Nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn Bacillus sp. đối kháng với Vibrio parahaemolyticus trong nuôi tôm công nghiệp

Chương 1: GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Nuôi tôm nước lợ ở quy mô công nghiệp hiện đang phát triển rất mạnh ở Đông Nam Á, Nam Á và Châu Mỹ La tinh. Các loài tôm nước lợ được nuôi công nghiệp nhiều nhất là tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) và tôm sú (Penaeus monodon). Nuôi tôm nước lợ công nghiệp là lĩnh vực kinh tế mũi nhọn, góp phần quan trọng trong tổng giá trị xuất khẩu thủy sản của nước ta, đưa Việt Nam vào nhóm các quốc gia xuất khẩu thủy sản đứng đầu trên thế giới. Năm 2017 cả nước có diện tích nuôi tôm nước lợ là 721.100 ha, đạt sản lượng 701.000 tấn. Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) chiếm ưu thế về nuôi tôm nước lợ, với hơn 91,8% về diện tích và 82,5% sản lượng thu hoạch so với cả nước (Tổng cục thủy sản, 2018). Theo Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu Thủy sản Việt Nam (VASEP), năm 2012, nguồn nguyên liệu tôm nuôi nước lợ cho xuất khẩu thiếu hụt nghiêm trọng, do dịch bệnh ở khu vực ĐBSCL; trong đó bệnh hoại tử gan tụy cấp ở tôm (Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease - AHPND) (Flegel, 2012) hay còn gọi là hội chứng tôm chết sớm (Early Mortality Syndromy - EMS) (Lightner et al., 2012) là nguyên nhân gây thiệt hại nặng nề nhất. Năm 2010, AHPND bắt đầu xuất hiện tại vùng ĐBSCL. Đến năm 2011, bệnh này bùng phát thành dịch tôm trên diện rộng, gây thiệt hại trên 97.000 ha tập trung ở các tỉnh: Sóc Trăng, Bạc Liêu, Cà Mau, Bến Tre. Năm 2012 dịch bệnh bùng phát thêm các tỉnh Trà Vinh, Kiên Giang, Hải Phòng, Quảng Ninh, Thanh Hóa, Nghệ An, Quảng Ngãi, Bình Định, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Bình Thuận. Theo báo cáo thống kê của Tổng cục Thủy sản, năm 2012 diện tích tôm nuôi nước lợ bị AHPND là 46.093 ha, chiếm 45,7% diện tích tôm nuôi bị bệnh. Trong năm 2017 theo báo cáo của Cục Thú Y, trong cả nước tổng diện tích tôm nuôi thiệt hại do AHPND là 6.793 ha, chiếm hơn 17,9 % tổng diện tích tôm nuôi bị bệnh (Báo cáo tổng kết 2017, Cục Thú Y). Tháng 5/2013, nhóm nghiên cứu của GS. Lightner (Đại học Arizona) đã công bố kết quả xác định tác nhân gây bệnh của hội chứng hoại tử gan tụy cấp ở tôm chính là một chủng vi khuẩn thuộc loài V. parahaemolyticus, chủng Vibrio này bị nhiễm thể thực khuẩn (phage) tiết ra các độc tố gây chết tôm (Tran et al., 2013). Ngày 12/6/2013, tại Sóc Trăng, Tổng cục Thủy sản đã đưa ra những kết luận về tác nhân gây AHPND là do nhóm vi khuẩn Vibrio gây ra (chủng V. parahaemolyticus có mang phage, và có thể do các loài Vibrio khác). Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước cho thấy nguồn gốc gây bệnh do vi khuẩn ở tôm nuôi chủ yếu do vi khuẩn Vibrio gây nên. Vi khuẩn Vibrio có thể làm chết ấu trùng tôm, chết tôm giống và tôm trưởng thành, gây thiệt hại đáng kể trong nghề nuôi tôm công nghiệp. Để khống chế dịch bệnh ở tôm nuôi, hạn chế tác động của AHPND ở tôm nuôi do nhóm vi khuẩn Vibrio, cần thiết phải nghiên cứu ứng dụng các giải pháp công nghệ sinh học, kết hợp sử dụng chế phẩm sinh học hữu hiệu để hạn chế sự phát triển của vi khuẩn Vibrio trong ao nuôi tôm công nghiệp. Một số chủng Bacillus đã được áp dụng thành công trong chế phẩm sinh học, ví dụ, chủng B. subtilis UTM 126 có khả năng sinh chất kháng khuẩn đối với V. parahaemolyticus (Balcázar et al., 2007), hay hỗn hợp hai chủng B. subtilis L10 và G1 trong thức ăn giúp tôm tăng trưởng nhanh hơn 1,5 lần và giúp tăng khả năng đề kháng với V. harveyi thông qua việc kích hoạt hệ thống miễn dịch của tôm (Zokaeifar et al., 2012). Đề tài “Nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn Bacillus sp. đối kháng với Vibrio parahaemolyticus trong nuôi tôm công nghiệp” được thực hiện nhằm tìm kiếm giải pháp hạn chế sự phát triển của vi khuẩn V. parahaemolyticus, hạn chế dịch AHPND, đóng góp các giải pháp nuôi tôm công nghiệp hiệu quả và bền vững.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ LÊ THẾ XUÂN NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VI KHUẨN Bacillus sp ĐỐI KHÁNG VỚI Vibrio parahaemolyticus TRONG NUÔI TÔM CÔNG NGHIỆP LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN MÃ SỐ: 62620301 NĂM 2020 MỤC LỤC Trang LỜI CẢM TẠ i TÓM TẮT ii ABSTRACT iii CAM KẾT KẾT QUẢ Error! Bookmark not defined MỤC LỤC v DANH SÁCH BẢNG x DANH SÁCH HÌNH xi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT xiii Chương 1: GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu phạm vi nghiên cứu 1.2.1 Mục tiêu tổng quát 1.2.2 Mục tiêu cụ thể 1.3 Nội dung nghiên cứu 1.4 Ý nghĩa nghiên cứu 1.5 Tính mới của luận án: 1.6 Thời gian thực hiện Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Khái quát trạng nuôi tôm sú tôm thẻ chân trắng (tôm nước lợ) 2.1.1 Tình hình nuôi tôm nước lợ thế giới 2.1.2 Tình hình nuôi tôm nước lợ ở Việt Nam 2.2 Tình hình dịch AHPND tơm nuôi thế giới và Việt Nam 2.3 Tác nhân gây AHPND tôm nuôi 2.4 Chẩn đốn AHPND và biện pháp phịng, trị bệnh tôm nuôi 2.4.1 Chẩn đoán AHPND 2.4.2 Phịng chớng AHPND ở tơm nuôi 2.5 Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 12 2.5.1 Đặc tính chủng V parahaemolyticus 12 2.5.2 Các độc tố của V parahaemolyticus 14 2.5.3 Ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến sự phát triển của V parahaemolyticus 18 2.5.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 18 2.5.3.2 Ảnh hưởng của pH 18 2.5.3.3 Ảnh hưởng của độ mặn 18 2.6 Khái quát chung Bacillus subtilis 19 2.6.1 Sơ lược về B subtilis 19 2.6.2 Ảnh hưởng của yếu tố môi trường đến sự phát triển của B subtilis 20 2.6.3 Phân loại Bacillus theo phương pháp truyền thống 22 2.6.4 Phân loại Bacillus theo các phương pháp phân tử 22 2.6.5 Ứng dụng của B subtilis công nghiệp nuôi trồng thủy sản 26 2.7 Bacteriocin 29 2.7.1 Khái niệm 29 2.7.2 Phân loại Bacteriocin 31 2.7.3 Ứng dụng của bacteriocin từ Bacillus thủy sản 31 v 2.7.4 Subtilosin A 33 Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 3.1 Địa điểm nghiên cứu và đối tượng nghiên cứu 35 3.2 Phương pháp nghiên cứu 35 3.2.1 Phương pháp lấy mẫu 36 3.2.2 Phương pháp phân lập Vibrio sp và xác định V parahaemolyticus từ ao nuôi tôm 37 3.2.3 Phương pháp phát hiện gen độc tố ở chủng Vibrio sp phân lập được 37 3.2.3.1 pirA 39 3.2.3.2 pirB 39 3.2.3.3 toxR 39 3.2.3.4 tdh 40 3.2.3.5 trh 40 3.2.4 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của yếu tố môi trường (nhiệt độ, pH, độ mặn) đến sự phát triển của V parahaemolyticus 40 3.2.5 Phương pháp phân lập chủng vi khuẩn Bacillus ao nuôi tôm công nghiệp 41 3.2.5.1 Phương pháp lấy mẫu 41 3.2.5.2 Phương pháp phân lập Bacillus từ ao nuôi tôm 41 3.2.6 Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp 42 3.2.6.1 Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp có hoạt tính đới kháng V parahaemolyticus 42 3.2.6.2 Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp có hoạt tính protease cao 42 3.2.6.3 Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp có hoạt tính amylase cao 42 3.2.6.4 Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp có hoạt tính cellulase cao 43 3.2.7 Phương pháp tách chiết và tinh sạch DNA hệ gen của Bacillus 43 3.2.8 Phương pháp phát hiện và tách dòng gen mã hóa bacteriocin từ chủng Bacillus BRB2.1 43 3.2.8.1 Thiết kế mồi khuếch đại gen spaS sboA từ chủng Bacillus BRB2.1 43 3.2.8.2 PCR khuếch đại gen spaS sboA từ chủng Bacillus BRB2.1 44 3.2.8.3 Tách dịng giải trình tự gen sboA từ chủng Bacillus BRB 2.1 44 3.2.8.4 Xây dựng phả hệ trình tự nucleotide trình tự axít amin của subtilosin A 44 3.2.9 Phương pháp đánh giá đa đạng di truyền của Bacillus sp phân lập được 45 3.2.9.1 Đánh giá đa dạng di truyền nhóm Bacillus dựa trình tự 16S rDNA 45 3.2.9.2 Đánh giá đa đạng di truyền của nhóm Bacillus dựa phân tích MLST 46 3.2.10 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của yếu tố môi trường đến sự phát triển của Bacillus sp 47 vi 3.2.11 Kiểm tra khả gây AHPND của chủng V parahaemolyticus BĐB1.3v, BĐB1.4v, BNB 3.1v, BRB1.1v, CĐB6v TTCT 48 3.2.12 Nghiên cứu đợc tính của chủng V parahaemolyticus BĐB1.4v tơm 49 3.2.13 Phương pháp thử nghiệm tính đối kháng của Bacillus sp với Vibrio sp ở quy mô phòng thí nghiệm 50 3.2.13.1 Lựa chọn chủng Bacillus sp có khả ức chế vi khuẩn V parahaemolyticus hoạt tính enzyme ngoại bào cao 50 3.2.13.2 Khảo sát khả kháng vi khuẩn V parahaemolyticus của chủng vi khuẩn Bacillus sp hệ thớng bể ni tơm 100 lít 51 3.2.14 Phương pháp khảo sát khả kháng vi khuẩn Vibrio của chủng vi khuẩn Bacillus hệ thớng bể ni tơm 1000 lít 52 3.2.14.1 Bớ trí thí nghiêm: 52 3.2.14.2 Phương thức thực hiện: 52 3.2.14.3 Cho ăn và quản lý 52 3.2.14.4 Các tiêu theo dõi 53 3.2.15 Phương pháp xử lý số liệu 53 Chương 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN 54 4.1 Phân lập chủng thuộc chi Vibrio ao nuôi tôm công nghiệp 54 4.2 Kết phát gen độc lực chủng Vibrio sp phân lập bằng PCR 55 4.2.1 Phát hiện gen toxR đặc hiệu cho V parahaemolyticus 55 4.2.2 Phát hiện gen độc lực tdh 58 4.2.3 Phát hiện gen độc lực trh 59 4.2.4 Phát hiện gen độc lực pirA 60 4.2.5 Phát hiện gen độc lực pirB 60 4.3 Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ, độ mặn, pH đến sự phát triển V parahaemolyticus 62 4.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của chủng vi khuẩn V parahaemolyticus BĐB1.4v 62 4.3.2 Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của chủng vi khuẩn V parahaemolyticus BĐB1.4v 63 4.3.3 Ảnh hưởng của độ mặn đến sự phát triển của chủng vi khuẩn V parahaemolyticus BĐB1.4v 64 4.4 Phân lập chủng thuộc chi Bacillus ao nuôi tôm công nghiệp 65 4.5 Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp có hoạt tính sinh học ứng dụng ni tơm cơng nghiệp 67 4.5.1 Tuyển chọn chủng vi kh̉n Bacillus sp có hoạt tính đới kháng V parahaemolyticus 67 4.5.2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp có hoạt tính sinh protease cao 68 4.5.3 Tủn chọn chủng vi kh̉n Bacillus sp có hoạt tính sinh amylase cao 69 4.5.4 Tuyển chọn chủng vi kh̉n Bacillus sp có hoạt tính sinh cellulase cao 70 4.6 Xác định sự có mặt gen mã hóa bacteriocin chủng BRB2.1 72 4.6.1 Phát hiện và tách dòng gen mã hóa bacteriocin từ chủng BRB2.1 72 4.6.2 Xây dựng phả hệ so sánh trình tự axít amin subtilosin A của chủng BRB2.1 75 vii 4.6.2.1 Xây dựng phả hệ trình tự axít amin của subtilosin A từ chủng BRB2.1 75 4.6.2.2 So sánh trình tự axít amin subtilosin A 76 4.6.3 Xây dựng phả hệ so sánh trình tự nucleotide gen sboA chủng BRB2.1 với 10 chủng tham chiếu 77 4.6.3.1 Xây dựng phả hệ trình tự nucleotide gen sboA 77 4.6.3.2 So sánh trình tự nucleotide gen sboA 77 4.7 Đa dạng di truyền 26 chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus dựa trình tự gen mã hóa 16S rDNA và phân tích MLST 78 4.7.1 Phân tích đa dạng di truyền của 26 chủng vi khuẩn Bacillus bằng phương pháp giải trình tự 16S rDNA 78 4.7.2 Phân tích đa dạng di truyền của 26 chủng vi khuẩn nghi là Bacillus bằng MLST 79 4.8 Ảnh hưởng yếu tố môi trường đến sự phát triển chủng B subtilis BRB2.1 và B siamensis BĐK2.3 85 4.8.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của chủng B subtilis BRB2.1 và B siamensis BĐK2.3 85 4.8.2 Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của chủng B subtilis BRB2.1 và B siamensis BĐK2.3 86 4.8.3 Ảnh hưởng của độ mặn đến sự phát triển của chủng B subtilis BRB2.1 và B siamensis BĐK2.3 86 4.9 Kiểm tra khả gây AHPND chủng V parahaemolyticus BĐB1.4v TTCT 87 4.10 Nghiên cứu độc tính chủng V parahaemolyticus BĐB1.4v tơm 89 4.11 Thử nghiệm tính đối kháng Bacillus sp với V parahaemolyticus BĐB1.4v quy mơ phịng thí nghiệm 91 4.11.1 Nghiên cứu tính đối kháng của chủng B subtilis BRB2.1 và B siamensis BĐK2.3 đối với chủng V parahaemolyticus BĐB1.4v gây AHPND môi trường nước nuôi tôm 91 4.11.2 Thử nghiệm khả phòng chống AHPND của chủng B subtilis BRB2.1 và B siamensis BĐK2.3 thùng nuôi 100 Lít 93 4.12 Thử nghiệm khả bảo vệ tôm khỏi sự nhiễm V parahaemolyticus gây bệnh AHPND quy mơ ni 1000 lít 95 4.12.1 Sự biến động của các tiêu môi trường quá trình thử nghiệm 95 4.12.2 Sự biến động của tiêu vi sinh vật tổng số và mật độ Vibrio quá trình thử nghiệm 97 4.12.3 Tỉ lệ sống và sự phát triển của tôm quá trình thử nghiệm 99 Chương 5: KẾT LUẬN - ĐỀ XUẤT 101 5.1 Kết luận 101 5.2 Đề xuất 101 TÀI LIỆU THAM KHẢO 103 PHỤ LỤC A: SỐ LIỆU THÍ NGHIỆM 128 PHỤ LỤC B: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 149 PHỤ LỤC C: CÁC BẢNG ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI KHUẨN LẠC KHI PHÂN LẬP 150 PHỤ LỤC D: KẾT QUẢ ĐỊNH TÊN CỦA 30 CHỦNG NGHI LÀ BACILLUS BẰNG GIẢI TRÌNH TỰ GEN 16S RDNA 161 viii PHỤ LỤC E: KẾT QUẢ THỐNG KÊ 164 PHỤ LỤC F: MỘT SỐ HÌNH THỰC NGHIỆM 171 ix DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 2.1 Các gen được sử dụng để phân loại các loài thuộc nhóm B cereus bằng kỹ thuật MLST 25 Bảng 2.2 Các bacteriocin từ Bacillus sp được công bố khoảng thời gian 20002019 32 Bảng 3.1 Số lượng mẫu thu tại Bạc Liêu, Sóc Trăng và Cà Mau 35 Bảng 3.2 Các chủng vi khuẩn sử dụng dựng phả hệ gen subtilosin A 45 Bảng 3.3 Trình tự mồi sử dụng cho phân tích MLST 46 Bảng 4.1: Kết quả phân lập chủng vi khuẩn nghi ngờ là Vibrio 54 Bảng 4.2 Tổng hợp kết quả PCR khuếch đại gen toxR và hình thái khuẩn lạc môi trường Chromagar Vibrio 57 Bảng 4.3 Mật độ (Log cfu/ml) của V parahaemolyticus BĐB1.4v ở các mức nhiệt độ khác sau 24 và 48 giờ nuôi cấy 62 Bảng 4.4 Mật độ (Log cfu/mL) của vi khuẩn V parahaemolyticus BĐB1.4v các nghiệm thức pH khác sau 24 và 48 giờ nuôi cấy 63 Bảng 4.5 Mật độ (Log cfu/ml) của V parahaemolyticus BĐB1.4v ở các độ mặn khác sau 24 và 48 giờ nuôi cấy 65 Bảng 4.6 Kết quả phân lập chủng vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus 65 Bảng 4.7 Kết quả phân tích MLST gen “house-keeping” 81 Bảng 4.8 Mật độ của chủng B subtilis BRB2.1 và B siamensis BĐK2.3 sau 24 giờ nuôi cấy ở các nhiệt độ khác 85 Bảng 4.9 Mật độ của chủng B subtilis BRB2.1 và B siamensis BĐK2.3 sau 24 giờ nuôi cấy ở các giá trị pH khác 86 Bảng 4.10 Mật độ của chủng B subtilis BRB2.1 và B siamensis BĐK2.3 sau 24 giờ nuôi cấy ở các độ mặn khác 87 Bảng 4.11 Ảnh hưởng của chủng V parahaemolyticus đến tỉ lệ tôm chết sau 36 giờ gây nhiễm hệ thống nuôi 100 lít 88 Bảng 4.12 Ảnh hưởng của mật độ cảm nhiễm chủng V parahaemolyticus BĐB1.4v đến tỉ lệ tôm chết sau 24 giờ 90 Bảng 4.13 Ảnh hưởng của liều cấp giống của hai chủng B subtilis BRB2.1 và B siamensis BĐK2.3 đến mật độ V parahaemolyticus BĐB1.4v môi trường nước nuôi tôm 93 Bảng 4.14 Kết quả thử nghiệm khả phòng chống AHPND của chủng B subtilis BRB2.1 và B siamensis BĐK2.3 thùng nuôi 100 lít sau 36 giờ gây nhiễm 94 Bảng 4.15: Các tiêu môi trường các nghiệm thức 96 Bảng 4.16: Mật độ vi sinh vật tổng số của các nghiệm thức quá trình thử nghiệm (cfu/mL) 98 Bảng 4.17: Mật độ vi khuẩn Vibrio của các nghiệm thức quá trình thử nghiệm (cfu/mL) 98 Bảng 4.18: Tỉ lệ sống của tôm thẻ chân trắng và hệ số chuyển đổi thức ăn (FCR) sau thí nghiệm 100 Bảng C.1: Bảng mô tả hình dạng, kích thước khuẩn lạc các chủng Bacillus mẫu nước lấy tại Bạc Liêu sau 24h cấy môi trường NA 150 Bảng C.2: Bảng mô tả hình dạng, kích thước khuẩn lạc các chủng Vibrio mẫu nước lấy tại Bạc Liêu sau 24h cấy môi trường TCBS 151 Bảng C.3: Đặc điểm khuẩn lạc các chủng vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus môi trường NA (Mẫu bùn thu tại Bạc Liêu) 151 x Bảng C.4: Đặc điểm khuẩn lạc các chủng vi khuẩn nghi ngờ là Vibrio môi trường TCBS (Mẫu bùn thu tại Bạc Liêu) 152 Bảng C.5: Mô tả hình dạng, kích thước khuẩn lạc các chủng Bacillus ruột tôm sau 24h cấy môi trường NA (Mẫu lấy tại Bạc Liêu) 153 Bảng C.6: Mô tả hình dạng, kích thước khuẩn lạc các chủng Vibrio ruột tôm sau 24h cấy môi trường TCBS (Mẫu lấy tại Bạc Liêu) 154 Bảng C.7: Bảng mô tả hình dạng, kích thước khuẩn lạc các chủng Bacillus nước sau 24h cấy môi trường NA (Mẫu lấy tại Cà Mau) 155 Bảng C.8: Bảng mô tả hình dạng, kích thước khuẩn lạc các chủng Vibrio nước sau 24h cấy môi trường TCBS 156 Bảng C.9: Đặc điểm khuẩn lạc các chủng vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus môi trường NA (Mẫu lấy tại Cà Mau) 156 Bảng C.10: Đặc điểm khuẩn lạc các chủng vi khuẩn nghi ngờ là Vibrio môi trường TCBS (Mẫu lấy tại Cà Mau) 157 Bảng C.11: Mô tả hình dạng, kích thước khuẩn lạc các chủng Bacillus ruột tôm sau 24h cấy môi trường NA (Mẫu lấy tại Cà Mau) 157 Bảng C.12: Mô tả hình dạng, kích thước khuẩn lạc các chủng Vibrio ruột tôm sau 24h cấy môi trường TCBS (Mẫu lấy tại Cà Mau) 158 Bảng C.13: Bảng mô tả hình dạng, kích thước khuẩn lạc các chủng Bacillus nước sau 24h cấy môi trường NA (Mẫu lấy tại Sóc Trăng) 158 Bảng C.14: Đặc điểm khuẩn lạc các chủng vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus môi trường NA (Mẫu lấy tại Sóc Trăng) 159 Bảng C.15: Mô tả hình dạng, kích thước khuẩn lạc các chủng Bacillus ruột tôm sau 24h cấy môi trường NA (Mẫu lấy tại Sóc Trăng) 160 DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 2.1 Sơ đồ plasmid pVA1 và vị trí các gen pirA và pirB Hình 2.2 Vị trí gen pirA pirB plasmid pVA1 của V parahaemolyticus Hình 2.3 Nhuộm mô gan tụy bằng haematoxylin và eosin (Phiwsaiya et al., 2017) Hình 2.4 Hình thái vi khuẩn V parahaemolyticus dưới kính hiển vi điện tử (https://www.ppdictionary.com/bacteria/gnbac/parahemolyticus.htm) 13 Hình 2.5 Cấu trúc và các tác nhân độc lực của V parahaemolyticus (Wang et al., 2015) 13 Hình 2.6 Cấu trúc của độc tố Cry của B thuringiensis (Lin et al., 2017) 16 Hình 2.7 Cấu trúc của các độc tố PirA và PirB của V parahaemolyticus (Lin et al., 2017) 16 Hình 2.8 Hình thái vi khuẩn B subtilis 168 dưới kính hiển vi điện tử (Zweers et al., 2008) 19 Hình 2.9 Cấu trúc của Subtilosin A (Abriouel et al., 2011) 33 Hình 3.1 Sơ đồ nghiên cứu của luận án 36 Hình 3.2 Quy trình phát hiện các gen độc tố của các chủng V parahaemolyticus 38 Hình 3.3 Hình thái các loài Vibrio môi trường CHROMagar (CHROMagar, Paris, France) 38 Hình 4.1: Hình khuẩn lạc của vi khuẩn Vibrio phân lập tại Bạc lieu và Cà Mau 55 Hình 4.2 Kết quả PCR khuếch đại gen toxR từ 31 chủng Vibrio phân lập được 57 Hình 4.3 Kết quả PCR khuếch đại gen tdh từ 31 chủng Vibrio phân lập được 59 Hình 4.4 Kết quả PCR khuếch đại gen trh từ 31 chủng Vibrio phân lập được 59 Hình 4.5 Kết quả PCR khuếch đại gen pirA từ 31 chủng Vibrio phân lập được 60 Hình 4.6 Kết quả PCR khuếch đại gen pirB từ 31 chủng Vibrio phân lập được 61 xi Hình 4.7 Kết quả điện di lại sản phẩm PCR khuếch đại gen pirB từ các mẫu BDB11.1v (19); CRK1.2v (27); BĐB1.4v (31) 61 Hình 4.8: Hình khuẩn lạc của vi khuẩn Bacillus phân lập tại Bạc Liêu, Sóc Trăng và Cà Mau 66 Hình 4.9 Vòng kháng khuẩn của chủng BRB2.1, BĐK2.3, BNK 6.1, BRK4.4, BNK7.1, BĐB11.1 đĩa thạch với vi khuẩn kiểm định là chủng V parahaemolyticus BĐB1.4v 68 Hình 4.10 Vòng ức chế vi sinh vật kiểm định (D-d) của chủng nghi là Bacillus có hoạt tính đới kháng V parahaemolyticus Thanh sai số thể hiện giá trị độ lệch chuẩn 68 Hình 4.11 Hình ảnh sàng lọc hoạt tính sinh protease của một số chủng nghi là Bacillus sp môi trường thạch SM 69 Hình 4.12 Khả sinh protease của tập hợp 30 chủng nghi là Bacillus 69 Hình 4.13 Hình ảnh sàng lọc hoạt tính sinh amylase của một số chủng nghi là Bacillus sp môi trường Starch Agar 70 Hình 4.14 Khả sinh amylase của 30 chủng nghi là Bacillus 70 Hình 4.15 Hình ảnh sàng lọc hoạt tính sinh cellulose của một số chủng nghi là Bacillus sp môi trường CMC 71 Hình 4.16 Khả sinh cellulase của 30 chủng nghi là Bacillus 71 Hình 4.17 Kết quả PCR khuếch đại gen spaS sboA từ chủng BRB2.1 73 Hình 4.18 Kết quả sàng lọc đoạn gen sboA vector pJET1.2 74 Hình 4.19 Cây phả hệ trình tự axít amin subtilosin A của chủng Bacillus BRB 2.1 10 chủng tham chiếu 75 Hình 4.20 So sánh đối chiếu trình tự axít amin subtilosin A của chủng BRB2.1 với 10 chủng tham chiếu 76 Hình 4.21 Cây phả hệ trình tự nucleotide gen sboA của chủng BRB2.1 và 10 chủng tham chiếu 77 Hình 4.22 So sánh đối chiếu trình tự nucleotide gen sboA của chủng BRB2.1 với 10 chủng tham chiếu 78 Hình 4.23 Cây phát sinh chủng loại của 26 chủng Bacillus với chủng tham chiếu dựa trình tự 16S rDNA 79 Hình 4.24 Kết quả khuếch đại bằng PCR các vùng gen ptA (A); rpoD (B); ilvD (C); glpF (D); pycA (E); purH (F); tpiA (G) 80 Hình 4.25 Cây phát sinh chủng loại dựa kết quả phân tích MLST của 26 chủng Bacillus 83 Hình 4.26 Mô gan tụy của tôm thẻ chân trắng lây nhiễm với chủng V parahaemolyticus BNB3.1v (A) và BĐB1.4v (B), độ phóng đại 200X 89 Hình 4.27 Tương quan giữa mật độ cảm nhiễm của chủng V parahaemolyticus BĐB1.4v và tỉ lệ tôm chết (tính theo giá trị probit) 90 Hình 4.28 Mô gan tụy của TTCT 24 giờ sau cảm nhiễm với chủng V parahaemolyticus BĐB1.4v 91 Hình 4.29 Tế bào gan tụy tôm bị bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) 95 độ phóng đại 200X 95 xii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC TIẾNG ANH TIẾNG VIỆT AHPND Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease Bệnh hoại tử gan tụy cấp BHI Brain heart infusion Môi trường canh thang não – tim Bộ Nông Nghiệp Phát triển Nông thôn BNNPTNT CMC Carboxymethyl cellulose Môi trường CMC CFU Colony forming unit Khuẩn lạc DNA Deoxyribonucleic acid Axid nucleic DO Dissolved oxygen Oxy hòa tan EHP Enterocytozoon Hepatopenaei Vi bào tử trùng EMS Early Mortality Syndromy Hội chứng tôm chết sớm ĐC Đối chứng ĐBSCL Đồng Bằng Sông Cửu Long FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations Tổ chức Nông Lương Thế giới IHHNV Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus Vi rút gây bệnh hoại tử quan tạo máu và quan lập biểu mô IMNV Infectious myonecrosis virus Vi rút gây bệnh hoại tử LAB Lactic acid bacteria Vi khuẩn lactic LB Luria-Bertani broth Môi trường LB MLST Multi-locus Sequence Typing Kỹ thuật MLST MRS de Man, Rogosa and Sharpe agar Môi trường MRS NA Nutrient Agar Môi trường dưỡng xiii thạch dinh BRK 5.4 BRK 6.1 BRK 7.3 BDK 2.3 BDK 9.2 BNK 2.2 BNK 2.3 BNK 7.1 BNK 8.1 B halotolerans NR_115063.1 99.8% B velezensis NR_075005.2 99.9% B amyloliquefaciens NR_117946.1 99.8% B subtilis NR_102783.2 99.7% B vallismortis NR_024696.1 99.6% B subtilis NR_113265.1 100.0% B tequilensis NR_104919.1 99.9% B mojavensis NR_112725.1 99.8% B halotolerans NR_115063.1 99.8% B subtilis NR_113265.1 100.0% B tequilensis NR_104919.1 99.9% B mojavensis NR_112725.1 99.8% B halotolerans NR_115063.1 99.8% B velezensis NR_075005.2 99.9% B amyloliquefaciens NR_117946.1 99.9% B subtilis NR_102783.2 99.8% B vallismortis NR_024696.1 99.7% B subtilis NR_113265.1 100.0% B tequilensis NR_104919.1 99.9% B mojavensis NR_118290.1 99.8% B halotolerans NR_115063.1 99.8% B velezensis NR_075005.2 99.8% B amyloliquefaciens NR_117946.1 99.7% B subtilis NR_102783.2 99.6% B nakamurai NR_151897.1 99.5% B amyloliquefaciens NR_117946.1 99.8% B velezensis NR_116240.1 99.7% B siamensis NR_117274.1 99.7% B subtilis NR_102783.2 99.6% B velezensis NR_116240.1 99.9% B amyloliquefaciens NR_117946.1 99.9% B subtilis NR_102783.2 99.8% B vallismortis NR_024696.1 99.7% B amyloliquefaciens NR_117946.1 99.9% B velezensis NR_116240.1 99.9% 163 B subtilis NR_102783.2 99.7% B siamensis NR_117274.1 99.7% PHỤ LỤC E: KẾT QUẢ THỐNG KÊ E1: Các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến sự phát triển vi khuẩn Vibrio Bảng E1.1: Phân tích ANOVA về ảnh hưởng của nhiệt đợ đến mật số vi khuẩn Vibrio sau 24 h Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 0.0000 Between groups 243.206 48.6412 Within groups 0.280067 12 0.0233389 Total (Corr.) 243.486 17 2084.13 Bảng E1.2: Kiểm định LSD về ảnh hưởng của nhiệt độ đến mật số vi khuẩn Vibrio sau 24 h Nhiet Count Mean Homogeneous Groups 10 1.17 X 20 8.23 X 26 8.21 X 30 8.55333 37 8.39 45 X XX X Bảng E1.3: Phân tích ANOVA về ảnh hưởng của nhiệt độ đến mật số vi khuẩn Vibrio sau 48 h Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 247.43 49.4859 1877.63 0.0000 Within groups 0.316267 12 0.0263556 Total (Corr.) 247.746 17 Bảng E1.4: Kiểm định LSD về ảnh hưởng của nhiệt độ đến mật số vi khuẩn Vibrio sau 48 h Nhiet Count Mean Homogeneous Groups 10 1.30667 X 20 8.42667 X 26 8.43333 X 164 30 8.46 X 37 8.58667 X 45 X Bảng E1.5: Phân tích ANOVA về ảnh hưởng của pH đến mật số vi khuẩn Vibrio sau 24 h Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 131.741 32.9353 371.79 0.0000 Within groups 0.885867 10 0.0885867 Total (Corr.) 132.627 14 Bảng E1.6: Kiểm định LSD về ảnh hưởng của pH đến mật số vi khuẩn Vibrio sau 24 h pH Count Mean Homogeneous Groups X 7.32 X 7.60667 X 7.5 7.37 X 7.32 X Bảng E1.7: Phân tích ANOVA về ảnh hưởng của pH đến mật số vi khuẩn Vibrio sau 48 h Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 157.273 39.3183 0.0000 Within groups 0.516867 10 0.0516867 Total (Corr.) 157.79 14 760.71 Bảng E1.8: Kiểm định LSD về ảnh hưởng của pH đến mật số vi khuẩn Vibrio sau 48 h pH Count Mean Homogeneous Groups X 7.52667 X 8.12 XX 7.5 8.18 XX 8.42 XX Bảng E1.9: Phân tích ANOVA về ảnh hưởng của độ mặn đến mật số vi khuẩn Vibrio sau 24 h 165 Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 274.324 54.8649 0.0000 Within groups 0.334533 12 0.0278778 Total (Corr.) 274.659 17 1968.05 Bảng E1.10: Kiểm định LSD về ảnh hưởng của độ mặn đến mật số vi khuẩn Vibrio sau 24 h NaCl Count Mean Homogeneous Groups X X 10 0.3 20 7.46333 30 8.11 X 40 8.10667 X X X Bảng E1.11: Phân tích ANOVA về ảnh hưởng của độ mặn đến mật số vi khuẩn Vibrio sau 48 h Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 301.481 60.2961 1243.50 0.0000 Within groups 0.581867 12 0.0484889 Total (Corr.) 302.063 17 Bảng E1.12: Kiểm định LSD về ảnh hưởng của độ mặn đến mật số vi khuẩn Vibrio sau 48 h NaCl Count Mean Homogeneous Groups X X 10 0.566667 20 8.39333 X 30 8.44667 X 40 8.25333 X X E2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp có hoạt tính đối kháng với Vibrio sp Bảng E2.1: Phân tích ANOVA về khả đới kháng của Bacillus sp với Vibrio sp Source Sum of Squares Df Between groups 590.667 29 Mean Square F-Ratio P-Value 20.3678 0.0000 166 32.73 Within groups 37.3333 60 Total (Corr.) 628.0 89 0.622222 Bảng E2.2: Kiểm định LSD về khả đối kháng của Bacillus sp với Vibrio sp Nghiem thuc Count Mean Homogeneous Groups BNB11.1-BDB1.4v 4.33333 X BNB11.1-CNB6v 4.33333 X BNB11.1-BDB1.3v 5.0 XXX BNB11.1-BNB3.1v 7.33333 XXX BNB11.1-BDB1.1v 8.33333 XX BNK6.1-BDB1.3v 4.66667 XX BNK6.1-BDB1.4v 5.0 XXX BNK6.1-CNB6v 5.66667 XXX BNK6.1-BNB3.1v 8.66667 XX BNK6.1-BDB1.1v 9.66667 XX BRK4.4-CNB6v 5.0 XXX BRK4.4-BDB1.3v 5.33333 XXX BRK4.4-BDB1.4v 6.0 XXX BRK4.4-BDB1.1v 6.66667 XXX BRK4.4-BNB3.1v 7.0 XXX BNK7.1-CNB6v 6.66667 XXX BNK7.1-BDB1.3v 7.0 XXX BNK7.1-BNB3.1v 7.33333 XXX BNK7.1-BDB1.4v 8.0 XXX BNK7.1-BDB1.1v 8.33333 XX BRB2.1-CNB6v 8.66667 XX BRB2.1-BDB1.3v 9.0 XX BRB2.1-BDB1.1v 11.3333 XXX BRB2.1-BNB3.1v 11.6667 XX BRB2.1-BDB1.4v 13.3333 X 167 Nghiem thuc Count Mean Homogeneous Groups BĐK2.3-BDB1.3v 10.3333 XX BĐK2.3-BNB3.1v 10.6667 XXX BĐK2.3-CNB6v 11.0 XXX BĐK2.3-BDB1.1v 11.6667 XX BĐK2.3-BDB1.4v 12.0 X E3: Các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến sự phát triển vi khuẩn Bacillus Bảng E3.1: Phân tích ANOVA về ảnh hưởng của nhiệt đợ đến mật số vi khuẩn Bacillus sau 24 h Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups Within groups Total (Corr.) 0.903533 2.60433 3.50787 0.301178 0.325542 0.4716 11 0.93 Bảng E3.2: Kiểm định LSD về ảnh hưởng của nhiệt độ đến mật số vi khuẩn Bacillus sau 24 h Nghiem thuc BĐK 2.3-26oC BĐK 2.3-30oC BĐK 2.3-37oC BĐK 2.3-40oC BRR 2.1-26oC BRR 2.1-30oC BRR 2.1-37oC BRB 2.1-40oC Count 3 3 3 3 Mean 9.39 9.46 9.57 9.51 9.32 9.39 9.55 9.49 Homogeneous Groups X X X X X X X X Bảng E3.3: Phân tích ANOVA về ảnh hưởng của pH đến mật số vi khuẩn Bacillus sau 24 h Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0.20483 0.0227589 6.50 0.0003 Within groups 0.07 20 0.0035 Total (Corr.) 0.27483 29 Bảng E3.4: Kiểm định LSD về ảnh hưởng của pH đến mật số vi khuẩn Bacillus sau 24 h NT pH Count Mean Homogeneous Groups BĐK2.3-4 9.1 X BĐK2.3-5 9.13667 XX BĐK2.3-6 9.20333 XX 168 NT pH Count Mean Homogeneous Groups BĐK2.3-7 9.32667 BĐK2.3-8 9.14 BRB2.1-4 9.22 XX BRB2.1-5 9.20333 XX BRB2.1-6 9.25667 XX BRB2.1-7 9.36 BRB2.1-8 9.12333 XX XX X XX Bảng E3.5: Phân tích ANOVA về ảnh hưởng của độ mặn đến mật số vi khuẩn Bacillus sau 24 h Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares 1.47538 1.73387 3.20925 Df 12 17 Mean Square 0.295077 0.144489 F-Ratio 2.04 P-Value 0.1443 Bảng E3.6: Kiểm định LSD về ảnh hưởng của độ mặn đến mật số vi khuẩn Bacillus sau 24 h Nghiem thuc BRB 2.1-0‰ BRB 2.1-5‰ BRB 2.1-20‰ BRB 2.1-40‰ BĐK 2.3-0‰ BĐK 2.3-5‰ BĐK 2.320‰ BĐK 2.340‰ Count 3 3 3 Mean 9.12 9.07 9.15 9.12 9.03 8.96 9.01 Homogeneous Groups X X X X X X X 9.05 X E4: Khảo sát ảnh hưởng chủng vi khuẩn Vibrio đến tôm thẻ theo thời gian Bảng E4.1: Phân tích ANOVA về ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn Vibrio đến tôm thẻ ở thời gian 36 h Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio Between groups 23538.5 4707.7 Within groups 251.948 12 20.9957 Total (Corr.) 23790.4 17 224.22 P-Value 0.0000 Bảng E4.2: Kiểm định LSD về ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn Vibrio đến tôm thẻ ở thời gian 36 h Vibrio Count BĐB 1.3v Mean 3.33333 Homogeneous Groups X 169 BĐB 1.4v 100.0 BNB 3.1v 3.33333 X BRB 1.1v 6.66667 X CĐB 6v 2.22 X DC X X E5: Khảo sát khả kháng vi khuẩn Vibrio chủng vi khuẩn Bảng E5.1: Phân tích ANOVA về tỉ lệ sớng của tôm ở các nghiệm thức tại thời điểm 36 h Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 17575.1 4393.76 0.0000 Within groups 178.607 10 17.8607 Total (Corr.) 17753.7 14 246.00 Bảng E5.2: Kiểm định LSD về tỉ lệ sống của tôm ở các nghiệm thức tại thời điểm 36h NT Count Mean Homogeneous Groups BĐB1.4v X BRB2.1-BĐK23-BĐB1.4v 64.44 X BĐK23-BĐB1.4v 76.67 X BRB2.1-BĐB1.4v 85.56 DC 97.78 X X E6: Khả át chế Bacillus sp Vibrio Parahaemolyticus ảnh hưởng lên sự phát triển tơm thẻ Bảng E6.1: Phân tích ANOVA về tỉ lệ sống của tôm thẻ tại thời điểm 35 ngày Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 0.0000 Between groups 11817.7 5908.86 Within groups 64.6667 10.7778 Total (Corr.) 11882.4 548.24 Bảng E6.2: Kiểm định LSD về tỉ lệ sống của tôm thẻ tại thời điểm 35 ngày NT Count Mean Homogeneous Groups D2 X 170 D1 55.0 D3 87.8333 X X Bảng E6.3: Phân tích ANOVA về hệ sớ chủn đởi thức ăn FCR sau 35 ngày nuôi Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 3.00242 1.50121 Within groups 0.00633333 0.00105556 Total (Corr.) 3.00876 1422.20 0.0000 Bảng E6.4: Kiểm định LSD về hệ số chuyển đổi thức ăn FCR sau 35 ngày nuôi NT Count Mean Homogeneous Groups D2 X D3 1.10667 D1 1.31667 X X PHỤ LỤC F: MỘT SỐ HÌNH THỰC NGHIỆM 171 Kiểm tra các ́u tớ mơi trường nước 172 Lấy mẫu gan tụy và ruột tôm kiểm tra mật số vi khuẩn Vibrio ban đầu Cố định mẫu tôm dung dịch cồn và Davidson’s 173 Hệ thống thí nghiệm 100 lít 174 175 Hệ thống thí nghiệm 1000 lít 176 THƠNG TIN TỔNG QT Họ tên Nghiên cứu sinh: Lê Thế Xuân Ngày tháng năm sinh: 19/5/1976 Giới tính: Nam Nơi sinh: Thanh Hóa Điện thoại: 0918039764 Đơn vị công tác: Công ty TNHH SX & TM Trúc Anh Địa hiện nay: Công Điền, Vĩnh Trạch, Bạc Liêu Tốt nghiệp Đại học ngành: Nuôi trồng thủy sản Năm:1999 Tại: Đại học Nha Trang Tốt nghiệp Thạc sĩ ngành: Công nghệ sinh học Năm: 2012 Tại: Đại học Bách khoa Hà Nội 177 ... thông qua vi? ?̣c kích hoạt hệ thống miễn dịch của tôm (Zokaeifar et al., 2012) Đề tài ? ?Nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn Bacillus sp đối kháng với Vibrio parahaemolyticus nuôi tôm công nghiệp? ??... chi Bacillus ao nuôi tôm công nghiệp 65 4.5 Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp có hoạt tính sinh học ứng dụng nuôi tôm công nghiệp 67 4.5.1 Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus. .. khuẩn ở tôm nuôi chủ yếu vi khuẩn Vibrio gây nên Vi khuẩn Vibrio có thể làm chết ấu trùng tôm, chết tôm giống và tôm trưởng thành, gây thiệt hại đáng kể nghề nuôi tôm công nghiệp