Bài viết trình bày kết quả nghiên cứu phân lập vi khuẩn tạo chất hoạt hóa bề mặt; sự phát triển của vi khuẩn trên môi trường có dầu oliu; phân tích thành phần của chất hoạt hóa bề mặt B303; tăng cường khả năng phân hủy dầu thô bằng chất hoạt hóa bề mặt sinh học.
25(4): 12-2003 T¹p chÝ Sinh häc Vi khuÈn t¹o chÊt hoạt hóa bề mặt sinh học phân lập từ biển Nha Trang lại thúy hiền Viện Công nghệ sinh học Dơng Văn Thắng Viện Hải dơng học Nha Trang Trần Cẩm Vân Trờng đại học Khoa học tự nhiên, ĐHQGHN Do n Thái Hòa Trờng đại học Bách Khoa Hà Nội Từ nhiều năm chất hoạt hóa bề mặt sinh học đợc ứng dụng rộng r i lĩnh vực công nghiệp, nông nghiệp, khai thác mỏ, thuộc da, thu hồi dầu, công nghệ hóa học với chức nhân tố làm ớt, tạo bọt, tạo nhũ, hoạt động bề mặt [2, 3, 5] Hiện chất hoạt hóa bề mặt (HHBM) đợc tạo từ chủng vi sinh vật đợc đặc biệt quan tâm Vì chất có chứa hai nhóm chức a nớc a dầu phân tử Những đặc tính cho phép phân tử tập trung lại tác động bề mặt tơng hỗ với làm giảm sức căng bề mặt pha nớc pha dầu Bên cạnh u điểm có cấu tróc l−ìng cùc, c¸c chÊt HHBM tõ vi sinh vËt có u điểm dễ dàng tạo từ nguồn chất rẻ tiền tận dụng phế thải ngành công nghiệp chế biến nông sản [1, 9] Chính nhờ có cấu trúc lỡng cực mà chất HHBM thu nhận từ vi sinh vật đợc ứng dụng nhiều việc tăng cờng khả thu hồi dầu trình khai thác dầu thứ cấp tăng cờng khả phân hủy dầu mỏ, kiểm soát ô nhiễm môi trờng dầu mỏ gây Theo Oschner [7] chất HHBM tèt nhÊt hiƯn lµ glycolipit, lipit trung tÝnh phân cực, aminoaxit có hoạt tính bề mặt hỗn hợp polisaccarit-lipit Trong tất dạng khác chất HHBM glicolipit thành phần đợc nghiên cứu chủ yếu Bởi thành phần glicolipit có rhamnolipit- nhân tố quan trọng trình nhũ hóa, tạo bọt hai pha dầu nớc Chất HHBM tạo từ Pseudomonas aeruginosa có khả làm giảm sức căng bề mặt từ 28,6 xuống N/m Cßn glicolipit vi khn biĨn sinh làm giảm sức căng bề mặt nớc tõ 72 xng 29N/m [8] ë ViƯt Nam, c¸c chÊt hoạt hóa bề mặt từ vi sinh vật đợc quan tâm, nhng nhu cầu sử dụng ngày nhiều việc tăng cờng thu hồi dầu kiểm soát ô nhiễm môi trờng dầu mỏ Vừa qua, trình thử nghiệm làm ô nhiễm dầu b i biển Nha Trang đ phân lập đợc số chủng vi khuẩn có khả tạo chất HHBM Dới số kết nghiên cứu chủng I phơng pháp nghiên cứu Mẫu cát nớc biĨn lÊy tõ b i biĨn Nha Trang, tØnh Kh¸nh Hòa Phân lập vi khuẩn môi trờng khoáng Gost 9052-88, xác định số lợng môi trờng hiếu khí tổng số Zobell Công trình đợc hỗ trợ kinh phí Chơng trình nghiên cứu Nuôi vi khuẩn tạo chất HHBM môi trờng muối kho¸ng theo Gost 9052-88 cã bỉ sung n−íc biĨn, vi lợng 5% dầu DO dầu oliu làm nguồn cacbon Điều kiện nuôi cấy pH = 7,4, nhiệt độ 300C, tốc độ lắc: 180 vòng/phút Phơng pháp tách chiết chất HHBM đợc tiến hành theo Pruthi có cải tiến [10] Dịch vi khuẩn sau 72 nuôi lắc đợc dùng để tách chiết chất HHBM sinh học Dịch vi khuẩn B303 ly tâm 13.000 vòng/phút 15 Dịch huyền phù Cặn Bổ sung axêtôn tỷ lệ 1:4 Chất kết tủa Dịch nuôi cấy axêtôn làm khô chân không Chất hoạt hóa bề mặt sinh học Phơng pháp xác ®Þnh chØ sè nhò hãa (E24) cđa chÊt HHBM dịch nuôi cấy đợc tiến hành theo Iqbal [4]: - Dịch nuôi cấy 72 đợc li tâm để loại tÕ bµo vi khn, - Bỉ sung 1ml xylen vµo 1ml dịch nuôi cấy đ loại tế bào, - Trộn ®Òu b»ng voltex ë tèc ®é cao, - Sau 24 số nhũ hóa E24 đợc tính nh sau: E 24 = chiỊu cao cét nhò hãa ×100 chiỊu cao tổng số Đánh giá khả phân hủy dầu thô nhiên liệu chủng vi khuẩn Vi khuẩn đợc nuôi lắc 180 v/ph, 30oC môi trờng muối khoáng có bổ sung 5% dầu thô nhiên liệu nh nguồn cacbon Quan sát thay đổi màu sắc môi trờng nuôi cấy trạng thái dầu sau ngày nuôi cấy Xác định số lợng vi khuẩn trớc sau nuôi cấy với dầu thô (nhiên liệu) hai trờng hợp có bổ sung không bổ sung chất HHBM Qua đánh giá khả phân hủy hydrocacbon vi khuẩn ảnh hởng chất HHBM sinh học lên qúa trình phân hủy Phân tích thành phần hóa học dầu thô nhiên liệu phơng pháp cân trọng lợng sắc kí khí máy HP 6890, sư dơng cét mao qu¶n HP-1 methyl-siloxan II KÕt thảo luận Kết phân lập vi khuẩn tạo chất HHBM Từ mẫu cát biển nhiễm dầu Nha Trang, đ phân lập đợc chủng vi khuẩn có khả tạo chất HHBM sinh học Chúng thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm Dựa vào kit chuẩn API 20NE số chủng đ đợc định tên, chủng B303 thuộc loài Pseudomonas aeruginosa Chủng có khả tạo chất HHBM tốt chủng nghiên cứu Hoạt tính tạo chất HHBM chủng B303 đợc đánh giá khả nhũ hóa sản phẩm sau 24 bổ sung xylen vào dịch nuôi cấy Kết đợc trình bày bảng hình 1, Hai chủng B303 B302 phát triển tốt Bảng Sự phát triển vi khuẩn môi trờng có dầu oliu Ký hiệu chủng Bắt đầu nuôi cấy (tế bào / ml) Sau 72 nuôi cấy (tế bào / ml) A301 1,8 × 107 4,0 × 109 B301 4,8 × 107 2,6 × 107 B302 3,9 × 107 1,5 ×1011 B303 2,5 × 107 3,4 ×1011 C301 4,0 × 107 5,0 ×109 dầu oliu để tạo chất HHBM, số lợng tế bào tăng 10000 lần sau 72 nuôi cấy Đồ thị hình chứng tỏ chất HHBM đợc tạo chủng B303 có khả nhũ hóa mạnh nhÊt sau 48 giê nu«i cÊy Sau 48 giê nu«i cấy hoạt tính nhũ hóa sản phẩm thu đợc bị giảm dần Chỉ số nhũ hóa cực đại đạt tới 72,5% Kết trùng với nghiên cứu Robert đ công bố năm 1989 [25] Chất HHBM B303 đợc làm cân trọng lợng khô, kết thu đợc cao đạt 2,7 g/l Hình Hình thái khuẩn lạc chủng B303 Hình Sự phát triển dầu oliu khả nhũ hóa chủng B303 Hình Sự biến thiên cét nhò hãa theo thêi gian Thêi gian (giê) Phân tích thành phần chất HHBM B303 Cấu trúc phân tử chất HHBM B303 đợc nghiên cứu phơng pháp phân tích phổ hồng ngoại (hình 4) Kết thu đợc biểu diễn hình cho thÊy cÊu tróc ph©n tư cđa chÊt HHBM B303 cã chøa c¸c nhãm chøc -OH, C=O, CH2 C¸c nhãm chức có mặt thành phần chất HHBM sinh học đ đợc quan bảo vệ môi trờng Mỹ công bố Trong nhóm chức nói nhóm -OH C=O đóng vai trò tác nhân a nớc Hình Phổ hồng ngoại chất hoạt hóa bề mặt B303 Nghiên cứu tăng cờng khả phân hủy dầu thô chất HHBM sinh học a) ảnh hởng chất HHBM lên ph¸t triĨn cđa vi sinh vËt MÉu c¸t lÊy tõ b i biĨn Nha Trang vµ chđng vi khn Pseudomonas sp từ phòng thí nghiệm vi sinh vật dầu mỏ đợc nuôi lắc môi trờng khoáng với dầu thô nguồn cacbon Số lợng vi sinh vật trớc sau bổ sung thêm chất HHBM đợc trình bày bảng Bảng Số lợng vi sinh vËt tr−íc vµ sau bỉ sung chÊt HHBM (CFU/ml) Bỉ sung chÊt HHBM (ml) MÉu Thêi gian Tr−íc TN MÉu c¸t Pseudomonas sp 10 10 5,7 × 108 10 3 1,2 × 109 103 1,8 × 109 Sau TN 1,2 × 107 Tr−íc TN 2,0 × 103 2,0 × 103 Sau TN 3,2 × 109 1,3 × 1011 Ghi chó: TN: thÝ nghiệm Từ số liệu bảng thấy rằng, vi sinh vật mẫu cát đ sử dụng tốt dầu thô Số lợng tế bào tăng từ 103-107 tế bào/ml mẫu thí nghiệm lắc với gam c¸t Trong c¸c mÉu c¸t kh¸c cã bỉ sung chÊt HHBM sinh học, số lợng tế bào tăng mạnh Đối với mẫu cát có bổ sung đến ml chất HHBM, số lợng tế bào lên tới 109 tế bào/ml Thí nghiệm chủng Pseudomonas sp chứng tỏ chủng có khả sử dụng dầu thô tốt Số lợng tế bào tăng từ ì 103 tế bào / ml đến 3,2 ì 109 tế bào / ml Khi bổ sung thêm chất HHBM, số lợng tế bào tăng tới 1,3 ì 1011 tế bào / ml Nh vậy, bổ sung thêm chất HHBM sinh học, số lợng tế bào vi sinh vật sử dụng dầu thô đ tăng lên 100 lần so với đối chứng không bổ sung chất Sau ngày nuôi lắc, tiến hành xác định khả nằng sử dụng dầu thô vi sinh vật theo số tiêu: tổng hàm lợng dầu thu hồi, thành phần nhóm cuả dầu thu hồi Trong đó, thành phần nhóm dầu gồm có: hydrocacbon no, hydrocacbon thơm, nhựa asphanten b) Phân tích thành phần dầu thô trớc sau thí nghiệm Kết đánh giá khả sử dụng dầu tổng số vi sinh vật đợc trình bày bảng Bảng Khả sử dụng dầu tổng số vi sinh vật STT Ký hiệu mẫu Lợng dầu thu hồi (mg/l) Lợng dầu sử dụng (%) MS1-K 42 212 0,00 MS2 39 920 5,43 MS3 29 358 30,45 MS4 29 751 29,00 MS5 24 872 41,00 Ghi chú: MS1-K: mẫu đối chứng MS2: Mẫu cát biển MS3: MÉu c¸t biĨn cã bỉ sung chÊt HHBM sinh häc MS4: Chđng Pseudomonas sp MS5: Chđng Pseudomonas sp bỉ sung chất HHBM sinh học Kết nêu bảng cho thấy, vi sinh vật có sẵn mẫu cát biển Nha Trang có khả sử dụng dầu thô Tuy nhiên, khả sử dụng dầu chúng không cao Sau ngày nuôi lắc, vi sinh vật khu hệ sử dụng đợc 5,43% hàm lợng dầu tổng số Điều khẳng định b i biển nơi lấy mẫu Nha Trang đ có tợng ô nhiễm dầu nhng khả tự làm ô nhiễm dầu không cao Khi bổ sung thêm chất HHBM sinh học khả sử dụng dầu tăng lên rõ rệt Chất HHBM sinh học đ kích thích vi sinh vật nội sử dụng tới 30,45% hàm lợng dầu tổng số, tăng lần so với trờng hợp không bổ sung chất HHBM sinh học Đối với thí nghiệm đơn chủng Pseudomonas sp thu đợc kết tơng tự Khi cha bổ sung chất HHBM, lợng dầu đợc vi khuẩn sử dụng 29% có bổ sung thêm chất HHBM, lợng dầu bị phân hủy tăng tới 41% Đây kết quan trọng cho việc ứng dụng chất HHBM sinh học làm môi trờng bị ô nhiễm dầu Bên cạnh đó, khả sử dụng thành phần dầu thô vi sinh vật còng kh¸c C¸c vi sinh vËt mÉu c¸t biển không bổ sung chất HHBM sử dụng đợc 5,32% hydrocacbon no 11,47% hydrocacbon thơm Trong đó, bổ sung thêm chất HHBM sinh học lợng hydrocacbon no đợc sử dụng lên tới 35,90% hydrocacbon thơm tíi 55,87% Chđng Pseudomonas sp sư dơng hydrocacbon no 35,7% hydrocacbon thơm 52,58% Khi đợc hoạt hóa chất HHBM khả sử dụng hydrocacbon no tăng lên tới 49,50% hydrocacbon thơm tới 64,92% Các hợp chất phân cực bị phân hủy nhng mức độ phân hủy không cao (hình 7) c) Khả sử dụng n-parafin vi sinh vật Kết phân tích thành phần n-parafin lại hỗn hợp đợc thể hình cho thấy, hầu hết hydrocabon có mạch từ C9 đến C40 đợc vi sinh vật sử dụng Trong đó, mạnh cacbon từ C9-C15 C17-C30 đợc vi sinh vật sử dụng mạnh Đối với mẫu có bổ sung chất HHBM sinh học, hydrocacbon mạch dài từ C9-C42 đợc sử dụng mạnh Trong đó, mạch từ C10-C28 đợc sử dụng mạnh Từ C29-C42 vi sinh vật sử dụng đợc Điều này, chất HHBM sinh học đ tác động vào phân tử hydrocacbon làm cho vi sinh vật dễ dàng bẻ mạch Đối với mẫu MS4 MS5 (hình 9), khả sử dụng hydrocacbon mạch dài từ C12-C30 tốt Điều đợc thể khoảng cách đồ thị MS1-K, MS4 MS5 Hình Thành phần nhôm dầu thu hồi Hình Khả sử dụng hyđrocacbon no vi sinh vật cát biển bổ sung chất HHBM Hình Khả sử dơng hy®rocacbon no cđa chđng Pseudomonas sp bỉ sung chất HHBM d) Khả sử dụng hydrocacbon thơm vi sinh vật hydrocacbon thơm giảm từ 2051 mg/l xuống 720 mg/l 590 mg/l Trong thành phần dầu mỏ, hydrocacbon thơm hợp chất có khả gây ảnh hởng lớn tới sức khỏe ngời Theo quan bảo vệ môi trờng Mỹ (EPA), hydrocacbon thơm có 16 hợp chất đợc xếp vào nhóm I-nhóm gây ung th ngời Do mà khả phân hủy hydrocacbon thơm dầu thô vi sinh vật quan trọng Đối với mẫu MS2, vùng I, vùng mà phân tử hydrocacbon thơm có số nguyên tử cacbon tơng ứng từ C11-C16, vi sinh vật nội không phân hủy phân hủy Tuy nhiên, bổ sung chất HHBM hàm lợng hydrocacbon thơm vùng I giảm 60% tức lại mg/l Từ vùng II tới vùng IV, khả sử dụng hydrocacbon thơm đa vòng vi sinh vật nội tốt Đồng thời phải khẳng định vai trò tích cực chất HHBM việc phân hủy hợp chất hydrocacbon thơm từ C17-C30 Đặc biệt vùng V, vùng có hợp chất hydrocacbon thơm đa vòng từ C31 trở đ bị phân hủy mạnh nhờ kích thích chất HHBM, hàm lợng từ 2051 mg/l giảm xuống 787 mg/l Kết phân tích mẫu MS4 MS5 cho kết tơng tự Hầu hết hydrocacbon thơm từ vùng I đến vùng IV bị phân hủy Tại vùng I, lợng hydrocacbon thơm giảm từ 30 mg/l xuèng 10 mg/l vµ mg/l, ë vïng V lợng Nh vậy, với kết nghiên cứu bớc đầu đạt đợc, khả chất HHBM sinh học việc kích hoạt trình phân hủy dầu thô tự nhiên vi sinh vật khả quan Chúng đ nghiên cứu khả tạo chất HHBM sinh häc tõ mét chñng vi sinh vËt néi có khả sử dụng dầu mạnh ứng dụng thí điểm vào trình phân hủy dầu tự nhiên Kết cho thấy hàm lợng dầu tổng số nói chung hàm lợng hydrocacbon no, hydrocacbon thơm nói riêng giảm đáng kể (hình 5, 6) III KÕt luËn Tõ c¸c mÉu c¸t lÊy tõ b i biển Nha Trang đ phân lập đợc chủng vi khuẩn có khả tạo chất HHBM sinh học, chủng B303 có khả tạo chất HHBM tèt nhÊt Theo kit chn API 20NE chđng nµy thuộc loài Pseudomonas aeruginosa Đ nghiên cứu điều kiện tối u cho chủng B303 tạo chất HHBM đa quy trình tách chiết chất axêtôn, tỷ lệ 1:4 Kết phân tích phổ hồng ngoại sản phẩm thu đợc từ chủng B303 nuôi môi trờng chứa dầu oliu cho thấy chất thuộc nhóm rhamnolipit Hình Phổ sắc kí hydrocacbon no Hình Phổ sắc kí hydrocacbon thơm ChÊt HHBM sinh häc chñng B303 sinh cã hoạt tính cao : số nhũ hóa đạt 72,5% Chất có tác dụng tăng cờng trình phân hủy dầu thô điều kiện thí nghiệm, hiệu tăng gấp lần so với đối chứng không bổ sung chất HHBM Tài liệu tham khảo Babu P S et al., 1996: Biotechnology Letter 18(3): 263-268 Banat I M et al., 1991: World Journal of Microbiology and Biotechnology 7: 80-88 Deziel E et al., 1996: Applied and Environmental Microbiology, 62(6): 19081912 Iqbal S., Khalid Z M., Malik K A., 1995: Letter in Applied Microbiology, 21: 176179 Ivshina I B et al., 1998: World Journal of Microbiology and Biotechnology, 14: 711717 Makkar R S., Cameotra S S., 1997: J Industrial Microbiology and Biotechnology 18: 37-42 Ochsner U A., Hembach T., Fiechter A., 1995: Advances in Biochemical Engineering Biotechnology 53: 89-117 Passeri A et al., 1992: Applied of Microbiology and Biotechnology, 37: 281286 Patel R M., Desai A J., 1997: Letters in Applied Microbiology, 25: 91-94 10 Pruthi V., Cameotra S S., 1995: Biotechnology Techniques, 9(4): 271-276 11 Reiling H E et al., 1986: Applied and Environmental Microbiology, 51(5): 985989 12 Robert M et al., 1989: Biotechnology letters, 11(12): 871-874 13 Vegt W et al., 1991: Applied of Microbiology and Biotechnology, 35: 766770 14 Yakimov M M et al., 1995: Applied and Environmental Microbiology, 61(5): 17061713 15 Yalimov M M et al., 1998: International Journal of Systematic Bacteriology, 48: 339348 16 Zhang Y., Miller R M., 1992: Applied and Environmental Microbiology, 58(10): 32763282 Biosurfactant- producing bacteria isolated from the NhaTrang beach Lai Thuy Hien, Duong Van Thang, Tran Cam Van, Doan Thai Hoa Summary Chemically synthesized surfactants have been used for many years in petroleum industry to lean up of oil spills, to enhance oil recovery from oil reservoirs These compounds are not biodegradable and can be toxic to the environment, but the biosurfactants are biodegradable, less toxic and have equivalent emulsification properties The biosurfactants are the surface active compounds produced by certain bacteria, actinomyces, yeast and fungi In last few decades the biosurfactants are widely used in several industrial fields, mining, leather, in agricultural, pharmaceutical cosmetics and a wide range of chemical industries as wetting agents, foaming, emulsification, and surface activity In particular in recent years, there is an increasing interest in the possible use of biosurfactants in mobilizing heavy crude oil, transporting petroleum in pipelines, managing oil spills, oil pollution control, cleaning oil sludge from storage facilities, bioremediation and microbial enhanced oil recovery (MEOR) In Vietnam, there is rare publication on the biosurfactant production, but the requirements are constantly increasing In this paper, we show some results on the study of biosurfactant producing bacteria isolated from marine environment and their ability to enhance the crude oil degradation From Nha trang beach sand samples, biosurfactant producing bacteria strains were isolated Among them, the strains B303 were the best biosurfactant producer According to the chemical standard kit API 20NE, this strain was determinated as Pseudomonas aeruginosa The optimum conditions for the biosurfactant production of this strain and the procedure for the biosurfactant extracting were studied The results of the biosurfactant B303 UV analysis when this strain was cultivated on olive oil showed that it was similar to rhamnolipid The biosurfactant produced by the strain B303 had very high activity: its emulsification gained 72.5% and its ability to enhance the crude oil degradation on experimental conditions was higher for six times in comparison with the control Ngµy nhËn bµi: 1-11-2002 ... luận Kết phân lập vi khuẩn tạo chất HHBM Từ mẫu cát biển nhiễm dầu Nha Trang, đ phân lập đợc chủng vi khuẩn có khả tạo chất HHBM sinh học Chúng thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm Dựa vào kit chuẩn API 20NE... cờng khả phân hủy dầu thô chất HHBM sinh học a) ảnh hởng chất HHBM lên ph¸t triĨn cđa vi sinh vËt MÉu c¸t lÊy tõ b i biĨn Nha Trang vµ chđng vi khn Pseudomonas sp từ phòng thí nghiệm vi sinh vật... (hình 5, 6) III KÕt luËn Tõ c¸c mÉu c¸t lÊy tõ b i biển Nha Trang đ phân lập đợc chủng vi khuẩn có khả tạo chất HHBM sinh học, chủng B303 có khả tạo chất HHBM tèt nhÊt Theo kit chn API 20NE chđng