Nâng cao khả năng sinh tổng hợp và tinh sạch hoạt chất Acarbose từ chủng Actinoplanes SP KCTC 9161

Nâng cao khả năng sinh tổng hợp và tinh sạch hoạt chất Acarbose từ chủng Actinoplanes SP KCTC 9161 Nâng cao khả năng sinh tổng hợp và tinh sạch hoạt chất Acarbose từ chủng Actinoplanes SP KCTC 9161 Nâng cao khả năng sinh tổng hợp và tinh sạch hoạt chất Acarbose từ chủng Actinoplanes SP KCTC 9161 luận văn tốt nghiệp,luận văn thạc sĩ, luận văn cao học, luận văn đại học, luận án tiến sĩ, đồ án tốt nghiệp luận văn tốt nghiệp,luận văn thạc sĩ, luận văn cao học, luận văn đại học, luận án tiến sĩ, đồ án tốt nghiệp

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Hà Thị Tâm Tiến NÂNG CAO KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP VÀ TINH SẠCH HOẠT CHẤT ACARBOSE TỪ CHỦNG ACTINOPLANES SP KCTC 9161 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2013 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Hà Thị Tâm Tiến NÂNG CAO KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP VÀ TINH SẠCH HOẠT CHẤT ACARBOSE TỪ CHỦNG ACTINOPLANES SP KCTC 9161 Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS ĐỖ THỊ TUYÊN PGS.TS NGUYỄN QUANG HUY Hà Nội – 2013 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, tơi xin bày tỏ lịng cảm ơn sâu sắc tới TS Đỗ Thị Tun, Phó trƣởng phịng Công nghệ sinh học enzyme, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, định hƣớng nghiên cứu, hƣớng dẫn, sửa luận văn giúp đỡ tơi q trình thực đề tài luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn PGS TS Nguyễn Quang Huy, Phó trƣởng khoa, Phụ trách Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên hƣớng dẫn, quan tâm giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình học tâp Tôi xin chân thành cảm ơn PGS TS Quyền Đình Thi, Trƣởng phịng Cơng nghệ sinh học enzyme, Phó Viện trƣởng Viện Công nghệ sinh học tạo điều kiện hóa chất, thiết bị, thời gian cho thực đề tài Tôi xin cảm ơn tập thể Phịng Cơng nghệ sinh học enzyme, Viện Cơng nghệ sinh học, tập thể Bộ môn Sinh lý thực vật hóa sinh, trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên, bảo, giúp đỡ tận tình cho tơi trình thực nghiệm nhƣ chia sẻ kinh nghiệm chuyên môn Tôi xin cảm ơn Ban lãnh đạo trƣờng Đại học Hùng Vƣơng, Phòng tổ chức cán bộ, Khoa Nông Lâm Ngƣ, trƣờng Đại học Hùng Vƣơng quan tâm, tạo điều kiện thuận lợi cho học hoàn thiện đề tài luận văn tốt nghiệp Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, bạn bè đồng nghiệp giúp đỡ, tạo điều kiện, động viên suốt thời gian học tập Hà Nội, tháng 11 năm 2013 Học viên Hà Thị Tâm Tiến MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC BẢNG BIỂU vii DANH MỤC HÌNH VẼ viii BẢNG KÝ HIỆU CHỮ CÁI VIẾT TẮT xi MỞ ĐẦU .1 CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 1.1 Khái quát acarbose 1.2 Cơ chế hoạt động acarbose 1.3 Vai trò acarbose .5 1.3.1 Vai trò acarbose bệnh đái tháo đƣờng 1.3.2 Nghiên cứu tác dụng khác acarbose 1.4 Vai trò Actinoplanes sinh tổng hợp acarbose .9 1.4.1 Đại cƣơng Actinoplanes .9 1.4.2 Chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 10 1.4.3 Ứng dụng Actinoplanes sản xuất acarbose 11 1.5 Nghiên cứu hoạt chất acarbose giới 12 1.5.1 Nghiên cứu sản xuất acarbose 12 1.5.2 Nghiên cứu ứng dụng đột biến vi sinh vật 16 1.5.3 Các phƣơng pháp tinh thu nhận acarbose 17 1.5.4 Nghiên cứu sản xuất acarbose nƣớc 20 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 23 2.1 Vật liệu hóa chất 23 2.1.1 Chủng giống 23 2.1.2 Hóa chất 23 2.1.3 Môi trƣờng 23 2.1.4 Thiết bị thí nghiệm 24 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 25 2.2.1 Lên men chìm ni cấy vi sinh vật 25 2.2.2 Lựa chọn môi trƣờng lên men sinh tổng hợp acarbose chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 25 2.2.3 Ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy 26 2.2.4 Ảnh hƣởng nguồn carbon nitrogen nuôi cấy 26 2.2.5 Ảnh hƣởng tốc độ lắc, nhiệt độ pH nuôi cấy 26 2.3 Gây đột biến NTG .26 2.4 Sắc ký lớp mỏng TLC 27 2.5 Hoạt tính ức chế α-glucosidase hoạt chất acarbose .27 2.6 Tách chiết tinh acarbose 28 2.6.1 Tách chiết tinh sơ 28 2.6.2 Tinh acarbose sắc ký cột 29 2.7 Sắc ký lỏng cao áp (HPLC) 31 2.8 Sắc ký lỏng ghép khối phổ 31 2.9 Xác định cấu trúc phân tử acarbose cộng hƣởng từ hạt nhân 31 2.10 Phƣơng pháp xử lý số liệu 32 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 Lựa chọn môi trƣờng nuôi cấy 33 3.2 Tối ƣu thành phần môi trƣờng điều kiện nuôi cấy 35 3.2.1 Ảnh hƣởng thời gian 35 3.2.2 Ảnh hƣởng nguồn maltose 37 3.2.3 Ảnh hƣởng nguồn glucose 38 3.2.4 Ảnh hƣởng nguồn bột ngô 40 3.2.5 Ảnh hƣởng pH môi trƣờng .41 3.2.6 Ảnh hƣởng nhiệt độ nuôi cấy 42 3.2.7 Ảnh hƣởng tốc độ lắc .43 3.2.8 Môi trƣờng điều kiện nuôi cấy tối ƣu 44 3.2.9 Xác định hàm lƣợng acarbose HPLC .45 3.3 Gây đột biến chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 46 3.4 Tinh acarbose có hoạt tính ức chế α-glucosidase 48 3.4.1 Chọn lựa phƣơng pháp tinh acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 48 3.4.1.1 Tinh sắc ký hấp thụ silica gel 48 3.4.1.2 Tinh sắc ký lọc gel sephadex G100 49 3.4.1.3 Tinh cột than hoạt tính .50 3.4.2 Chọn lựa phƣơng pháp tinh acarbose từ dịch qua cột than 51 3.4.2.1 Tinh sắc ký trao đổi anion amberlite IRA400 .51 3.4.2.2 Tinh sắc ký trao đổi anion DEAE-sepharose 51 3.4.3 Tinh thu nhận acarbose 52 3.4.4 Hoạt tính ức chế α-glucosidase .55 3.5 Xác định cấu trúc hóa học acarbose 56 3.6 Quy trình tách chiết tinh acarbose .59 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60 Kết luận .60 Kiến nghị 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 PHỤ LỤC 68 DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 2.1 Thành phần môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật 23 Bảng 2.2 Danh sách thiết bị thí nghiệm đƣợc sử dụng 24 Bảng 2.3 Các môi trƣờng khảo sát nghiên cứu 25 Bảng 3.1 Khối lƣợng chế phẩm qua bƣớc tinh acarbose 55 DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1 Cấu trúc hóa học acarbose Hình 1.2 Cơ chế hoạt động acarbose ruột non Hình 1.3 Khuẩn lạc chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 .11 Hình 3.1 Sắc ký đồ TLC mẫu acarbose sinh tổng hợp từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 môi trƣờng lên men 33 Hình 3.2 Hoạt tính ức chế α-glucosidase môi trƣờng lên men 34 Hình 3.3 Sắc ký đồ TLC mẫu acarbose sinh tổng hợp từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 theo thời gian 35 Hình 3.4 Hoạt tính ức chế α-glucosidase hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 theo thời gian .36 Hình 3.5 Sắc ký đồ TLC (a) hoạt tính ức chế α-glucosidase (b) ảnh hƣởng nồng độ maltose đến khả sinh tổng hợp acarbose chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 .37 Hình 3.6 Sắc ký đồ TLC (a) hoạt tính ức chế α-glucosidase (b) ảnh hƣởng nồng độ glucose đến khả sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 39 Hình 3.7 Sắc ký đồ TLC (a) hoạt tính ức chế α-glucosidase (b) ảnh hƣởng nồng độ bột ngô đến khả sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 40 Hình 3.8 Sắc ký đồ TLC (a) hoạt tính ức chế α-glucosidase (b) ảnh hƣởng pH môi trƣờng đến khả sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 .41 Hình 3.9 Sắc ký đồ TLC (a) hoạt tính ức chế α-glucosidase (b) ảnh hƣởng nhiệt độ nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 43 Hình 3.10 Sắc ký đồ TLC (a) hoạt tính ức chế α-glucosidase (b) ảnh hƣởng tốc độ lắc đến khả sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 .43 Hình 3.11 Sắc ký đồ TLC (a) hoạt tính ức chế α-glucosidase (b) hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 môi trƣờng trƣớc sau tối ƣu .44 Hình 3.12 Sắc ký đồ HPLC hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 916 môi trƣờng tối ƣu .45 Hình 3.13 Sắc ký đồ TLC hoạt chất acarbose sinh tổng hợp từ dòng đột biến chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 47 Hình 3.14 Hoạt tính ức chế α-glucosidase hoạt chất acarbose sinh tổng hợp từ dòng đột biến chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 47 Hình 3.15 Sắc ký đồ HPLC hoạt chất acarbose từ dịch lên men biến thể N217 gây đột biến từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 48 Hình 3.16 Sắc ký đồ TLC phân đoạn tinh acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 qua cột silica gel 49 Hình 3.17 Sắc ký đồ TLC phân đoạn tinh acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 qua cột sephadex G100 .49 Hình 3.18 Sắc ký đồ TLC phân đoạn tinh acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 qua cột than hoạt tính .50 Hình 3.19 Sắc ký đồ TLC phân đoạn tinh acarbose qua cột sắc ký trao đổi anion amberlite IRA400 51 Hình 3.20 Sắc ký đồ TLC phân đoạn tinh acarbose qua cột sắc ký trao đổi anion DEAE-sepharose .52 Hình 3.21 Sắc ký đồ TLC phân đoạn tinh acarbose qua cột than hoạt tính 52 Hình 3.22 Sắc ký đồ HPLC ghép khối phổ chuẩn acarbose .53 Hình 3.23 Sắc ký đồ HPLC ghép khối phổ hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 54 Hình 3.24 Sắc ký đồ HPLC ghép khối phổ hoạt chất acarbose tinh từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 54 Hình 3.25 Hoạt tính ức chế α-glucosidase hoạt chất acarbose từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 sau qua cột tinh .55 Hình 3.26 Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 13C-NMR hoạt chất acarbose tinh từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 .56 Hình 3.27 Phổ proton 1H-NMR hoạt chất acarbose tinh từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 57 Hình 3.28 Cấu trúc phân tử acarbose tinh từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 .58 Hình 3.29 Qui trình tinh hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 59 Đại học Khoa học tự nhiên Hà Thị Tâm Tiến 3.6 Quy trình tách chiết tinh acarbose Từ liệu nghiên cứu trên, xây dựng đƣợc quy trình tách chiết, tinh hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 quy mơ phịng thí nghiệm Dịch lên men (8 ngày) (1) Hịa vào than hoạt tính pH 3, khuấy giờ, để lạnh sau 12 giờ, rửa đến lần nƣớc cất Hỗn hợp than hoạt tính dịch lên men (2) Nhồi lên cột Sắc ký cột than hoạt tính (Hệ dung mơi ethanol từ 5% đến 20%) (3) Tập trung phân đoạn có hoạt chất acarbose, cô đặc 90% Sắc ký cột than hoạt tính (Hệ dung mơi ethanol từ 5% đến 15%) (4) Tập trung phân đoạn có hoạt chất acarbose, cô đặc 90% Sắc ký cột amberlite XAD 1600T (Hệ dung môi gồm: acetone 10%) (5) Tập trung phân đoạn có hoạt chất acarbose, đặc 20% Sắc ký cột amberlite IRA67 (Rửa nƣớc) (6) Dịch acarbose tinh (7) Cô cạn kết tủa methanol acarbose Hình 3.29 Qui trình tinh hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 59 Đại học Khoa học tự nhiên Hà Thị Tâm Tiến KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Môi trƣờng điều kiện tối ƣu cho sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 gồm thành phần (g/l): 50 maltose, 30 glucose, 15 bột ngô, 1,0 monosodium glutamate, 2,0 CaCl2, 2,5 CaCO3, 1,0 K2HPO4 điều kiện pH 6,5, nhiệt độ 25oC, tốc độ lắc 150 vòng/phút thời gian 192 giờ, cho suất đạt 9,98 g/l acarbose tăng gấp 3,4 lần so với trƣớc tối ƣu Khả ức chế α-glucosidase hoạt chất acarbose sinh từ Actinoplanes sp KCTC 9161 môi trƣờng tối ƣu tăng 5,4% so với môi trƣờng trƣớc tối ƣu, đạt 54,2% Đã tạo đƣợc dòng đột biến N217 từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 có khả sinh tổng hợp acarbose cao, cho suất 10,94 g/l tăng 0,96 g/l so với chủng tự nhiên cho hoạt tính ức chế α-glucosidase hoạt chất acarbose đạt 52,8% tăng gấp 1,35 lần đối chứng Xây dựng đƣợc quy trình tách chiết, tinh acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 sử dụng kết hợp sắc ký cột than hoạt tính, sắc ký trao đổi cation amberlite XAD 1600T sắc ký trao đổi anion amberlite IRA67 Hiệu suất thu hồi acarbose đạt 73,1% Hoạt chất acarbose thu đƣợc có băng đậm ngang chuẩn sắc ký đồ TLC (Rf = 0,28), có độ tinh 98% Hoạt tính ức chế α-glucosidase dịch acarbose tinh đạt 68,7% tăng 1,6 lần so với dịch lên men Kiến nghị Xây dựng quy trình lên men sản xuất acarbose từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 quy mô pilot Thử nghiệm, đánh giá chất lƣợng chế phẩm acarbose tạo ra, định hƣớng sản xuất thuốc điều trị đái tháo đƣờng type Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 60 Đại học Khoa học tự nhiên Hà Thị Tâm Tiến TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Bộ Y tế (2012), "Dƣợc thƣ quốc gia Việt Nam 2", Công báo số 119, 1, tr 8-12 Lê Văn Chi (2004), "Tăng đƣờng huyết sau ăn", Tạp chí Thơng tin Tim mạch học, 8, tr 37-42 Phạm Hữu Điển (2003), "Một số hợp chất thiên nhiên từ thực vật có tác dụng hạ đƣờng huyết", Tạp chí Dược học, (7), tr 10-12 Nguyễn Lân Dũng (2006), Phân loại xạ khuẩn, Thư viện Học liệu mở Việt Nam, tr 1-11 Vũ Ngọc Lộ (2005), "Những dƣợc liệu có tác dụng hạ đƣờng huyết trị tiểu đƣờng", Tạp chí Dược học, (353), tr 7-9 Phan Tuấn Nghĩa (2012), Giáo trình Hóa sinh học thực nghiệm, NXB Giáo dục Việt Nam Nguyễn Thị Nƣơng, Đỗ Thị Tun, Lê Thanh Hồng, Quyền Đình Thi (2013), "Nghiên cứu thành phần môi trƣờng lên men sinh tổng hợp acarbose Actinoplanes sp KCTC 9161" Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc, 1, tr 403-406 Trần Văn Ơn, Phùng Thanh Hƣơng, Đỗ Anh Vũ (2008), "Tác dụng hạ đƣờng huyết dây thìa canh Gymnema sylvestre", Tạp chí Dược học, (391), tr 3133 Công Sơn, Thế Ân (2013), Phòng trị bệnh ung thư, tiểu đường, NXB Hồng Đức, Hà Nội 10 Quyền Đình Thi, Đỗ Thị Tuyên, Lê Thị Trang, Lê Thanh Hoàng (2012), "Nâng cao sinh tổng hợp acarbose từ dòng đột biến Actinoplanes VTCC-A1779", Tạp chí Hóa học, 50(5A), tr 113-116 11 Quyền Đình Thi, Vũ Văn Hạnh (2011), "Tuyển chọn chủng Bacillus sp sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase để điều trị bệnh đái tháo đƣờng type 2", Tạp chí Công nghệ sinh học, 9, tr 729-735 Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 61 Đại học Khoa học tự nhiên Hà Thị Tâm Tiến 12 Hà Thị Tâm Tiến, Nguyễn Thị Nƣơng, Đỗ Thị Tuyên, Quyền Đình Thi (2013), "Ảnh hƣởng nhiệt độ bảo quản đến sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp VTCC-A1779 biến thể", Tạp chí Y học Việt Nam, (2), tr 71-75 13 Đỗ Thị Tuyên, Lê Thanh Hoàng, Vũ Văn Hạnh, Quyền Đình Thi (2011), "Sàng lọc số chủng Actinoplanes sp sinh tổng hợp cao chất acarbose có tính ức chế α-glucosidase", Tạp chí Cơng nghệ sinh học, 9, tr 861-865 Tài liệu tiếng anh 14 Beenken KE, Hawkins AR, Frost JW, Brown KA (2012), "Impact of extracellular nuclease production on the phenotype of Staphylococcus aureus under in vitro and in vivo conditions", Infect Immun, 80(5), pp 1634-1638 15 Bischoff H (1994), "Pharmacology of alpha-glucosidase inhibition", Eur J Clin Invest, 24(3), pp 3-10 16 Blanch M, Calsamiglia S, Devant M, Bach A (2010), "Effects of acarbose on ruminal fermentation, blood metabolites and microbial profile involved in ruminal acidosis in lactating cows fed a high-carbohydrate ration", J Dairy Res, 77, pp 123-128 17 Bock K, Pedersen H (1984), "The solution conformation of acarbose", Carbohydrate Research, (132), pp 142-149 18 Cavalleri B, Pagani H, Volpe G, Selva E, Parenti F (1884), "A new antibiotic from Actinoplanes: fermentation, isolation and prelimilary physico-chemical characteristics", The Journal of Antibiotics, 37(4), pp 309-317 19 Choi BT, Shin CS (2003), "Reduced formation of by product component C in acarbose fermentation by Actinoplanes sp CKD 485-16", Biotechnol Prog, 19, pp 1677-1682 20 Cordero BF, Obraztsova I, Couso I, Leon R, Vargas MA, Rodriguez JF (2011), "Enhancement of lutein production in Chlorella sorokiniana by improvement of cuture conditions and random mutagenesis", MarDrugs, 9(9), pp 16071624 Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 62 Đại học Khoa học tự nhiên Hà Thị Tâm Tiến 21 Couch JN (1950), "Actinoplanes, a new genus of the actinomycetales", Journal of the Elisha Michell Scientific Society, (66) 22 Dehghan P, Gagari BP (2013), "Efects of high performance inulin supplementation on glucemic status and lipid profile in women with type diabetes: A randomized, Placebo-controlled cilinical trial", Health Promotion Perspectives, 3(1), pp 55-63 23 Frommer W, Junge B, Muller L, Schmidt D (1979), "New enzyme inhibitors from microorganisms", Planta Med, 35(3), pp 195-217 24 Frommer W, Plus W, Schafer D, Schmidet D (1975), "Glycoside-hydrolase enzyme inhibitors", United States Patent, US 3876766 25 Hayashim T (2008), "The alpha-glucosidase inhibitor acarbose reduces the net electronegative charge of low-density lipoprotein in patients with newly diagnosed type diabetes", Clin Chim Acta, 390, pp 110-114 26 Hemker M, Stratmann A, Goeke K, Schroder W, Lenz JG, Piepersberg W, Paper H (2001), "Identification, cloning, expression and charecterization of the extracellular acarbose-modifying glycotransferase, AcbD from Actinoplanes sp strain SE50", Journal of Bacteriology, 183(15), pp 4484-4492 27 Hong CL, Kim KH, Choi BT, Choi S, Choi R (2003), "Process for preparing acarbose with high purity", United States Patent, US 6649755B1 28 Hu ZC, Zheng YG (2011), "Enhancement of 1,3-dihydroxyacetone production by a UV-induced mutant of Gluconobacter oxydans with DO control strategy", Appl Microbiol Biotechnol, 165(5-6), pp 1152-1160 29 Huh JH, Kim DJ, Zhao XQ, Li M, Jo YY, Yoon TM (2004), "Widespread activation of antibiotics biosynthesis by S-adenosylmethionine in Streptomycetes", FEMS Microbiol Lett, 238, pp 439-447 30 Jung H, Jeya M, Kim S, Kumar SR, Zhang Y, Lee J (2009), "Biosynthesis, biotechnological production, and application of teicoplanin: current state and perspective", Applied Microbiology and Biotechnology, 84(3), pp 417-428 31 Keri V, Deak L (2002), "Method for purification of acarbose", United States Patent, US 20020183262A1 Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 63 Đại học Khoa học tự nhiên Hà Thị Tâm Tiến 32 Klein A, Selber K, Wehlmann H, Rosen W, Puhler A, Schwientek P, Kalinowski J, Wehmeier UF (2013), "New Actinomycete intergrative and conjugative element from Actinoplanes sp SE50/110 as plasmid for genetic transformation of related Actinobacteria", International Publication Number, WO 2013/083566 A1 33 Lange PM, Rauenbusch E (1987), "Polymers for the purification of acarbose", United States Patent, US 4666776 34 Lechevalier H, Lechevalier M (1970), "In the Actinomycetales", Veb G Fisher, pp 393-405 35 Lee JS, Hai T, Paper H, Kim TJ, Suh JW (2008), "Three trehalose synthetic pathways in the acarbose-producing Actinoplanes sp SN223/29 and evidence for the Tre role in biosynthesis of component C", Appl Microbiol Biotechnol, 80(5), pp 767-778 36 Lee S, Saueribrei B, Niggemann J, Egelkraut E (1997), "Biosynthesic studies on the alfa-glucosidase inhibitor acarbose in Actinoplanes sp source of the maltose unit", J Antibiot (Tokyo), 50, pp 767-778 37 Lee SS, Egelkrout E (1998), "Studies on the a-glucosidase inhibitor acarbose in Actinoplanes sp.: glutamate is the primary source of the nitrogen in acarbose", J Antibiot, 51(11), pp 225-227 38 Li KT, Hou J, Wei SJ, Cheng X (2012), "An optimized industrial fermentation processes for acarbose production by Actinoplanes sp A56", Bioresource Technology, 118, pp 580-583 39 Lin CL, Huang TL, Chen JK, Wu CH (2007), "Purification process for manufacturing a high pure acarbose", United States Patent, US 7253278 B2 40 Lin CL, Huang TL, Chen JK, Wu CS (2005), "Purification process for manufacturing a high pure acarbose", United States Patent, US 20050118686A1 41 Mahmud T (2003), "The C7N aminocyclitol family of natural products", Nat Prod Rep, 20, pp 137-166 Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 64 Đại học Khoa học tự nhiên Hà Thị Tâm Tiến 42 Mori Y, Shiozaki M, Matsuura K, Tanaka T, Yokoyama J, Utsunomiya K (2011), "Evaluation of efficacy of acarbose on glucose fluctuation and postprandial glucose using continuous glucose monitoring in type diabetes mellitus", Diabetes Technol Ther, 13, pp 467-470 43 Parenti F, Coronelli C (1979), "Member of the genus Actinoplanes and their antibiotics", Annual Review of Microbiology, 33(1), pp 389-341 44 Parenti F, Pagani H, Beretta G (1975), "Lipiarmycin, a new antibiotic from Actinoplanes", The Journal of Antibiotics, 28(4), pp 247-252 45 Rauenbush E (1990), "Highly pure acarbose", United States Patent, US 4904769 46 Rodriguez JF, Antonio DL, Manuel C, Fatima C (2008), "Application of ion exchange to purify acarbose from fermemtation broths", Biochemical Engineering, 40, pp 130-137 47 Schmidet DD, Frommer W, Junge B, Muller L, Wingender W, Truscheit E, Schafer D (1997), "Alpha-glucosidase inhibitors new complex oligosaccharides of microbial origin", Die Naturwissenschaften, 64(10), pp 535-536 48 Schwientek P (2012), "Genomics and Transcriptomics of the industrial Acarbose producer Actinoplanes sp SE50/110", Bielefeld University, Germany, 155 pages 49 Schwientek P, Szczepanowski R, Ruckert C, Kalinowski J, Klein A, Selber K, Wehmeier UF, Stoye J, Puhler A (2012), "The complete genome sequence of acarbose producer Actinoplanes sp SE50/110", BMC Genomic, 13(112), pp 18 pages 50 Shah MM, Cheryan M (1995), "Acetate production by Clostridium thermoaceticum in corn steep liquor media", J Ind Microbiol, 15, pp 424-428 51 Silveira MM, Wisbeck E, Hoch I, Jonas R (2001), "Production of glucose– fructose oxidoreductase and ethanol by Zymomonas mobilis ATCC 29191 in medium containing corn steep liquor as a source of vitamins", Appl Microbiol Biotechnol, 55 Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 65 Đại học Khoa học tự nhiên Hà Thị Tâm Tiến 52 Sun LH, Li MG, Wang YS, Zheng YG (2012), "Significantly enhanced production of acarbose in fed-batch fermentation with the addition of Sadenosylmethionine", Microbiol Biotechnol, 22, pp 826-831 53 Truscheit E, Frommer W, Junge B, Muller L, Schmidet D (1981), "Chemistry and biochemistry of microbial a-glucosidase inhibitors", Angjewandte Chemie International Edition in English, 20(9), pp 744-761 54 Tsujino D, Nishimura R, Taki K, Morimoto A, Tajima N, Utsunomiya K (2011), "Comparing the efficacy of α-glucosidase inhibitors in suppressing postprandial hyperglycemia using continuous glucose monitoring: a pilot study-the major study", Diabetes Technol Ther, 13, pp 303-308 55 Ventura M, Canchaya C, Tauch A, Chandra G, Fitzgerald GF, Chater KF, Van Sinderen D (2007), "Genomics of Actinobacteria: tracing the evolutionary history of an ancient phylum", Microbiology and Molecular Biology Reviews, 71(3), pp 495-548 56 Wang Y, Yu L, Zheng YG, Wang YH, Shen YC (2013), "Acarbose isolation with gel type strong acid cation exchange resin: Equilibrium, Kinetic and Thermodynamic studies", ChinJChemEng, 21(10), pp 1106-1113 57 Wang YJ, Dong F, Yu L, Zheng YG (2012a), "Study on acarbose adsorption performance of cation exchanger SAC 001x7", ChinJChemEng, (3), pp 493498 58 Wang YJ, Liu LL, Feng ZH, Liu ZQ, Zheng YG (2011), "Optimization of media composition and culture conditions for acarbose production by Actinoplanes utahensis ZJB-08196", Microbiol Biotechnol, 27, pp 2759-2766 59 Wang YJ, Liu LL, Wang YS, Xue YP, Zheng YG, Shen YC (2012b), "Actinoplanes utahensis ZJB-08196 fed-batch fermentation at elevated osmolality for enhancing acarbose production", Bioresource Technology, 103, pp 337-342 60 Wehmeier UF (2003), "The biosynthesis and metabolism of acarbose in Actinoplanes sp SE 50/110", Biocatalysis and biotransformation, 21(4-5), pp 279-284 Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 66 Đại học Khoa học tự nhiên Hà Thị Tâm Tiến 61 Wei SJ, Cheng X, Huang L, Li KT (2010), "Medium optimization for acarbose production by Actinoplanes sp A56 using the response surface methodology", African Journal of Biotechnology, 9, pp 1849-1854 62 Whistler RL, Durso DF (1949), "Chromatographic Separation of Sugar on Charcoal", Purdue University, 72, pp 667-679 63 Xue YP, Qin JW, Wang YJ, Wang YS, Zheng YG (2013), "Enhanced production of acarbose and concurrently reduced formation of impurity C by addition of validaminein fermentation of Actinoplanes utahensis ZJB-08196", BioMed Research International, pages 64 Yamaki K, Mori Y (2006), "Evaluation of α-glucosidase inhibitory activity in colored foods : a trial using slope factors of regression curves", Nippon Shokuhin Kagaku Kogaku Kaishi, 53(4), pp 229-231 Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 67 Đại học Khoa học tự nhiên Hà Thị Tâm Tiến PHỤ LỤC Bảng P1 Hoạt tính ức chế α-glucosidase mẫu acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 môi trƣờng lựa chọn Môi trƣờng Ức chế α-glucosidase (%) Lần Lần Lần Trung bình MT1 50,9 52,7 53,1 52,2 ± 1,2 MT2 42,3 47,1 45,8 45,1 ± 2,5 MT3 0 0 MT4 51,0 43,8 46,0 46,6 ± 4,1 MT5 49,2 51,0 53,0 51,0 ± 1,9 Bảng P2 Hoạt tính ức chế α-glucosidase mẫu acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 theo thời gian Ức chế α-glucosidase (%) Thời gian (giờ) Lần Lần Lần Trung bình 48-72 0 0 96 19,1 15,9 20,8 18,6 ± 2,5 120 36,8 35,9 41,1 38,0 ± 2,9 144 51,9 44,7 42,0 46,2 ± 5,1 168 51,8 47,3 51,7 50,3 ± 2,6 192 57,3 52,5 55,8 55,2 ± 2,4 216 56,6 48,4 51,7 52,2 ± 4,1 Bảng P3 Hoạt tính ức chế α-glucosidase mẫu acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 theo nồng độ maltose Ức chế α-glucosidase (%) Nồng độ maltose (g/l) Lần Lần Lần Trung bình 20 39,0 35,2 35,6 36,6 ± 2,1 30 50,8 48,5 47,7 49,0 ± 1,6 40 54,7 47,7 46,8 49,7 ± 4,3 50 54,8 50,4 50,4 51,9 ± 2,5 60 50,1 50,3 47,2 49,2 ± 1,7 Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 68 Đại học Khoa học tự nhiên Hà Thị Tâm Tiến Bảng P4 Hoạt tính ức chế α-glucosidase mẫu acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 theo nồng độ glucose Ức chế α-glucosidase (%) Nồng độ glucose (g/l) Lần Lần Lần Trung bình 10 28,1 27,7 32,1 29,3 ± 2,4 20 29,2 34,6 33,8 32,6 ± 2,9 30 41,0 42,7 45,6 43,1 ± 2,3 40 42,5 44,1 44,0 43,5 ± 0,9 50 43,8 43,9 45,5 44,4 ± 1,0 Bảng P5 Hoạt tính ức chế α-glucosidase mẫu acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 theo nồng độ bột ngô Ức chế α-glucosidase (%) Nồng độ bột ngô (g/l) Lần Lần Lần Trung bình 24,7 24,2 26,4 25,1 ± 1,1 26,1 34,1 31,4 30,6 ± 4,0 10 50,9 50,2 45,5 48,9 ± 2,9 15 55,3 56,0 52,2 54,5 ± 2,0 20 48,2 48,4 52,7 49,8 ± 2,5 25 47,5 47,7 48,9 48,0 ± 0,8 Bảng P6 Hoạt tính ức chế α-glucosidase mẫu acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 theo giá trị pH môi trƣờng Giá trị pH môi trƣờng Ức chế α-glucosidase (%) Lần Lần Lần Trung bình 6,0 39,6 35,6 40,1 38,4 ± 2,4 6,5 43,3 46,4 44,8 44,8 ± 1,5 7,0 42,9 39,6 40,3 40,9 ± 1,7 7,5 29,4 35,7 32,4 32,5 ± 3,2 8,0 31,9 29,2 34,1 31,7 ± 2,4 8,5 31,9 30,3 30,7 31,0 ± 0,8 Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 69 Đại học Khoa học tự nhiên Hà Thị Tâm Tiến Bảng P7 Hoạt tính ức chế α-glucosidase mẫu acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 theo nhiệt độ nuôi cấy Ức chế α-glucosidase (%) Nhiệt độ nuôi cấy (oC) Lần Lần Lần Trung bình 25 48,3 47,2 46,8 47,5 ± 0,7 28 40,3 45,1 43,3 42,9 ± 2,4 30 39,4 47,2 44,4 43,7 ± 3,9 37 41,0 46,1 43,7 43,6 ± 2,6 Bảng P8 Hoạt tính ức chế α-glucosidase mẫu acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 theo tốc độ lắc nuôi cấy Ức chế α-glucosidase (%) Tốc độ lắc (vòng/phút) Lần Lần Lần Trung bình 100 42,6 41,0 45,5 43,0 ± 2,3 150 47,8 45,6 48,3 47,3 ± 1,4 200 47,3 47,3 44,5 46,4 ± 1,6 220 46,0 40,1 43,7 43,3 ± 3,0 Bảng P9 Hoạt tính ức chế α-glucosidase mẫu acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 trƣớc sau tối ƣu Môi trƣờng ƣu Ức chế α-glucosidase (%) Lần Lần Lần Trung bình Trƣớc 48,5 49,5 48,5 48,8 ± 0,6 Sau 53,3 53,7 55,5 54,2 ± 1,2 Bảng P10 Hoạt tính ức chế α-glucosidase mẫu acarbose tinh từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 Mẫu Ức chế α-glucosidase (%) Lần Lần Lần Trung bình Dịch lên men 39,3 46,1 43,2 42,9 ± 3,4 Cột than 16,7 17,5 15,2 16,5 ± 1,2 Cột amberlite IRA 400 22,1 18,4 20,5 20,3 ± 1,9 Cột DEAE-sepharose 33,7 28,9 28,3 30,3 ± 3,0 Cột than 57,1 57,9 59,1 58,0 ± 1,0 Dịch tinh 68,0 67,9 70,2 68,7 ± 1,3 Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 70 Đại học Khoa học tự nhiên Hà Thị Tâm Tiến Bảng P11 Hoạt tính ức chế α-glucosidase mẫu acarbose từ dịch lên men dòng đột biến từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 Dòng đột biến Ký hiệu ĐC Ức chế α-glucosidase (%) Lần Lần Lần Trung bình TN 39,8 38,9 39,0 39,2 ± 0,5 N211 40,1 42,4 40,2 40,9 ± 1,3 N212 36,5 37,8 37,9 37,4 ± 0,8 N213 50,9 50,9 50,2 50,7 ± 0,4 N214 49,4 49,7 50,0 49,7 ± 0,3 N215 46,4 48,8 47,6 47,6 ± 1,2 N216 47,9 48,6 51,7 49,4 ± 2,0 N217 52,0 53,3 53,0 52,8 ± 0,7 N111 49,7 49,7 48,8 49,4 ± 0,5 N112 50,4 53,4 47,7 50,5 ± 2,9 10 N121 51,4 51,0 48,9 50,4 ± 1,3 11 N122 40,1 41,4 41,6 41,1 ± 0,9 12 N123 40,8 37,9 35,2 38,0 ± 2,8 13 N124 39,8 37,8 43,0 40,2 ± 2,6 14 N125 42,7 41,4 39,7 41,3 ± 1,5 15 N311 49,4 52,2 50,4 50,7 ± 1,4 Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 71 Đại học Khoa học tự nhiên Hà Thị Tâm Tiến Hình P1 Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân COSY mẫu acarbose tinh từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 Hình P2 Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân C13CPD DEPT mẫu acarbose tinh từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 72 Đại học Khoa học tự nhiên Hà Thị Tâm Tiến Hình P3 Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân HMBC HSQC mẫu acarbose tinh từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 73 ... môi trƣờng lên men sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 cho thấy: Mơi trƣờng thích hợp cho lên men sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 bao gồm (g/l):... mẫu acarbose sinh tổng hợp từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 theo thời gian 35 Hình 3.4 Hoạt tính ức chế α-glucosidase hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161. .. α-glucosidase hoạt chất acarbose từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 sau qua cột tinh .55 Hình 3.26 Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 13C-NMR hoạt chất acarbose tinh từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC