PHẠM THỊ BÍCH PHƯỢNG NGHIÊN cứu tác DỤNG SINH học và bước đầu tìm HIỂU cơ CHẾ hóa SINH của NGŨ GIA bì HƯƠNG (acanthopanax gracilistylus w w smith) TRÊN mô HÌNH RUỒI GIẤM CHUYỂN GEN MANG BỆNH tự kỷ KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược sĩ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI *** PHẠM THỊ BÍCH PHƯỢNG NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG SINH HỌC VÀ BƯỚC ĐẦU TÌM HIỂU CƠ CHẾ HĨA SINH CỦA NGŨ GIA BÌ HƯƠNG (Acanthopanax gracilistylus W.W.Smith) TRÊN MƠ HÌNH RUỒI GIẤM CHUYỂN GEN MANG BỆNH TỰ KỶ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2020 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI *** PHẠM THỊ BÍCH PHƯỢNG MÃ SINH VIÊN: 1501406 NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG SINH HỌC VÀ BƯỚC ĐẦU TÌM HIỂU CƠ CHẾ HĨA SINH CỦA NGŨ GIA BÌ HƯƠNG (Acanthopanax gracilistylus W.W.Smith) TRÊN MƠ HÌNH RUỒI GIẤM CHUYỂN GEN MANG BỆNH TỰ KỶ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Phạm Thị Nguyệt Hằng PGS.TS Nguyễn Thị Lập Nơi thực hiện: Viện Dược liệu Bộ mơn Hố sinh HÀ NỘI – 2020 LỜI CẢM ƠN Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS Phạm Thị Nguyệt Hằng, trưởng khoa Dược lý - Sinh hóa, Viện Dược liệu Cô người trực tiếp hướng dẫn em trình nghiên cứu khoa học khoa, ln bên cạnh động viên cổ vũ, dìu dắt em thực tốt khoá luận Tiếp đến, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Thị Lập, mơn Hóa sinh - trường Đại học Dược Hà Nội Cô cho em hội nghiên cứu khoa học môi trường chuyên nghiệp, đưa lời khuyên quý báu, giúp đỡ em suốt q trình thực khố luận tốt nghiệp Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến anh chị khoa Dược lý Sinh hóa, Viện Dược liệu giúp đỡ, hướng dẫn em kỹ thuật tạo điều kiện để em hồn thành nghiên cứu thực nghiệm khoa Nhân dịp này, em xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu toàn thể thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội dạy dỗ tạo điều kiện thuận lợi cho em thời gian em học tập trường Cuối cùng, em xin bày tỏ yêu thương biết ơn sâu sắc tới gia đình bạn bè ln bên em, ủng hộ động viên em, chỗ dựa tinh thần vững em gặp khó khăn học tập sống Do thời gian làm thực nghiệm kiến thức thân có hạn, khóa luận cịn có nhiều thiếu sót Em mong nhận góp ý thầy cơ, bạn bè để khóa luận hồn thiện Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Sinh viên Phạm Thị Bích Phượng MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ .1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan dược liệu nghiên cứu: Ngũ gia bì hương 1.1.1 Tên gọi - vị trí phân loại .3 1.1.2 Đặc điểm thực vật, phân bố 1.1.3 Giá trị sử dụng 1.1.4 Thành phần hóa học 1.1.5 Một số nghiên cứu tác dụng dược lý thực Ngũ gia bì hương 1.1.5.1 Các nghiên cứu giới 1.1.5.2 Các nghiên cứu nước 1.2 Tổng quan bệnh tự kỷ 1.2.1 Sơ lược bệnh tự kỷ 1.2.2 Dịch tễ 1.2.3 Các yếu tố nguy 1.2.3.1 Yếu tố di truyền học .8 1.2.3.2 Yếu tố rủi ro môi trường 1.2.4 Dấu hiệu, triệu chứng vấn đề chẩn đoán chung 10 1.2.5 Điều trị 11 1.2.6 Một số mơ hình nghiên cứu rối loạn tự kỷ 12 1.3 Tổng quan ruồi giấm .13 1.3.1 Chu kỳ vòng đời 13 1.3.2 Hệ gen ruồi giấm 14 1.3.3 Cấu trúc thần kinh ruồi giấm 14 1.3.3 Mơ hình ruồi giấm đột biến gen rugose gây bệnh tự kỷ 16 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .17 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị .17 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 17 2.1.2 Động vật nghiên cứu 17 2.1.3 Dụng cụ, hóa chất nghiên cứu 17 2.2 Nội dung nghiên cứu 19 2.3 Phương pháp nghiên cứu 20 2.2.1 Đánh giá tác dụng cao chiết cồn NGBH mơ hình ruồi giấm đột biến gen mang bệnh tự kỷ thử nghiệm hành vi 20 2.2.1.1 Đánh giá tương tác cộng đồng (Social space assay) 20 2.2.1.2 Đánh giá nhịp sinh học ruồi giấm 21 2.2.1.3 Đánh giá khả di chuyển (bò) ấu trùng ruồi giấm 22 2.2.1.4 Đánh giá khả nhớ mùi ấu trùng ruồi giấm (Odor- taste learning) 23 2.2.2 Đánh giá thay đổi cấu trúc thần kinh (Neuromuscular junction - NMJ) phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang 25 2.2.3 Phân tích kết 27 3.1 Kết đánh giá tác dụng cao chiết cồn NGBH mơ hình ruồi giấm đột biến gen mang bệnh tự kỷ thử nghiệm hành vi 28 3.1.1 Kết đánh giá khả tương tác cộng đồng (Social space assay) .28 3.1.2 Kết đánh giá nhịp sinh học ruồi giấm 29 3.1.2 Kết đánh giá khả di chuyển (bò) ấu trùng ruồi giấm 31 3.1.2 Kết đánh giá khả nhớ mùi ấu trùng ruồi giấm (Odor - taste learning) 33 3.2 Kết đánh giá thay đổi cấu trúc thần kinh (Neuromuscular junction-NMJ) phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang 34 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 37 4.1 Về mơ hình nghiên cứu 37 4.1.1 Về việc lựa chọn mơ hình ruồi giấm đột biến gen mang bệnh tự kỷ 37 4.1.2 Về để lựa chọn mức liều 2mg/ml 4mg/ml 38 4.2 Về kết nghiên cứu 38 4.2.1 Về cải thiện mức độ tương tác cộng đồng 38 4.2.2 Về thay đổi nhịp sinh học ruồi giấm .39 4.2.3 Về khả di chuyển (bò) ấu trùng ruồi giấm 40 4.2.4 Về khả học tập ấu trùng ruồi giấm .40 4.2.5 Về thay đổi cấu trúc thần kinh (Neuromuscular junction-NMJ) phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang 41 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .43 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT STT Viết tắt ABA ADHA Viết đầy đủ theo Tiếng Anh Applied Behavior Analysis Viết đầy đủ theo Tiếng Việt Phân tích hành vi ứng dụng Attention deficit hyperactivity Rối loạn tăng động giảm disorder ý ASD Autism Spectrum Disorder Hội chứng rối loạn phổ tự kỷ BSA Biotin-streptavidine Biotin-streptavidin DLG Discs-Large Kháng thể anti-Discs-Large FICT Fluorescein isothiocyanate Fluorescein isothiocyanat FragileX Mental Retardation Gen Fragile X FRM1 Mental Retardation Hemolymph-like saline Dung dịch muối HL3 Neurobeachin Gen Neurobeachin HL3 NBEA 10 NGBH 11 NMJ Neuromuscular junction Ngã ba thần kinh 12 PBS Phosphat buffer saline Đệm Phosphat 13 PBST Triton/PBS Dung dịch Triton/PBS 14 PFA Paraformaldehyde Paraformaldehyd 15 SSR Subsynap reticulum region Vùng mạng lưới sau synap 16 TSC Tuberous Sclerosis Complex Hội chứng xơ cứng củ 17 VPA Axit valproic Axit valproic Ngũ gia bì hương DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1: Hóa chất 17 Bảng 2: Dụng cụ, thiết bị 18 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ ĐỒ THỊ Hình 1:Một số hình ảnh NGBH (Acanthropanaxgracilistylus W.W.Smith) Hình 2:Cấu trúc hóa học syringin Hình 3: Các gen liên quan đến rối loạn phổ tự kỷ người (ASD) với chức sinh học khác Hình 4:Chu kỳ vịng đời ruồi giấm 14 Hình 5:Cấu trúc thần kinh (Neuromuscular junction) ấu trùng ruồi giấm 15 Hình 1: Thiết kế thí nghiệm đánh giá tương tác cộng đồng ruồi giấm 20 Hình 2: Hệ thống quan sát DAM2 Drosophila Activity Monitor 22 Hình 3: Thiết kế thí nghiệm đánh giá khả bò ấu trùng ruồi giấm 23 Hình 4: Thiết kế thí nghiệm đánh giá khả nhớ mùi ấu trùng ruồi giấm 24 Hình 5: Giải phẫu ấu trùng ruồi giấm bậc 26 Hình 1: Khả tương tác cộng đồng ruồi giấm đột biến gen tự kỷ 29 Hình 2: Kết phân tích tổng số lần hoạt động ngày ruồi giấm trưởng thành 30 Hình 3: Kết phân tích mức độ vận động thời điểm sáng sớm ruồi giấm ngày 31 Hình 4: Kết đánh giá khả vận động ấu trùng ruồi giấm tự kỷ 32 Hình 5: Chỉ số học tập LI biểu diễn biểu đồ box-and-whisker plot 33 Hình 6: Kết phân tích cấu trúc thần kinh (Neuromuscular junctionNMJ) nhóm số ấu trùng ruồi giấm bậc phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang 35 ĐẶT VẤN ĐỀ Rối loạn phổ tự kỷ (Autism spectrum disorder- ASD) bệnh lý thần kinh phức tạp với rối loạn hành vi thường xuất năm đời, đặc trưng suy giảm khả hòa nhập xã hội, suy giảm khả giao tiếp kết hợp với hành vi cứng nhắc, lặp lặp lại Trong thập kỷ gần đây, thay đổi nhận thức tiêu chuẩn chẩn đoán kết hợp yếu tố sinh học môi trường, tỷ lệ tự kỷ gia tăng cách nhanh chóng tất quốc gia, gây suy giảm chất lượng sống đồng thời khiến người mắc tự kỷ trở thành gánh nặng gia đình xã hội Cho đến bệnh chưa tìm hiểu đầy đủ nguyên nhân chưa có phương pháp hay thuốc điều trị đặc hiệu, thuốc tân dược sử dụng giúp cải thiện triệu chứng bệnh, nhiên lại gây nhiều tác dụng phụ nguy hiểm Vì nhu cầu nghiên cứu phát triển loại thuốc có nguồn gốc từ dược liệu khơng có tác dụng phụ để hỗ trợ điều trị hội chứng tự kỷ cần thiết giới quan tâm Ngũ gia bì hương có tên khoa học Acanthopanax gracilistylus W.W Smith họ Nhân sâm (Araliaceae) thuốc quí đưa vào sách đỏ quốc gia từ năm 1996 Cây mọc hoang dã trồng số nơi Việt Nam đặc biệt tỉnh miền Bắc Hà Giang Lào Cai Theo kinh nghiệm dân gian, vỏ rễ vỏ thân Ngũ gia bì hương sử dụng làm thuốc bổ, mạnh gân xương, tăng trí nhớ, chữa đau lưng, tê chân, trẻ em chậm biết bồi bổ cho phụ nữ sau sinh Nghiên cứu vỏ rễ vỏ thân Ngũ gia bì hương có thành phần hóa học saponin triterpenoid, syringin, acid triterpenoid có khung lapan, tinh dầu Kết nghiên cứu dự án “Nghiên cứu sàng lọc dược liệu có tác dụng ngăn ngừa/ hỗ trợ điều trị hội chứng tự kỷ chế tác dụng” PGS.TS Phạm Thị Nguyệt Hằng làm chủ nhiệm với mục tiêu ứng dụng mơ hình ruồi giấm đột biến gen mang bệnh tự kỷ để sàng lọc dược liệu khoa Dược lý- Sinh hóa, Viện Dược liệu cho thấy, Ngũ gia bì hương có tiềm điều trị hội chứng tự kỷ Hơn việc nghiên cứu thuốc làm từ dược liệu nhằm hỗ trợ điều trị tự kỷ hoàn tồn Việt Nam Vì lý trên, thực đề tài: “Nghiên cứu tác dụng sinh học CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 4.1 Về mô hình nghiên cứu 4.1.1 Về việc lựa chọn mơ hình ruồi giấm đột biến gen mang bệnh tự kỷ Ruồi giấm có tên khoa học Drosophila melanogaster, sinh vật sử dụng lĩnh vực di truyền học với nhiều đặc tính ưu điểm: • Hệ gen ruồi giấm giải trình tự tồn bộ, cho thấy có 70% gen tương đồng với gen người [53] • Sử dụng ruồi giấm nghiên cứu vấp phải vấn đề liên quan tới đạo đức nghiên cứu y sinh học tiến hành thử nghiệm lên động vật bậc cao hay động vật có vú khỉ • Ruồi giấm có vịng đời ngắn (khoảng 30 ngày) nên cho phép tạo lượng lớn ruồi giấm thời gian ngắn • Ruồi giấm có kích thước nhỏ nên tốn diện tích, nguyên vật liệu để ni dưỡng thí nghiệm • Chi phí thấp, dễ ni phịng thí nghiệm để tạo quần thể lớn, có tiềm sàng lọc dược chất thuốc • D.melanogaster có cặp nhiễm sắc thể so với 23 cặp người Sự đơn giản lý chúng sinh vật sử dụng phân tích, sàng lọc di truyền • D.melanogaster có tổ chức đa bào hồn chỉnh mặt cấu trúc có tương đồng cao mặt chức so sánh với hệ quan người hệ thần kinh, hệ vận động Bằng việc sử dụng ruồi giấm làm đối tượng nghiên cứu, Morgan – cha đẻ mơ hình phát quy luật di truyền đặt móng cho di truyền học đại Cho đến có nhiều cơng trình nghiên cứu sử dụng ruồi giấm làm mơ hình nghiên cứu bệnh người có bệnh thối hóa thần kinh, ví dụ mơ hình ruồi giấm đột biến gen mã hóa protein gây bệnh Alzhermer βamyloid, Tau,…[52] Mizuno cộng (năm 2010) dùng mơ hình ruồi giấm đột biến gen α-synuclein làm mơ hình nghiên cứu bệnh Parkinson yếu tố liên 37 quan [33] Do có nhiều ưu điểm, dễ quan sát định lượng, chúng tơi định sử dụng mơ hình ruồi giấm đột biến gen rugose để nghiên cứu tác dụng sinh học bước đầu tìm hiểu chế hóa sinh cao chiết cồn NGBH bệnh tự kỷ Mặc dù có lợi việc sử dụng D.melanogaster để nghiên cứu bệnh người, ruồi giấm có số nhược điểm : • Giải phẫu não quan khác ruồi khác với • Thiếu phương pháp để đo lường xu hướng hành vi, thiếu khả nhận người thức sâu sắc, thiếu hệ thống miễn dịch thích nghi tác dụng thuốc khác biệt đáng kể so sánh với nghiên cứu người Nhìn chung, D.melanogaster sinh vật mẫu tốt nhiều lý do, chúng có nhược điểm Tuy nhiên, mơ hình sử dụng ruồi giấm đột biến gen mang bệnh tự kỷ cung cấp chứng khoa học bệnh khơng thể có mơ hình người hỗ trợ tìm kiếm phương pháp điều trị phù hợp 4.1.2 Về để lựa chọn mức liều 2mg/ml 4mg/ml Chúng tơi tiến hành dị liều dải nồng độ từ 1mg/ml đến 10mg/ml Dựa vào khả sống sót mơ hình tương tác cộng đồng ruồi trưởng thành với nồng độ dải, nhận thấy nồng độ 2mg/ml 4mg/ml phù hợp để đưa vào nghiên cứu thức 4.2 Về kết nghiên cứu 4.2.1 Về cải thiện mức độ tương tác cộng đồng Để đánh giá tác dụng cải thiện triệu chứng tự kỷ NGBH, thực nghiên cứu đánh giá tương tác cộng đồng mơ hình ruồi giấm đột biến gen rugose mang bệnh tự kỷ Mặc dù thực tế tỷ lệ mắc bệnh tự kỷ trẻ em nam nhiều so với nữ, nhiên theo nghiên cứu ruồi giấm tương tác cộng động, cho thấy khơng có khác biệt có ý nghĩa giới [48] Vì vậy, chúng tơi tiến hành ruồi đực ruồi 38 Kết Hình 3.1 cho thấy ruồi giấm biến đổi gen rugose gây nên loạt thay đổi khả tương tác xã hội so với ruồi giấm chủng hoang dại Ruồi Rugose có biểu hành vi riêng lẻ, đứng rải rác khơng gian khơng có xu hướng giao tiếp, minh chứng khoảng cách tới gần quần thể tăng lên, phân bố chúng ngẫu nhiên, ruồi giấm biểu hành vi thể khơng có ruồi khác buồng thí nghiệm Kết tương đồng với nghiên cứu Wise cộng (2015) [58] Điều cho thấy mơ hình đánh giá tương tác cộng đồng ruồi giấm trưởng thành phù hợp để đánh giá tác dụng cao chiết cồn NGBH Với cao chiết cồn NGBH hai nồng độ nghiên cứu 2mg/ml 4mg/ml, đặc biệt NGBH nồng độ 4mg/ml cho thấy cải thiện trội với khoảng cách gần hai cá thể ruồi giấm rút ngắn lại tới 30% so với lô chứng bệnh lý, khác biệt có ý nghĩa thống kê với p< 0,001 Như thấy sử dụng cao chiết cồn NGBH giúp cải thiện khả tương tác cộng đồng ruồi giấm đột biến gen rugose mang bệnh tự kỷ 4.2.2 Về thay đổi nhịp sinh học ruồi giấm Sự thay đổi nhịp sinh học thường báo cáo trẻ mang bệnh tự kỷ [33, 44] Nghiên cứu mơ hình D.melanogaster, theo dõi nhịp sinh học thường tiến hành ruồi đực thay ruồi hoạt động đẻ trứng ảnh hưởng đến việc đo lường hoạt động vận động thực chúng [15] Kết Hình 3.2 Hình 3.3cho thấy đột biến gen rugose gây thay đổi trong cường độ hoạt động ruồi giấm Ruồi tự kỷ có xu hướng giảm hoạt động ngày, đồng thời khởi phát hoạt động buổi sáng muộn so với ruồi giấm lô chứng CantonS Xét trẻ tự kỷ cho thấy kết tương đồng mà tổng thời gian ngủ trẻ tự kỷ nhiều so với trẻ bình thường nghiên cứu trước [44] Với ruồi giấm đột biến gen rugose sử dụng cao chiết cồn NGBH nồng độ 4mg/ml, nhịp sinh học ruồi giấm cải thiện so với lô bệnh lý, đặc biệt NGBH nồng độ 4mg/ml giúp tăng gần 50% tổng hoạt động ngày khởi phát hoạt động buổi sáng sớm ngày 2,3,4 nghiên cứu so 39 với lô bệnh lý Các kết cho thấy tiềm việc sử dụng cao chiết cồn NGBH để cải thiện triệu chứng rối loạn tự kỷ trẻ em 4.2.3 Về khả di chuyển (bò) ấu trùng ruồi giấm Trong đặc điểm bật ASD liên quan đến suy giảm giao tiếp xã hội tương tác, chứng cho thấy trẻ em mắc ASD có loạt khiếm khuyết vận động Sự cải thiện khả vận động tiêu chí giúp đánh giá tác dụng thuốc tới rối loạn tự kỷ Kết ởHình 3.4cho thấy ấu trùng ruồi giấm biến đổi gen rugose có tốc độ bị chậm so với chủng hoang dại Kết tương đồng với kết nghiên cứu Wise cộng (2015) Ngoài theo dõi tốc độ di chuyển ấu trùng ruồi giấm, nhóm nghiên cứu cịn cho thấy ấu trùng ruồi giấm Rugose thường xuyên tư di chuyển cuộn trịn lơ chứng lại có xu hướng di chuyển theo đường thẳng [58] Với ấu trùng ruồi giấm đột biến gen rugose sử dụng cao chiết cồn NGBH nồng độ 4mg/mlđã cải thiện tốc độ bò ấu trùng ruồi giấm tới 40% so với lô bệnh lý, kết đạt ý nghĩa thống kê với p< 0,001 4.2.4 Về khả học tập ấu trùng ruồi giấm Trẻ tự kỷ thường có thiếu hụt khả học tập nhận thức Đế đánh giá khả học tập ruồi giấm tự kỷ, chúng tơi sử dụng mơ hình thử nghiệm khả nhớ mùi ruồi giấm giai đoạn ấu trùng (Odor- taste learning) nhằm mục đích đánh giá tác dụng NGBH lên khả học tập ấu trùng ruồi giấm tự kỷ Kết Hình 3.5 cho thấy, khả ghi nhớ mùi lô CantonS trội so với lô bệnh lý Rugose Đột biến gen rugose gây khiếm khuyết khả học mùi ấu trùng ruồi giấm báo cáo nghiên cứu Volders cộng [55] Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê lô sinh lý lô chứng bệnh lýcho thấy triển khai mơ hình đánh giá khả học tập mơ hình ấu trùng ruồi giấm tự kỷ thành công phù hợp để đánh giá tác dụng cao chiết cồn NGBH Các lô sử dụng cao chiết cồn NGBH có tác dụng tăng cường khả học tập so với lô chứng bệnh lý Trong nhóm ấu trùng đột biến gen rugose sử dụng cao chiết cồn NGBH nồng độ 2mg/ml cho thấy cải thiện có ý nghĩa thống kê (p< 40 0,05) Với nồng độ 4mg/ml có tăng cường khả học tập khơng có ý nghĩa thống kê (p> 0,05) 4.2.5 Về thay đổi cấu trúc thần kinh (Neuromuscular junction-NMJ) phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang Cấu trúc thần kinh ruồi giấm hiển thị số tính năng, bao gồm khả tiếp cận cấu trúc, tính rập khuôn khả tiếp cận thao tác di truyền, coi mơ hình thuận tiện hữu ích để làm sáng tỏ chế liên quan đến bệnh thần kinh tự kỷ Diện tích bouton có liên quan đến độ hoàn thiện khả dẫn truyền thần kinh sợi Kích thước bouton ảnh hưởng đến hiệu suất tốc độ truyền bouton đề cập số báo cáo [26] Do chúng tơi tiến hành khảo sát kích thước (diện tích) bouton có nhóm số ấu trùng ruồi giấm bậc lô nghiên cứu Kết Hình 3.6 cho thấy ấu trùng ruồi giấm bậc chủng hoang dại (CantonS) có số lượng bouton có diện tích lớn 2μm2 nhiều so với lô bệnh lý (Rugose), khác biệt đạt ý nghĩa thống kê với p< 0,01 cho thấy bouton NMJ ấu trùng ruồi giấm lô sinh lý hồn chỉnh so với lơ bệnh lý Những kết gợi ý gen rugose có liên quan đến việc hình thành trì cấu trúc, hình thái tế bào thần kinh ruồi giấm Điều góp phần giải thích ấu trùng ruồi giấm trưởng thành chủng hoang dại có khả vận động, hoạt động sinh học khả học tập ghi nhớ mùi tốt so với chủng ruồi giấm đột biến gen rugose mang bệnh tự kỷ Ấu trùng ruồi giấm đột biến gen rugose sử dụng dịch chiết NGBH nồng độ 2mg/ml làm tăngsố lượng bouton có kích thước lớn 2μm2 so với lơ bệnh lý với khác biệt đạt ý nghĩa thống kê (p< 0,05) Kết góp phần tìm hiểu chế hóa sinh NGBH mơ hình ruồi giấm đột biến gen mang bệnh tự kỷ NGBH thúc đẩy trình trưởng thành bouton, tăng cường dẫn truyền thần kinh giúp cải thiện khả vận động, khả ghi nhớ mùi, tương tác cộng đồng hoạt động sinh học lô bệnh lý tự kỷ 41 Trong khuôn khổ nghiên cứu, chúng tơi bước đầu tìm hiểu chế hóa sinh NGBH mơ hình ruồi giấm đột biến gen rugose mang bệnh tự kỷ thông qua việc tìm hiểu thay đổi diện tích bouton nhóm số ấu trùng ruồi giấm bậc Mặc dù giới có nghiên cứu mơ hình tự kỷ ruồi giấm, Việt Nam mơ hình cịn mẻ hứa hẹn mở hướng cho việc nghiên cứu sàng lọc dược liệu có tác dụng cải thiện triệu chứng tự kỷ 42 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Sau thực đề tài, rút kết luận sau: ✓ Ngũ gia bì hương (Acanthopanax gracilistylus W.W.Smith) có tác dụng cải thiện hội chứng tự kỷ mơ hình ruồi giấm đột biến gen rugose, đánh giá thơng qua mơ hình tương tác cộng đồng, nhịp sinh học, hành vi vận động khả học tập + Khả tương tác cộng đồng ruồi giấm tự kỷ sử dụng cao chiết cồn NGBH nồng độ 2mg/ml mg/ml cải thiện so với lô chứng bệnh lý với p< 0,05 p< 0,001 + Tổng số lần hoạt động ngày lô ruồi sử dụng cao chiết cồn NGBH nồng độ mg/ml nhiều so với lơ bệnh lý, khác biệt có ý nghĩa thống kê với p< 0,05 Khả khởi phát hoạt động buổi sáng ruồi giấm nồng độ mg/ml mg/ml NGBH sớm so với lô bệnh lý với p< 0,05 ngày 2, 3, nghiên cứu +Các lô sử dụng cao chiết cồn NGBH nồng độ 2mg/ml 4mg/ml có tác dụng cải thiện khả vận động ấu trùng ruồi giấm so với lô chứng bệnh lý với p< 0,001 +Khả học tập ghi nhớ mùi ấu trùng ruồi giấm điều trị với cao chiết cồn NGBH nồng độ 2mg/ml cải thiện dựa vào số học tập LI so với lô chứng bệnh lý với p< 0,05 ✓ Bước đầu tìm hiểu chế hóa sinh cao chiết cồn Ngũ gia bì hương thơng qua thay đổi cấu trúc thần kinh Ấu trùng ruồi giấm đột biến gen rugose có cấu trúc tế bào thần kinh bị biến đổi, thể việc giảm kích thước bouton nhóm số ấu trùng ruồi giấm Cao chiết cồn NGBH có khả làm tăng kích thước bouton mức nồng độ 2mg/ml Kiến nghị - Thực đánh giá thêm thông số liên quan đến cấu trúc thần kinh ấu trùng ruồi giấm tự kỷ (chiều dài nhánh, số lượng nhánh, số lượng bouton vệ tinh ) 43 - Tiến hành nghiên cứu sử dụng cao chiết cồn phân đoạn với thành phần hóa học cụ thể Ngũ gia bì hương để nâng cao hiệu cải thiện hội chứng tự kỷ với mức liều thấp - Triển khai đánh giá tác dụng điều trị bệnh tự kỷ cao chiết cồn Ngũ gia bì hương thu hái Hà Giang - Việt Nam mơ hình chuột thực nghiệm -Đánh giá độ an tồn Ngũ gia bì hương động vật thực nghiệm 44 Tài liệu tham khảo: Tài liệu tiếng việt: Bộ Khoa học công nghệ (2007), Sách đỏ Việt Nam phần II, Nhà xuất Khoa học tự nhiên công nghệ, 82-83 Phạm Thị Nguyệt Hằng, Đỗ Thị Hà, Nguyễn Thị Bích Thu, Phạm Thị Huyền, Nguyễn Minh Khởi (2017), Nghiên cứu tác dụng sinh học Ngũ gia bì hương, Viện Dược liệu Phạm Hoàng Hộ (2000), Cây cỏ Việt Nam II, tập 2, NXB Trẻ, Tp Hồ Chí Minh Trần Thị Minh Huế (2014), “ Giáo dục hòa nhập trẻ tự kỷ”, Báo cáo tổng kết đề tài khoa học công nghệ cấp bộ, Đại học Thái Nguyên Phạm Thanh Huyền (2008), Nghiên cứu số đặc điểm sinh học lồi thuộc họ Ngũ gia bì – Araliaceae (Ngũ gia bì hương - Acanthopanax gracilystylus W.W Smith, Ngũ gia bì gai - A trifoliatus, Sâm vũ diệp - Panax bipinnatifidus Seem Tam thất hoang - Panax stipuleanatus Tsai et Feng) phục vụ công tác bảo tồn phát triển, Luận án Tiến sỹ Sinh học Phạm Thanh Huyền, Nguyễn Tập, Đinh Văn Mỵ, Nguyễn Nghĩa Thìn (2005), “Nghiên cứu đặc điểm hình thái giải phẫu Ngũ gia bì hương Ngũ gia bì gia vùng Sa Pa – Lào Cai Phó Bảng – Hà Giang”, Tạpchí Dược liệu,10(4), 103108 Phạm Thanh Huyền, Nguyễn Tập, Ngô Văn Trại, Lê Thanh Sơn, Ngô Đức Phương, Cù Hải Long, Nguyễn Bá Hoạt (2006), “Sự phân bố Ngũ gia bì hương Ngũ gia bì gai Việt Nam”, Tạp chí Dược liệu,11(3), 106-108 Nguyễn Thị Tuyết Mai (2019), “ Nghiên cứu tác dụng bước đầu tìm hiểu chế Ngũ gia bì hương (Acanthopanax gracilistylus W.W Smith) mơ hình ruồi giấm đột biến gen Alzheimer”, Luận vănthạc sĩ dược học,Trường đại học Dược Hà Nội Nguyễn Thị Bích Thu, Đỗ Thị Hà (2013), “ Nghiên cứu phương pháp chiết xuất syringin từ Ngũ gia bì hương (Acanthopanax gracilistylus W.W Smith) “, Nghiên cứu dược & thông tin thuốc,3,102-105 10 Viện Dược liệu (2003), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, II, NXB Khoa học kỹ thuật, 410 - 415 Tài liệu tiếng anh: 11 American Psychiatric Association (2013), Diagnostic and statistical manual of mental disorders (DSM-5®), American Psychiatric Pub 12 Castermans, D., Wilquet, V., Parthoens, E., Huysmans, C., Steyaert, J., Swinnen, L., & Devriendt, K (2003), “The neurobeachin gene is disrupted by a translocation in a patient with idiopathic autism”, Journal of medical genetics,40(5), 352-356 13 Catherine, L., Mayada, E., Gillian, B., & Jeremy, V V (2018), “ Autism spectrum disorder”, The Lancet, 392(10146), 508-520 14 Chaste, P., & Leboyer, M (2012), “Autism risk factors: genes, environment, and gene-environment interactions”, Dialogues in clinical neuroscience,14(3), 281 15 Chiu, J C., Low, K H., Pike, D H., Yildirim, E., & Edery, I (2010), “Assaying locomotor activity to study circadian rhythms and sleep parameters in Drosophila”, JoVE (Journal of Visualized Experiments), (43), e2157 16 Cohen, D., Pichard, N., Tordjman, S., Baumann, C., Burglen, L., Excoffier, E., & Héron, D (2005), “Specific genetic disorders and autism: clinical contribution towards their identification”, Journal of autism and developmental disorders,35(1), 103-116 17 Flatt, T (2020), “Life-History Evolution and the Genetics of Fitness Components in Drosophila melanogaster”, Genetics, 214(1), 3-48 18 Freitag, C M., Staal, W., Klauck, S M., Duketis, E., & Waltes, R (2010), “Genetics of autistic disorders: review and clinical implications”, European child & adolescent psychiatry,19(3), 169-178 19 Gardener, H., Spiegelman, D., & Buka, S L (2009), “Prenatal risk factors for autism: comprehensive meta-analysis”, The British journal of psychiatry, 195(1), 7-14 20 Gerber, B., Biernacki, R., & Thum, J (2013),“Odor–taste learning assays in Drosophila larvae”, Cold Spring Harbor Protocols, 2013(3), 071639 (20-tuyết mai) 21 Hoang, V M., Le, T V., Chu, T T Q., Le, B N., Duong, M D., Thanh, N M., & Bui, T T H (2019), “Prevalence of autism spectrum disorders and their relation to selected socio-demographic factors among children aged 18-30 months in northern Vietnam”, International journal of mental health systems,13, 29-29 22 Hulbert, S W., & Jiang, Y H (2016), “Monogenic mouse models of autism spectrum disorders: common mechanisms and missing links”, Neuroscience,321, 3-23 23 Ivanov, H Y., Stoyanova, V K., Popov, N T., & Vachev, T I (2015), “Autism spectrum disorder-a complex genetic disorder”, Folia medica, 57(1), 19-28 24 Jantrapirom, S.; Lo Piccolo, L.; Yoshida, H.; Yamaguchi, M (2018), “A new Drosophila model of Ubiquilin knockdown shows the effect of impaired proteostasis on locomotive and learning abilities”,Exp Cell Res.,362, 461–471 25 Kanner, L (1943), “Autistic disturbances of affective contact”, Nervous child,2(3), 217-250 26 Knodel, M M., Geiger, R., Ge, L., Bucher, D., Grillo, A., Wittum, G., & Queisser, G (2014), “Synaptic bouton properties are tuned to best fit the prevailing firing pattern”, Frontiers in computational neuroscience,8, 101 27 Lee, G., & Schwarz, T L (2016), “Filamin, a synaptic organizer in Drosophila, determines glutamate receptor composition and membrane growth”, Elife,5, e19991 28 Liu, X Q., Chang, S Y., Park, S Y., Nohara, T., & Yook, C S (2002), “Studies on the Constituents of the Stem Barks of Acanthopanax gracilistylus WW Smith”, Natural Product Sciences,8(1), 23-25 29 Liu, K Y., Wu, Y C., Liu, I M., Yu, W C., & Cheng, J T (2008), “Release of acetylcholine by syringin, an active principle of Eleutherococcus senticosus, to raise insulin secretion in Wistar rats”, Neuroscience Letters,434(2), 195-199 30 Loomes, R., Hull, L., & Mandy, W P L (2017), “What is the male-to-female ratio in autism spectrum disorder? A systematic review and metaanalysis”, Journal of the American Academy of Child & Adolescent Psychiatry,56(6), 466-474 31 Lu, M X., Yang, Y., Zou, Q P., Luo, J., Zhang, B B., Liu, X Q., & Hwang, E H (2018), “Anti-diabetic effects of Acankoreagenin from the leaves of Acanthopanax gracilistylus herb in RIN-m5F cells via suppression of NF-κB activation”, Molecules,23(4), 958 32 Menon, K P., Carrillo, R A., & Zinn, K (2013), “Development and plasticity of the Drosophila larval neuromuscular junction”, Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology,2(5), 647-670 33 Mizuno, H., Fujikake, N., Wada, K., & Nagai, Y (2011),“α-Synuclein transgenic Drosophila as a model of Parkinson's disease and related synucleinopathies”, Parkinson’s Disease 34 Mostofsky, S H., Goldberg, M C., Landa, R J., & Denckla, M B (2000),“Evidence for a deficit in procedural learning in children and adolescents with autism: implications for cerebellar contribution”, Journal of the International Neuropsychological Society,6(7), 752-759 35 Nichols, C D., Becnel, J., & Pandey, U B (2012), “Methods to assay Drosophila behavior”, JoVE (Journal of Visualized Experiments),(61), e3795 36 Nicolini, C., & Fahnestock, M (2018), “The valproic acid-induced rodent model of autism”, Experimental neurology,299, 217-227 37 Niu, H S., Hsu, F L., & Liu, I M (2008), “Role of sympathetic tone in the loss of syringin-induced plasma glucose lowering action in conscious Wistar rats”, Neuroscience letters,445(1), 113-116 38 Nuytens, K., Tuand, K., Di Michele, M., Boonen, K., Waelkens, E., Freson, K., & Creemers, J W (2013), “Platelets of mice heterozygous for neurobeachin, a candidate gene for autism spectrum disorder, display protein changes related to aberrant protein kinase A activity”, Molecular autism,4(1), 43 39 O'Neal, J., Gao, F., Hassan, A., Monahan, R., Barrios, S., Lee, I., & Tomasson, M H (2009), “Neurobeachin (NBEA) is a target of recurrent interstitial deletions at 13q13 in patients with MGUS and multiple myeloma”, Experimental hematology, 37(2), 234-244 40 Persico, A M., & Napolioni, V (2013), “Autism genetics”, Behavioural brain research,251, 95-112 41 Perveen, F K (2018), “Introduction to Drosophila”, Drosophila melanogaster: Model for Recent Advances in Genetics and Therapeutics,3 42 Pinato, L., Galina Spilla, C S., Markus, R P., & da Silveira Cruz-Machado, S (2019), “Dysregulation of circadian rhythms in autism spectrum disorders”, Current Pharmaceutical Design, 25(41), 4379-4393 43 Prokop, A (2016),“Fruit flies in biological research”, Biological Sciences Review, 28(2), 2-5 44 Richdale, A L., & Prior, M R (1995), “The sleep/wake rhythm in children with autism”, European child & adolescent psychiatry,4(3), 175-186 45 Shan, B E., Fu, X M., Hua, Z X., Li, Q., Liang, W., Liu, J., & Liu, G (2005), “Study on mechanism of the anti-tumor activity of Acanthopanax gracilistylus”, Chinese journal of integrated traditional and Western medicine, 25(9), 825-828 46 Shan, B E., Yoshita, Y., Sugiura, T., & Yamashita, U (1999), “Suppressive effect of Chinese medicinal herb, Acanthopanax gracilistylus, extract on human lymphocytes in vitro”, Clinical and experimental immunology,118(1), 41 47 Shan, B E., Zeki, K., Sugiura, T., Yoshida, Y., & Yamashita, U (2000), “Chinese medicinal herb, Acanthopanax gracilistylus, extract induces cell cycle arrest of human tumor cells in vitro”, Japanese journal of cancer research,91(4), 383-389 48 Simon, A F., Chou, M T., Salazar, E D., Nicholson, T., Saini, N., Metchev, S., & Krantz, D E (2012), “A simple assay to study social behavior in Drosophila: measurement of social space within a group 1”, Genes, Brain and Behavior, 11(2), 243-252 49 Song, Y Y., Li, Y., & Zhang, H Q (2010), “Therapeutic effect of syringin on adjuvant arthritis in rats and its mechanisms”, Yao xue xue bao Acta pharmaceutica Sinica,45(8), 1006-1011 50 Tian, Y., Zhang, Z C., & Han, J (2017), “Drosophila studies on autism spectrum disorders”, Neuroscience bulletin, 33(6), 737-746 51 Tordjman, S., Davlantis, K S., Georgieff, N., Geoffray, M M., Speranza, M., Anderson, G M., & Vernay-Leconte, J (2015), “Autism as a disorder of biological and behavioral rhythms: toward new therapeutic perspectives”, Frontiers in Pediatrics,3, 52 Tsuda, L., & Lim, Y M (2018),“Alzheimer’s disease model system using Drosophila”, Drosophila Models for Human Diseases, 25-40 53 Ueoka, I., Kawashima, H., Konishi, A., Aoki, M., Tanaka, R., Yoshida, H., & Yamaguchi, M (2018),“Novel Drosophila model for psychiatric disorders including autism spectrum disorder by targeting of ATP-binding cassette protein A”, Experimental neurology, 300, 51-59 54 Ueoka, I., Pham, H T N., Matsumoto, K., & Yamaguchi, M (2019), “Autism Spectrum Disorder-Related Syndromes: Modeling with Drosophila and Rodents”, International journal of molecular sciences, 20(17), 4071 55 Volders, K., Scholz, S., Slabbaert, J R., Nagel, A C., Verstreken, P., Creemers, J W., & Schwärzel, M (2012),“Drosophila rugose is a functional homolog of mammalian Neurobeachin and affects synaptic architecture, brain morphology, and associative learning”, Journal of Neuroscience,32(43), 1519315204 56 Volders, K., Nuytens, K., & WM Creemers, J (2011), “The autism candidate gene Neurobeachin encodes a scaffolding protein implicated in membrane trafficking and signaling”, Current molecular medicine,11(3), 204-217 57 Weiss, L A., Shen, Y., Korn, J M., Arking, D E., Miller, D T., Fossdal, R., & Platt, O S (2008), “Association between microdeletion and microduplication at 16p11 and autism”, New England Journal of Medicine, 358(7), 667-675 58 Wise, A., Tenezaca, L., Fernandez, R W., Schatoff, E., Flores, J., Ueda, A., & Venkatesh, T (2015), “Drosophila mutants of the autism candidate gene neurobeachin (rugose) exhibit neuro-developmental disorders, aberrant synaptic properties, altered locomotion, and impaired adult social behavior and activity patterns”, Journal of neurogenetics, 29(2-3), 135-143 59 Wiśniowiecka-Kowalnik, B., & Nowakowska, B A (2019), “Genetics and epigenetics of autism spectrum disorder—current field”, Journal of applied genetics,60(1), 37-47 evidence in the 60 Yook, C S., Liu, X Q., Chang, S Y., Park, S Y., & Nohara, T (2002), “Lupane-triterpene glycosides from the leaves of Acanthopanax gracilistylus”, Chemical and pharmaceutical bulletin, 50(10), 1383-1385 Website: 61 https://www.cdc.gov/ncbddd/autism/facts.html ... HỌC DƯỢC HÀ NỘI *** PHẠM THỊ BÍCH PHƯỢNG MÃ SINH VIÊN: 1501406 NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG SINH HỌC VÀ BƯỚC ĐẦU TÌM HIỂU CƠ CHẾ HĨA SINH CỦA NGŨ GIA BÌ HƯƠNG (Acanthopanax gracilistylus W. W .Smith). .. trên, thực đề tài: ? ?Nghiên cứu tác dụng sinh học bước đầu tìm hiểu chế hóa sinh Ngũ gia bì hương (Acanthopanax gracilistylus W. W .Smith) mơ hình ruồi giấm đột biến gen mang bệnh tự kỷ? ?? với hai mục... sau: Đánh giá tác dụng cải thiện bệnh tự kỷ cao chiết cồn Ngũ gia bì hương mơ hình ruồi giấm đột biến gen mang bệnh tự kỷ Bước đầu tìm hiểu chế hóa sinh cao chiết cồn Ngũ gia bì hương thơng qua