 Phương pháp xác định hình thái khuẩn lạc tế bào vi khuẩn 17 2.2.2 Phân loại vi khuẩn nghiên cứu kit chuẩn sinh hoá API 50 CHB 19 2.2.3 Phương pháp đánh giá khả tạo CHHBMSH chủng vi khuẩn phân lập dựa số E24 19 2.2.4 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện môi trường nuôi cấy lên khả sinh trưởng tạo CHHBMSH 19 2.2.5 Phương pháp loại Cd từ đất ô nhiễm CHHBMSH 20 PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20 3.1.Đặc điểm hình thái chủng ĐM 26 20 3.2 Kết sốc nhiệt 21 3.3.Phân loại chủng ĐM 26 kit chuẩn sinh hóa API 50 CHB 22 3.4 Ảnh hưởng nguồn carbon đến trình sinh trưởng tạo CHHBMSH 24 3.7 Đánh giá hiệu xử lý đất nhiễm cadimi CHHBMSH tạo từ chủng ĐM 26 33 KẾT LUẬN 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 KÍ HIỆU VIẾT TẮT Cd Cadimi CHHBMSH Chất hoạt hóa bề mặt sinh học EPS Extracellular polymeric substance (polyme ngoại bào) HKTS Hiếu khí tổng số KLN Kim loại nặng OD Optimal Density (mật độ quang) CMC Critical micellar concentration (hàm lượng mixen tới hạn) DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Máy móc thiết bị Bảng 2: Kết thử Kít Bảng Kết phân tích đất DANH MỤC HÌNH, ĐỒ THỊ Hình 1: Kim loại Cadimi Hình 2: Chứng teo thận bệnh itai itai gây sống vùng ô nhiễm Cadimi Hình 3: Công thức cấu tạo trelaloselipid Hình 4: Công thức cấu tạo Sophorolipid Hình 5: Công thức rhamnolupid Hình 6: Hình thái khuẩn lạc chủng vi khuẩn 26 môi trường HKTS 0% NaCl Hình 7: Hình ảnh sốc nhiệt chủng ĐM26 Hình 8: Kết thử Kít Hình 9:Ảnh hưởng nguồn carbon lên trình sinh trưởng tạo CHHBMSH chủng ĐM 26 Hình 10: Khả nhũ hóa xylen chủng ĐM 26 nguồn Carbon khác Hình 11: Ảnh hưởng nồng độ glucose khác tới khả sinh trưởng tạo CHHBMSH chủng ĐM 26 Hình 12: Khả nhũ hóa với xylen chủng ĐM 26 nồng độ glucose khác Hình 13 Ảnh hưởng nguồn nitơ khác đến khả sinh trưởng tạo CHHBMSH chủng ĐM 26 Hình 14 Khả nhũ hóa xylen chủng ĐM 26 nguồn nitơ khác Hình 15 Ảnh hưởng nồng độ NH4NO3 tới khả sinh trưởng tạo CHHBMSH chủng ĐM 26 Hình 16 Khả nhũ hóa xylen chủng ĐM 26 với nồng độ NH4NO3 khác Hình 17 Ảnh hưởng yếu tố pH tới khả sinh trưởng tạo CHHBMSH chủng ĐM 26 Hình 18 Khả nhũ hóa xylen chủng ĐM 26 pH khác Hinh 19 Ảnh hưởng nhiệt độ tới khả sinh trưởng tạo CHHBMSH chủng ĐM 26 Hình 20 Khả nhũ hóa xylen chủng ĐM 26 nhiệt độ khác MỞ ĐẦU Kim loại nặng (Cd, Pb, Cr, Zn, Cu, Hg,…) từ trình sản xuất công nghiệp, nông nghiệp, khai khoáng, luyện kim, sản xuất tái chế đồ dùng kim loại gây tác động tiêu cực đến sức khỏe người môi trường sống Những kim loại tích tụ môi trường xâm nhiễm vào thể người thông qua hô hấp, tiêu hóa, da gây nên số bệnh đường hô hấp, ung thư da, ung thư phổi, nhuyễn xương, rối loạn đường tiết niệu, viêm cầu thận.… Một số kim loại (Ca, Mg, Fe, Zn) yếu tố vi lượng cần thiết cho sống, nhiên có kim loại (Cd, Hg, Pb…) không cần thiết cho sống mà gây hại đến sức khỏe người sinh vật khác Hiện nay, có nhiều phương pháp xử lý Cd phương pháp kết tủa hóa học, phương pháp hấp phụ, phương pháp trao đổi ion,…Tuy nhiên, phương pháp thường gây ô nhiễm thứ cấp chi phí hoạt động lớn Gần đây, phương pháp xử lý ô nhiễm kim loại nặngnói chung Cd nói riêng chất hoạt hóa bề mặt sinh học (CHHBMSH) vi sinh vật tạo rathu hút quan tâm nghiên cứu nhiều nhà khoa học nước giới CHHBMSH hợp chất sinh học chứa hai nhóm chức ưa nước kị nước phân tử Do đó, CHHBMSH làm giảm sức căng bề mặt lực hút tĩnh điện bề mặt tiếp xúc hai pha (lỏng-lỏng; lỏng-rắn); giúp chúng dễ dàng tiếp xúc tạo phức với kim loại nặng Phương pháp đánh giá cao ưu điểm: giá thành phù hợp, xử lý triệt để, an toàn với môi trường dokhả phân hủy sinh học nên không gây ô nhiễm thứ cấp, tạo bọt cao, chịu nhiệt, pH chịu lực ion tốt Cùng với chì thủy ngân, cadimi (Cd) kim loại nặng độc hại người môi trường sống Vì vậy,chúng tiến hành nghiên cứu đề tài “ Nghiên cứu khả tạo chất hoạt hóa bề mặt sinh học vi khuẩn nhằm ứng dụng loại cadimi từ đất ô nhiễm” Mục tiêu nghiên cứu: - Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến trình sinh trưởng tạo CHHBMSH chủng vi khuẩn - Đánh giá khả loại cadimi (Cd) đất ô nhiễm CHHBMSH tạo chủng vi khuẩn nghiên cứu Saccarose E24 60 Glucose E24 Lactose E24 50 Galacto E24 30 20 DO E24 OD 600 nm E24 (%) 40 Đậu nành E24 Olive E24 Saccarose OD Glucose OD Lactose OD 10 0 Galacto OD DO OD Đậu nành OD Olive OD Thời gian (ngày) Hình Ảnh hưởng nguồn carbon lên trình sinh trưởngvà tạo CHHBMSH chủng ĐM 26 Hình 10 Khả nhũ hóa xylen chủng ĐM 26 nguồn carbon khác 25 Kết hình hình 10 cho thấy chủng ĐM 26 có khả sinh trưởng tạo CHHBMSH tốt nguồn carbon Glucose Saccarose Sau ngày nuôi cấy chủng ĐM 26 sinh trưởng tạo CHBMSH cao với nguồn carbon glucose, với số E24 lên tới 54,7% OD đạt 5,928 Với nguồn carbon saccarose chủng có khả sinh trưởng tốt với số E24 51,7% OD 5,872 Tuy nhiên, chủng không sinh trưởng tạo CHHBMSH nguồn carbon dầu oliu, đậu nành dầu DO; glucose chọn nguồn carbon cho thí nghiệm 3.5 Ảnh hưởng nồng độ carbon đến trình sinh trưởng tạo CHHBMSH Chủng ĐM26 nuôi cấy môi trường khoáng bổ sung glucose với nồng độ khác (0%; 1%; 1,5%; 2%; 2,5%; 3%; 3;5%và 5%) để tiến hành lựa chọn nồng độglucose thích hợp mà chủng ĐM26 tạo CHHBMSH tốt nhất(hình 11 12) 60 50 0% E24 1% E24 1.50% E24 2% E24 2.50% E24 30 20 OD-600nm E24 (%) 40 3% E24 3.50% E24 5% E24 0% OD 1% OD 10 0 1.50% OD 2% OD Thời gian (ngày ) 2.50% OD 3% OD 3.50% OD 5% OD Hình11: Ảnh hưởng nồng độglucose khác tới khả sinh trưởng tạo CHHBMSHcủa chủng ĐM 26 26 Hình 12:Khả tạo CHHBMSH chủng ĐM26 vớinồng độ glucose khác Kết hình 11 12 cho thấy với nồng độ glucose từ 1,5% đến 3% chủng ĐM 26 sinh trưởng tạo CHHBMSH tốt sau ngày nuôi cấy với độ nhũ hóa 56, 54, 48, 46 % Sau ngày nuôi cấy, chủng ĐM 26 sinh trưởng tạo CHBMSH cao với nồng độ glucose 1,5%, số E24 lên tới 56 % OD đạt cực đại 3.852 Còn với nồng độ 2%, 2,5%, 3% có số nhũ hóa cao 54%, 46% 48% Ở nồng độ khác, khả sinh trưởng cà tạo CHHBMSH chủng ĐM 26 thấp hơn, với nồng độ glucose 3,5% 5% số nhũ hóa thấp 14% 8,2 %.Như nông độ glucose 1,5% sử dụng cho thí nghiệm 3.6 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến trình sinh trưởng tạo CHHBMSH Ngoài nguồn carbon,tiến hành nghiên cứu sinh trưởng tạo CHHBMSH chủng ĐM 26 nguồn nitơ khác với nồng độglucose 1,5% Để xác định nguồn nitơ thích hợp, chủng ĐM 26 nuôi lắc (180 vòng/phút) nguồn nitơ (2g/l): NH4NO3, (NH4)3PO4, NH4Cl, (NH4)2SO4, NaNO3, ure 27 60 50 (NH4)3PO4 E24 NH4NO3 E24 NH4Cl E24 E 24 (%) 40 30 20 OD 600 nm 10 0 Thời gian (ngày) (NH4)2SO4 E24 NaNO3 E24 Ure E24 (NH4)3PO4 OD NH4NO3 OD NH4Cl OD (NH4)2SO4 OD NaNO3 OD Ure OD Hình 13 Ảnh hưởng nguồn nitơ khác đến khả sinh trưởng tạo CHHBMSH chủng ĐM 26 Hình 14.Khả tạo CHHBMSH chủng ĐM26 với hàm lượng glucose khác Kết hình 13 14cho thấy chủng ĐM26 tạo CHHBMSH tốt với nguồn nitơ NH4NO3, số E24 lên tới 56,5% OD 6,808.Do đó, lựa chọn NH4NO3 làm nguồn nitơ cho thí nghiệm 28 3.7 Ảnh hưởng nồng độ NH4NO3 đến trình sinh trưởng tạo CHHBMSH Để xác định hàm lượng NH4NO3 thích hợp, chủng ĐM 26 nuôi cấy môi trường bổ sunghàm lượngNH4NO3 khác nhau(0, 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 5, 7g/l) 70 E24 60 0.5 E24 E24 1.5 E24 E24 40 30 OD 600 nm E 14 % 50 E24 E24 E24 OD 20 10 0 0.5 OD OD 1.5 OD Thời gian( ngày) OD OD OD OD Hình 15 Ảnh hưởng nồng độ NH4NO3 tới khả sinh trưởng tạo CHHBMSH chủng ĐM 26 29 Hình 16.Khả tạoo CHHBMSH c chủng ĐM26 với nồng độ NH4NO3 khác Kết cho thấấy nồng độ NH4NO3 khác khả nă sinh trưởng tạo CHHBMSH củaa ch chủng ĐM 26 không giống Sau ngày nuôi cấy chủng ĐM 26 sinh trưởng ng tạo t CHHBMSH cao nông độ 1g/l số E24 đạt 58 % OD đạt cựcc đại đ 7,6 3.8 Ảnh hưởng ng c nhiệt độđến n trình sinh tr trưởng tạo CHHBMSH Nhiệt độ làà nhân tố t quan trọng ảnh hưởng đến khả ăng sinh ttổng hợp CHHBMSH vi khuẩn n Vì vậy, v sinh trưởng tạo CHHBMSH củủa chủng ĐM26 nhiệt độ khác (20, 25, 30, 37 55oC) tiếnn hành nghiên ccứu 30 60 50 20 E24 25 E24 40 30 20 30 E24 OD-600nm E24 (%) 37 E24 55 E24 20 OD 25 OD 30 OD 37 OD 55 OD 10 0 Thời gian (ngày ) Hinh 19 Ảnh hưởng nhiệt độ tới khả sinh trưởng tạo CHHBMSH chủng ĐM 26 Hình 20 Khả tạo CHHBMSH chủng ĐM26 với hàm lượng glucose khác 31 Như vậy, chủng ĐM 26 sinh trưởng tạo CHHBMSH tốt nhiệt độ 30 37oC với số E24 54 57%, OD 6,52 sau ngày nuôi cấy 3.9 Ảnh hưởng pHđến trình sinh trưởng tạo CHHBMSH pH nhân tố ảnh hưởng lớn tới sinh trưởng tạo CHHBMSH vi khuẩn Khả sinh trưởng tạo CHHBMSH chủng ĐM 26 môi trường có giá trị pH từ đến 10 đánh giá (Hình 17 18) 70 60 50 40 30 20 10 0 pH E24 pH4 E24 pH5 E24 pH6 E24 pH7 E24 OD-600nm E24 (%) pH E24 pH9 E24 pH10 E24 pH OD pH4 OD pH5 OD pH6 OD pH7 OD pH OD pH9 OD pH10 OD Thời gian (ngày ) Hình 17 Ảnh hưởng pH tới khả sinh trưởng tạo CHHBMSH chủng ĐM 26 32 Hình 18.Khả tạo CHHBMSH chủng ĐM26 với giá trị pH khác Kết hình 17 18 cho thấy,với pH 8khả sinh trưởng tạo CHHBMSH chủng ĐM 26 tốt Sau ngày nuôi cấy, số E24 59,5% Do vậy, pH lựa chọn cho thí nghiệm 3.7 Đánh giá hiệu xử lý đất nhiễm cadimi CHHBMSH tạo từ chủng ĐM 26 Mẫu đất nhiễm Cd mẫu đối chứng (không cadimi) lắc với CHHBMSH chủng ĐM 26 tạo ra, lắc song song với mẫu đối chứng không bổ sung CHHBMSH, sau ngày 30oC và180 vòng/phút.Đất sau lắc mang phân tích máy quang phổ hấp phụ nguyên tử AAS (Atomic absorption spectrophotometer), kết thể bảng sau: 33 Bảng Khả loại Cd CHHBMSH chủng ĐM26 Mẫu đất Đất tự nhiên (mg/kg) Đât nhiễm Cd Mẫu đối chứng (mg/kg) (mg/kg) Cd Kim loại tổng số Trước xử lý Sau xử lý Trước xử lý Sau xử lý Cd (mg/kg) 0,81 [...]... 7 Sử dụngvật liệu sinh học: phụ phẩm nông nghiệp, nhựa sinh học, sản phẩm do vi sinh vật tạo ra 1.3 Chất hoạt hóa bề mặt sinh học 1.3.1 Khái niệm chất hoạt hóa bề mặt sinh học Chất hoạt hóa bề mặt sinh học (CHHBMSH) là những hợp chất có cấu trúc đa dạng về hoạt tính bề mặt được tổng hợp bởi vi sinh vật Tất cả CHHBMSH là hợp chất lưỡng cực, có cấutạo gồm một nhóm ưa nước (thường là phân tử đường hoặc... [24] 1.3.3 Tính chất của chất hoạt hóa bề mặt sinh học CHHBMSH có một số tính chât hóa học như độc tính thấp, khả năng phân hủy sinh học cao, tạo bọt cao, chịu nhiệt, pH và chịu lực ion tốt[12] [28] Hoạt tính bề mặt CHHBM có hoạt tính tốt có thể làm giảm sức căng bề mặt của nước từ 72 mN/m xuống 1 mN/m[1].Rhamnolipd làm giảm sức căng bề mặt của nước xuống 25-30 mN/m và sức căng bề mặt giữa pha nước... trúc, mỗi loài vi sinh vật khác nhau có thể tạo ra các loại CHHBMSH khác nhau có bản chất và trọng lượng phân tử khác nhau Với sự đa dạng này mà chúng có những đặc tính như tạo bọt, giữ ẩm, hòa tan, khả năng hoạt động bề mặt và khả năng nhũ hóanên CHHBMSH được sử dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp 1.3.4 Ứng dụng của chất hoạt hóa bề mặt sinh học trong đời sống 12 CHHBMSH được ứng dụng rộng rãi... vi c phục hồi đất bị ô nhiễm Wang và Mulligan (2004) đã đánh giá tính khả thi của vi c 13 sử dụng bọt Rhamnolipid để loại bỏ Cd từ đất cát, hiệu qu loại Cd lên tới 73.2% [37] Một nghiên cứu khác cho thấy, chủng Serratia sp có khả năng tạo polymer ngoại bào (EPS), có khả năng liên kết với kim loại, 1g EPS hấp thụ được 170 mg Cd[36] 1.4 Phương pháp xử lý kim loại nặng bằng chất hoạt hóa bề mặt sinh học. .. loại nặng bằng chất hoạt hóa bề mặt sinh học 1.4.1 Vi khuẩn có khả năng tạo chất hoạt hóa bề mặt sinh học Trong tự nhiên có rất nhiều vi sinh vật có khả năng tạo CHHBMSH như vi khuẩn, nấm men, xạ khuẩn, … trong đó vi khuẩn chiếm đa số.Một số vi khuẩn tạo ra CHHBMSH nhằm thích nghi với các điều kiện môi trường sống đặc biệt như trong các bể chứa dầu, đất, trong đại dương [33] Yakimov và cộng sự(1995)... tính kháng khuẩn mạnh, kháng nấm và kháng virus, do các cấu trúc đa dạng của CHHBMSH[42] - CHHBMSH còn có ứng dụng trong các ngành công nghiệp khác như trong lĩnh vực chế biến bột giấy và giấy, than đá, dệt may và chế biến quặng uranium 1.3.5 Ứng dụng của chất hoạt hóa bề mặt sinh học đến xử lý ô nhiễm Cd Ngoài những ứng dụng trên CHHBMSH còn được sử dụng trong xử lý đất bị ô nhiễm kim loại nặng Đây... lý môi trường Sự hình thành nhũ hóa của CHHBMSH Các CHHBMSH khối lượng phân tử cao có khả năng nhũ hóa tốt hơn các CHHBMSH có khối lượng phân tử thấp Các Sophorolipid có khả năng làm giảm sức căng bề mặt nhưng khả năng nhũ hóa không cao[11].Ngược lại, các CHHBMSH tạo ra từ các chủng vi khuẩn thuộc chi Acinetobactercó nhũ hóa cao nhưng khả năng làm giảm sức căng bề mặt thấp Đa dạng về cấu trúc hóa học. .. phụ chất ô nhiễmhòa tan ở bề mặt ranh giới giữa pha lỏng và pha rắn Thông thường quá trình hấp phụ là quá trình tỏa nhiệt, tùy theo lực tương tác giữa chất hấp phụ và chất bị hấp phụ mà người ta phân biệt hấp phụ vật lý và hấp phụ hóa học 1.2.3 Phương pháp sinh học Hiện nay, người ta đã tìm ra nhiều loại vi sinh vật, thực vật và các chất có hoạt tính sinh học nhằm loại bỏ Cd trong đất Sử dụng vi sinh. .. phân lập từ làng nghề ô nhiễm kim loại nặng 2.1.2 Hóa chất và môi trường nuôi cấy Hóa chất : Các hóa chất được dùng cho nghiên cứu là các hóa chất tinh khiết, hầu hết các hóa chất này được cung cấp bởi hãng Merck Môi trường nuôi cấy * Môi trường nuôi cấy vi sinh vật hiếu khí tổng số (g/l) Glucose 1 KCl 0.25 Cao men 0.2 NaCl 10 Cao thịt 3 MgCl2 1.2 Pepton 5 KH2PO4 1 NH4NO3 2 Thạch 20 pH = 7÷7,2 * Môi trường... *Chuẩn bị đất nhiễm kim loại Đất được làm nhiễm Cd từ dung dịch 3CdSO4.8H2Ovới hàm lượng là 500 mg Cd/kg đất *Nghiên cứu loại Cd từ đất bằng CHHBMSH Thí nghiệm loại Cd từ đất bằng CHHBMSH tạo ra bởi chủng vi khuẩn ĐM26 được tiến hành trong bình tam giác có dung tích là 250 ml 10g đất nhiễm Cd được lắc trong bình tam giác chứa 50 ml dịch chứa CHHBMSH Để đánh giá khả năng loại kim loại cơ học, tiến hành