NGUYỄN THỊ vân ANH NGHIÊN cứu tác DỤNG KHÁNG một số VI KHUẨN NHÓM staphylococcus của các PHÂN đoạn DỊCH CHIẾT của lở LEO (cnestis palala (lour ) merr ) KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược sĩ

n BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ VÂN ANH NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG KHÁNG MỘT SỐ VI KHUẨN NHÓM Staphylococcus CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT CỦA LỞ LEO (Cnestis palala (Lour.) Merr.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2022 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ VÂN ANH Mã sinh viên: 1701023 NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG KHÁNG MỘT SỐ VI KHUẨN NHÓM Staphylococcus CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT CỦA LỞ LEO (Cnestis palala (Lour.) Merr.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Hoàng Quỳnh Hoa TS Đỗ Ngọc Quang Nơi thực hiện: Bộ môn Thực vật Bộ môn Vi sinh – sinh học HÀ NỘI – 2022 LỜI CẢM ƠN Trước trình bày nội dung nghiên cứu khóa luận mình, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới người hướng dẫn, hỗ trợ đồng hành em suốt thời gian vừa qua để em hồn thành tốt khóa luận Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn biết ơn sâu sắc tới TS Hoàng Quỳnh Hoa, TS Đỗ Ngọc Quang, TS Phạm Hà Thanh Tùng TS Nguyễn Ngọc Hiếu thầy cô trực tiếp hướng dẫn tận tình cho em Thầy ln tạo điều kiện tốt nhất, giúp đỡ động viên em suốt thời gian qua Em xin cảm ơn thầy cô anh chị kỹ thuật viên công tác Bộ môn Thực vật – Trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện giúp em hồn thành khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn tới tồn thể thầy Trường Đại học Dược Hà Nội, người thầy, người dược sĩ nhiệt huyết tận tâm mà em ngưỡng mộ, dạy dỗ em suốt năm tháng học tập trường Lời cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình bạn bè đồng hành em Đặc biệt, em xin cảm ơn chị Bùi Thị Hồng Hậu, em Đỗ Thanh Lam em Vương Ngân Hà, người tham gia nghiên cứu khoa học Bộ môn Thực vật, chia sẻ giúp đỡ em nhiều Do thời gian nghiên cứu hạn hẹp, kiến thức cịn hạn chế nên em khơng thể tránh khỏi thiếu sót q trình thực khóa luận Em kính mong nhận ý kiến góp ý q báu q thầy để đề tài khóa luận hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 22 tháng năm 2022 Sinh viên Nguyễn Thị Vân Anh MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm thực vật phân bố loài Lở leo (Cnestis palala (Lour.) Merr.) 1.2 Thành phần hóa học chi Cnestis 1.2.1 Hợp chất hydroquinon 1.2.2 Nhóm hợp chất flavonoid 1.2.3 Nhóm hợp chất coumarin 1.2.4 Nhóm hợp chất triterpen 1.2.5 Nhóm hợp chất este acid caffeic 1.2.6 Nhóm hợp chất acid amin 1.2.7 Nhóm acid béo este acid béo 1.2.8 Alcol béo 1.3 Tác dụng sinh học chi Cnestis 1.3.1 Hoạt tính kháng khuẩn 1.3.2 Tác dụng ức chế tế bào ung thư 1.3.3 Hoạt động chống oxy hóa 1.3.4 Tác dụng hạ đường huyết 1.3.5 Tác dụng giảm đau chống viêm 1.3.6 Tác dụng chống căng thẳng 10 1.3.7 Tác dụng chống trầm cảm giải tỏa lo âu 10 1.3.8 Tác dụng chống co giật 10 1.3.9 Tác dụng bảo vệ gan 11 1.3.10 Tác dụng nhuận tràng 11 1.3.11 Một số độc tính chi Cnestis 11 1.4 Kinh nghiệm sử dụng dân gian loài Cnestis palala (Lour.) Merr 12 1.5 Tổng quan đánh giá hoạt tính kháng khuẩn 12 CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Đối tượng thiết bị nghiên cứu 14 2.1.1 Đối tượng 14 2.1.2 Hóa chất thiết bị 14 2.1.3 Chủng vi khuẩn kiểm định 15 2.2 Nội dung nghiên cứu 15 2.3 Phương pháp nghiên cứu 15 2.3.1 Phương pháp chiết xuất 16 2.3.2 Phương pháp phân lập chất từ cao phân đoạn 16 2.3.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn 17 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20 3.1 Chiết xuất phân đoạn 20 3.1.1 Xử lý mẫu 20 3.1.2 Chiết xuất cao toàn phần 20 3.1.3 Chiết xuất phân đoạn 20 3.2 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn phân đoạn 20 3.3 Phân lập phân đoạn ethyl acetat theo định hướng tác dụng kháng khuẩn 21 3.3.1 Sắc ký cột hấp phụ pha thường 22 3.3.2 Sắc ký cột hấp phụ pha đảo 23 3.3.3 Sắc ký lọc gel 24 3.3.4 HPLC điều chế 24 3.4 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập từ phân đoạn Ethyl acetat 25 3.4.1 Hợp chất LLEA1.1.3.1 25 3.4.2 Hợp chất LLEA1.2.3.1 26 3.5 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn hợp chất phân lập 29 3.6 Bàn luận 30 3.6.1 Về chiết xuất phân lập 30 3.6.2 Về đánh giá hoạt tính kháng khuẩn 31 3.6.3 Về hợp chất phân lập 32 KẾT LUẬN 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon (Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy) H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (Proton Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy) DMSO Dimethyl sulphoxide EtOH Ethanol HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử nghiệm (Inhibitory Concentration at 50%) Khối lượng/ điện tích 13 IC50 m/z MBC MeOH Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (Minimal bactericidal concentration) Methanol MIC Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimal inhibitory concentration) STT Số thứ tự TLC Sắc ký lớp mỏng TLTK δ Tài liệu tham khảo Độ dịch chuyển hóa học (đơn vị ppm) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Nội dung Trang Bảng 1.1 Các hợp chất flavonoid phân lập từ loài chi Cnestis Bảng 1.2 Các hợp chất triterpen phân lập từ loài chi Cnestis Bảng 1.3 Các hợp chất este acid caffeic phân lập từ loài chi Cnestis Bảng 1.4 Các hợp chất acid béo phân lập từ loài chi Cnestis Bảng 3.1 Kết thử hoạt tính kháng khuẩn phân đoạn n-hexan, 20 cloroform, ethyl acetat n-butanol Bảng 3.2 Kết thử hoạt tính kháng khuẩn phân đoạn LLEA1 LLEA4 23 Bảng 3.3 Kết thử hoạt tính kháng khuẩn phân đoạn LLEA1.1 LLEA1.4 23 Bảng 3.4 Bảng so sánh liệu phổ 1H, 13C-NMR LLEA1.1.3.1 chất 26 đối chiếu Bảng 3.5 Bảng so sánh liệu phổ 1H, 13C-NMR LLEA1.2.3.1 chất đối chiếu 28 Bảng 3.6 Kết thử hoạt tính kháng khuẩn hợp chất phân lập 30 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình Nội dung Trang Hình 1.1 Cấu trúc hợp chất hydroquinon Hình 1.2 Cấu trúc hợp chất scopoletin Hình 1.3 Khung cấu trúc dicoumarol Hình 1.4 Khung cấu trúc 4-hydroxycoumarin Hình 1.5 Cấu trúc hợp chất L-methionine sulfoximine Hình 1.6 Cấu trúc hợp chất triacontanol Hình 2.1 Thiết kế nghiên cứu 15 Hình 3.1 Kết thử hoạt tính kháng khuẩn phân đoạn n-hexan, cloroform, ethyl acetat n-butanol 21 Hình 3.2 Sơ đồ trình phân lập cao ethyl acetat 22 Hình 3.3 Dữ liệu phổ NMR hợp chất LLEA1.1.3.1 25 Hình 3.4 Cấu trúc hợp chất LLEA1.1.3.1 26 Hình 3.5 Dữ liệu phổ NMR hợp chất LLEA1.2.3.1 27 Hình 3.6 Cấu trúc hợp chất LLEA1.2.3.1 29 ĐẶT VẤN ĐỀ Lở leo tên địa phương cây Dây khế (Dây trường khế), loài thuộc họ Connaraceae, phân bố nhiều khu vực núi đá vôi miền Bắc Việt Nam Theo kinh nghiệm dân gian đồng bào Mường Long Sơn (Hồ Bình), Lở leo sử dụng để chữa bệnh da, tiểu vàng, tiêu chảy chữa chứng nóng người Theo nghiên cứu điều tra thực vật dân tộc học, Lở leo (Cnestis palala (Lour.) Merr.) ghi nhận có phận dùng chủ yếu phần mặt đất (thân lá) cách sử dụng phổ biến dạng nước sắc dùng đường uống dùng ngoài, riêng Lở leo phối hợp với dược liệu khác [5] Với định hướng nghiên cứu tác dụng kháng vi sinh vật, cao chiết thân Lở leo đánh giá tác dụng số chủng vi khuẩn vi nấm Kết cho thấy cao ethanol thân Lở leo có tác dụng ức chế số chủng vi khuẩn gram dương Staphylococcus aureus Bacillus subtilis [3] Các bệnh nhiễm khuẩn ngồi da thường có nguyên nhân từ hai nhóm Staphylococcus Streptococcus [1] Trong khn khổ khóa luận tốt nghiệp, đề tài tập trung vào nhóm tụ cầu Staphylococcus Để làm rõ thành phần hố học Lở leo có tác dụng số chủng Staphylococcus, đề tài thực với mục tiêu sau: - Chiết xuất phân lập hợp chất dựa theo định hướng tác dụng kháng số vi khuẩn nhóm Staphylococcus dịch chiết phân đoạn từ thân - Lở leo Xác định giá trị nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) nồng độ ức chế 50% vi khuẩn (IC50) hợp chất phân lập NỘI DUNG CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm thực vật phân bố loài Lở leo (Cnestis palala (Lour.) Merr.) Lở leo bụi nhỏ, sau lớn phát triển thành dây leo nhờ thân quấn, cao 2-10 m, thân non phủ lông mịn, màu trắng Lá kép lông chim lẻ lần, dài 20-30 cm, gồm 5-15 cặp chét mọc đối Cuống chét dài 1-2 mm, phủ đầy lông ngắn màu xám nâu Lá chét hình bầu dục, dài 2-5 cm, rộng 0,5-1 cm; mặt màu xanh nhạt, mặt màu xanh đậm; mặt phủ lông ngắn, màu xám nâu, mặt nhiều lơng mặt trên; gốc trịn hình tim, tù ngọn, mép nguyên Gân kiểu lông chim rõ mặt dưới, gân phụ 8-10 đôi hợp với gần mép lá, bề mặt gân phủ lông ngắn, màu xám nâu dày đặc [3], [2] Cụm hoa chùm kép, dài 4-6 cm, mọc từ nách Hoa nhỏ, đều, lưỡng tính, mẫu 5, đường kính khoảng 0,2-1,0 cm Cuống hoa hình trụ, cuống dài 1-2 cm, có lơng trắng mịn bao phủ, nối với đài hoa khớp nối dài 0-3 mm Lá bắc nhỏ, hình tam giác, dài 0,51 mm, rộng 0,1-0,3 mm, màu xanh, có lơng trắng mịn phủ mặt ngồi Đài 5, hình bầu dục kích thước khoảng x 0,5 mm, màu vàng xanh, có lơng trắng phủ kín mặt Tràng 5, hình bầu dục, kích thước khoảng 3x1 mm, màu trắng, bề mặt nhẵn, Nhị 10, đều, rời, dài 0,5-1 mm, nhị trắng, dài mang bao phấn hai kích thước 0,2x0,3 mm, đính gốc Nhụy 5, rời, nhụy dài 0,5-1 mm, nhiều lơng bao quanh bầu nhụy, vịi nhụy đỉnh bầu nhụy [3], [2] Loài Cnestis palala (Lour.) Merr phát triển khu rừng nhiệt đới, phân bố nhiều quốc gia châu Á phía nam Trung Quốc, Myanmar, Thái Lan, Campuchia, Lào, Việt Nam, Malaysia, Indonesia, Philippines [38] Tại Việt Nam, Lở leo tìm thấy miền bắc miền trung Việt Nam Hịa Bình, Thanh Hóa [42] 1.2 Thành phần hóa học chi Cnestis Thành phần hóa học chi Cnestis nghiên cứu chủ yếu loài C ferruginea Vahl ex DC Nghiên cứu thành phần hóa học lồi C palala (Lour.) Merr lồi khác cịn hạn chế 1.2.1 Hợp chất hydroquinon Hydroquinon tìm thấy hai lồi C ferruginea C palala nhiều nghiên cứu [12], [30], [7] Từ C palala, Dej-adisai cộng phân lập hợp chất hydroquinon có tác dụng kháng lại vi khuẩn S aureus S epidermidis mạnh mẽ với MIC 30,10 μg/ml; 15,05 μg/ml MBC 15 μg/ml; 7,5 μg/ml [12] Đối chứng dương 256 128 (Streptomycin) Nhận xét: Giá trị MIC mẫu LLEA1.1 – 1.4 nhỏ MIC chứng dương S epidermidis có phân đoạn LLEA1.3 có MIC với chứng dương thử với S aureus Tuy nhiên, lượng mẫu thu có phân đoạn LLEA1.1 LLEA1.2 đủ để thực phân lập tiếp điều kiện thực nghiệm đề tài Do đó, hai phân đoạn lựa chọn để thực tiếp trình phân lập định hướng thử tiếp chủng S epidermidis 3.3.3 Sắc ký lọc gel Phân đoạn LLEA1.1 chuyển vào cột triển khai sắc ký lọc gel với chất nhồi cột sephadex LH-20 dung mơi rửa giải MeOH Q trình triển khai theo dõi TLC, phân đoạn có sắc lý đồ tương tự gộp chung, thu phân đoạn ký hiệu LLEA1.1.1 - LLEA1.1.5 Cô thu hồi dung môi thu cao phân đoạn với khối lượng LLEA1.1.1 (34,6 mg), LLEA1.1.2 (33,0 mg), LLEA1.1.3 (85,3 mg), LLEA1.1.4 (37,0 mg) LLEA1.1.5 (146,6 mg) Tương tự, phân lập phân đoạn LLEA1.2 thu phân đoạn ký hiệu LLEA1.2.1 ÷ LLEA1.2.6 với khối lượng LLEA1.2.1 (18,3 mg), LLEA1.2.2 (165,7 mg), LLEA1.2.3 (198,3 mg), LLEA1.2.4 (81,8 mg), LLEA1.2.5 (95,0 mg) LLEA 1.2.6 (52,3 mg) Do hạn chế thời gian thực nên nhóm nghiên cứu chưa thể tiến hành thử hoạt tính kháng khuẩn 11 mẫu Việc lựa chọn phân đoạn để phân lập tiếp dựa vào khối lượng sắc ký đồ HPLC Các phân đoạn có khả phân lập tiếp LLEA1.1.3, LLEA1.1.5, LLEA1.2.3 Trong khn khổ khóa luận tốt nghiệp, lựa chọn hai phân đoạn LLEA1.1.3 LLEA1.2.3 để phân lập tiếp Các hợp chất phân lập thử hoạt tính kháng khuẩn 3.3.4 HPLC điều chế Hai phân đoạn LLEA1.1.3 LLEA1.2.3 phân lập tiếp phương pháp HPLC điều chế Với phân đoạn LLEA1.1.3, pha động sử dụng 9% acetonitrile nước chứa 0,1% acid formic, thu hợp chất LLEA1.1.3.1 (18,5 mg) tR:12,0 phút Pha động sử dụng để phân lập phân đoạn LLEA1.2.3 19% acetonitrile nước chứa 0,1% acid formic, thu hợp chất LLEA1.2.3.1 (32,4 mg) tR:16,0 phút Hai hợp chất tiến hành đo phổ MS, phổ 1H-NMR phổ 13C-NMR để xác định cấu trúc 24 3.4 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập từ phân đoạn ethyl acetat 3.4.1 Hợp chất LLEA1.1.3.1 Hợp chất LLEA1.1.3.1 thu có màu trắng Phổ khối ESI-MS cho peak ion phân tử m/z [M - H]- = 153,0186, gợi ý LLEA1.1.3.1 có cơng thức phân tử C7H6O4 (M = 154) Phổ 13C-NMR cho tín hiệu khoảng 115,8-151,4 ppm diện vịng thơm Tín hiệu 170,5 ppm carbon nhóm carbonyl Phổ 1H-NMR diện proton có tín hiệu khoảng 6,83-7,46 ppm theo hệ spin ABX với số ghép cặp J2,6 = Hz J5,6 = Hz Ngồi tín hiệu 146,0 ppm 151,4 ppm cho thấy đây hai tín hiệu carbon thơm gắn với nhóm chức hydroxyl Dữ liệu phổ NMR hợp chất LLEA1.1.3.1 trình bày hình 3.3 Hình 3.3 Dữ liệu phổ NMR hợp chất LLEA1.1.3.1 Kết so sánh liệu phổ LLEA1.1.3.1 chất đối chiếu thể bảng 3.4 25 Bảng 3.4 Bảng so sánh liệu phổ 1H, 13C-NMR LLEA1.1.3.1 chất đối chiếu Vị trí Hợp chất LLEA1.1.3.1 Hợp chất 3,4-dihydroxybenzoic acid [40] δC (ppm) δH (ppm) δC (ppm) δH (ppm) 123,4 123,3 117,8 146,0 146,2 151,4 151,7 123,9 6,83, d, J = Hz 124,0 6,79, d, J = Hz 115,8 7,44, dd, J = 2; Hz 115,9 7,42, dd, J = 2; Hz -COO- 170,5 7,46, d, J = Hz 117,9 7,44, d, J = Hz 170,4 Trên sở số liệu phổ NMR, MS kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo [40], hợp chất LLEA1.1.3.1 xác định 3,4-dihydroxybenzoic acid cịn gọi protocatechuic acid, có cấu trúc hình 3.4 Hình 3.4 Cấu trúc hợp chất LLEA1.1.3.1 3.4.2 Hợp chất LLEA1.2.3.1 Hợp chất LLEA1.2.3.1 thu có màu trắng Phổ khối ESI-MS cho peak ion phân tử m/z [M - H]- = 451,1035, gợi ý LLEA1.2.3.1 có công thức phân tử C24H20O9 (M = 452) Phổ 1H-NMR hợp chất cho thấy diện hai hệ spin ABX, bao gồm tín hiệu δH 7,02 (d, J = 1,9 Hz), 6,83 (d, J = 8,0 Hz), 6,81 (dd, J = 1,9; 8,0 Hz) 6,58 (d, J = 2,0 Hz), 6,49 (d; J = 8,0 Hz), 6,67 (dd, J = 2,0; 8,0 Hz) Đồng thời cịn có tín hiệu singlet δH 6,26 Ngồi cịn có ba tín hiệu proton khoảng δH 3,0-4,5 proton vùng nối vòng thơm Phổ 13C-NMR cho thấy diện 24 tin hiệu, có tín hiệu δC 170,8 (tương ứng với nhóm carbonyl loại este), 12 tín hiệu nằm vùng thơm (100-150 ppm, tương ứng với ba vịng benzen), hai tín hiệu carbon gắn oxy, ba tín hiệu khoảng 30-45 ppm Phân tích tổng hợp phổ proton carbon cho phép dự đoán khung cấu 26 trúc phenolic có nhiều nhóm chức hydroxyl Tín hiệu carbon δC 79,7 đặc trưng cho C-2 khung nhóm flavonoid (carbon gắn oxy kết nối với vòng benzen) Kết hợp với khối phổ số lượng carbon (24) cho phép dự đoán đây dẫn xuất kết hợp flavanol đơn vị phenylpropanoid Từ công thức phân tử C24H20O9, xác định hệ số bất bão hòa 15 Sau loại trừ ba nhân thơm (hệ số bất bão hòa 12), vòng C nhân flavanol, liên kết đơi nhóm carbonyl, suy đốn diện vịng nữa, lacton Từ suy đoán trên, kết hợp với việc tìm kiếm liệu phổ tài liệu tham khảo, hợp chất LLEA1.2.3.1 xác định 2,10-bis(3,4dihydroxyphenyl)-3,5-dihydroxy-3,4,9,10-tetrahydro-2H,8H-pyrano[2,3-f]chromen8-on, có cấu trúc phẳng giống với cinchonain Ia Ib [35] Dữ liệu phổ NMR hợp chất LLEA1.1.3.1 trình bày hình 3.5 Hình 3.5 Dữ liệu phổ NMR hợp chất LLEA1.2.3.1 Kết so sánh liệu phổ LLEA1.2.3.1 chất đối chiếu thể bảng 3.5 27 Bảng 3.5 Bảng so sánh liệu phổ 1H, 13C-NMR LLEA1.2.3.1 chất đối chiếu Vị trí Hợp chất Hợp chất cinchonain Ia Hợp chất cinchonain Ib LLEA1.2.3.1 δCa δHa (ppm) (ppm) [35] δCb δHb [35] (ppm) (ppm) δCb δHb (ppm) (ppm) 79,7 4,87 (overlap) 79,0 4,89 (s) 79,4 4,99 (s) 65,8 4,30 (m) 65,8 4,30 (m) 66,0 4,26 (m) 28,9 2,92, dd, J = 5,6; 16 Hz 28,9 2,90 (m) 28,8 2,90 (m) 2,97, dd, J = 7,3; 16 Hz 157,3 156,2 96,3 152,1 151,2 151,2 106,0 105,2 105,4 4a 105,2 104,5 104,7 8a 153,4 152,5 152,6 1' 131,9 131,2 131,0 2' 115,0 3' 145,1 144,1 144,3 4' 145,7 144,7 144,8 5' 115,1 6,83, d, J = Hz 114,4 6,84, d, J = Hz 114,8 6,72, d, J = Hz 6' 119,2 6,81, dd, J = 1,9; Hz 118,4 6,72, dd, J = 2; Hz 118,7 6,64, dd, J = 2; Hz 1'' 135,4 2'' 116,0 3'' 146,0 145,0 144,9 4'' 146,3 145,4 145,5 5'' 116,5 6,26 (s) 7,02, d, J = 1,9 Hz 156,2 95,8 6,24 (s) 114,4 7,08, d, J = Hz 134,5 6,58, d, J = Hz 6,49, d; J = 8,3 Hz 96,0 114,5 6,24 (s) 6,93, d, J = Hz 134,4 115,4 6,59, d, J = Hz 115,8 6,46, dd, J = 2; Hz 28 115,3 115,9 6,68, d, J = Hz 6,58, dd, J = 2; Hz 6'' 119,2 6,67, dd, J = 2; 118,4 6,64, d; J = 8 Hz α 38,5 β 35,4 -COO- 170,8 2,89, dd; J = 2; 15 Hz 6,74, d, J = Hz 38,0 2,85, dd; J = 2; 16 Hz 3,11, dd; J = 6; 3,12, dd; J = 15 Hz 6; 16 Hz 4,60, dd, J = 2; Hz 118,5 34,5 4,54, dd, J = 2; Hz 168,9 Hz 37,6 2,72 – 3,18 (m) 34,2 4, 47, dd, J = 2; Hz 168,9 Chú thích: ađo methanol, bđo aceton/nước (s) – singlet, (m) - multiplet Tuy nhiên với liệu chưa thể khẳng định cấu hình tuyệt đối hợp chất Lý liệu phổ đo cinchonain Ia Ib dung môi aceton/nước, khác với hợp chất LLEA1.2.3.1 đo methanol Khi đo methanol, tín hiệu H-2 bị trùng với tín hiệu 4,8 dung mơi NMR, khơng thể xác định số ghép cặp proton này, từ chưa thể xác định cấu hình tương đối C-2 C-3 Đối với C-β, khác độ chuyển dịch hóa học C-β cinchonain Ia Ib khơng rõ ràng Do với liệu phổ NMR chưa xác định cấu hình tuyệt đối LLEA1.2.3.1 Cấu trúc hợp chất LLEA1.2.3.1 thể hình 3.6 Hình 3.6 Cấu trúc hợp chất LLEA1.2.3.1 3.5 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn hợp chất phân lập Kết thử hoạt tính kháng khuẩn hai hợp chất phân lập phương pháp pha loãng nồng độ trình bày bảng 3.6 29 Bảng 3.6 Kết thử hoạt tính kháng khuẩn hợp chất phân lập Tên mẫu S aureus S epidermidis ATCC25923 ATCC12228 Sai số MIC(µg/ml) LLEA1.1.3.1 128 16 LLEA1.2.3.1 128 16 Đối chứng dương (Streptomycin) 256 128 IC50(µg/ml) LLEA1.1.3.1 46,78 5,67 ±1,36 LLEA1.2.3.1 43,23 6,34 ±2,45 Đối chứng dương (Streptomycin) 65,67 43,45 ±1,35 Nhận xét: Hai hợp chất phân lập có khả ức chế phát triển hai chủng vi khuẩn S aureus S epidermidis Trong thử nghiệm, MIC hai chất chủng S epidermidis 16 µg/ml, IC50 LLEA1.1.3.1 LLEA1.2.3.1 5,67 6,34 µg/ml Hoạt động ức chế phát triển chủng S aureus yếu so với chủng S epidermidis, với MIC hai chất 128 µg/ml, IC50 LLEA1.1.3.1 LLEA1.2.3.1 46,78 43,23 µg/ml 3.6 Bàn luận 3.6.1 Về chiết xuất phân lập Về chiết xuất Phương pháp dùng để chiết dược liệu đun hồi lưu với dung môi EtOH 75%, lần chiết thời gian nhiệt độ 80oC Mỗi mẻ được chiết lần giúp tăng hiệu suất chiết Các ưu điểm phương pháp chiết xuất là: cách tiến hành dụng cụ đơn giản; phù hợp với tính chất dễ bay dung mơi EtOH 75%; có tác động yếu tố nhiệt độ q trình chiết, nhờ làm tăng tốc độ, khả hòa tan nhiều loại hợp chất, tăng hiệu suất chiết rút ngắn thời gian chiết Tuy nhiên, phương pháp có số nhược điểm như: nhiệt độ ảnh hưởng đến số hợp chất bền với nhiệt; q trình chiết khơng khuấy trộn, làm giảm tiếp xúc dược liệu dung môi, hạn chế khuếch tán hợp chất từ dược liệu vào dung mơi, làm giảm hiệu suất chiết 30 Cao toàn phần chiết phân bố lỏng-lỏng với dung mơi có độ phân cực tăng dần Để chiết phân bố lỏng-lỏng, cần hòa tan cao toàn phần vào nước để làm pha Tuy nhiên, thực nghiệm cao cồn khó hịa tan nước, nên hịa tan trước lượng EtOH tối thiểu, sau bổ sung nước Phương pháp chiết phân bố lỏng-lỏng với dung môi hữu áp dụng phổ biến nghiên cứu với ưu điểm thao tác dụng cụ đơn giản Nhược điểm phương pháp sử dụng lượng lớn dung môi hữu độc hại, hiệu suất thấp, quy trình gồm nhiều bước, khó nâng cấp quy mô Về phân lập Sử dụng phương pháp sắc ký cột cổ điển, sắc ký lọc gel đơn giản, dễ tiến hành, phù hợp với quy mơ phịng thí nghiệm Phương pháp HPLC điều chế sử dụng, đây phương pháp đại hữu hiệu để phân lập chất Tuy nhiên, nhược điểm phương pháp chi phí cao, thiết bị chưa phổ biến Quá trình phân lập dựa theo định hướng tác dụng kháng khuẩn, tăng xác suất tìm hợp chất đóng vai trị quan trọng tác dụng sinh học dược liệu Đối với loài Cnestis palala (Lour.) Merr., đây nghiên cứu tiến hành phân lập hợp chất theo định hướng tác dụng khuẩn Bên cạnh đó, việc phân đoạn trung gian đánh giá tác dụng kháng khuẩn vai trị để định hướng cho q trình phân lập, cịn có ý nghĩa việc sử dụng cao phân đoạn có tác dụng kháng khuẩn tốt để làm nguyên liệu cho nghiên cứu phát triển sản phẩm, tiết kiệm chi phí nghiên cứu phân lập đến chất tinh khiết cao phân đoạn đáp ứng tốt yêu cầu tác dụng sinh học bào chế Ví dụ phân đoạn LLEA1.3 cho tác dụng tốt chủng S aureus S epidermidis so sánh với phân đoạn khác, lượng chất không đủ để phân lập tiếp chất tinh khiết, tiến hành nghiên cứu chuẩn hố phương pháp bào chế cao phân đoạn để phục vụ cho nghiên cứu phát triển thuốc từ nguyên liệu đầu vào cao phân đoạn 3.6.2 Về đánh giá hoạt tính kháng khuẩn Nghiên cứu sử dụng phương pháp khuếch tán đĩa thạch pha loãng nồng độ để nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn mẫu Phương pháp khuếch tán đĩa thạch áp dụng với mẫu cao phân đoạn từ cao tồn phần Phương pháp pha lỗng nồng độ áp dụng với mẫu cao phân đoạn nhỏ hợp chất tinh khiết phân lập Phương pháp khuếch tán đĩa thạch phương pháp đơn giản dễ thực với mẫu nghiên cứu có khối lượng phù hợp khơng q nhỏ Trong khn khổ đề tài, 31 phân đoạn chiết ban đầu có khối lượng dao động từ khoảng 0,9 g đến 8,2 g, tiến hành thử với lượng tối thiểu mẫu khơng ảnh hưởng nhiều tới lượng mẫu để tiến hành phân lập Do đó, việc áp dụng phương pháp khuếch tán đĩa thạch giai đoạn sàng lọc tác dụng phân đoạn ban đầu hợp lý Phương pháp pha loãng nồng độ thường áp dụng trường hợp mẫu nghiên cứu có khối lượng nhỏ Trong bước phân lập từ cao chiết phân đoạn ethyl acetat, trình phân lập sau phân đoạn tinh có khối lượng giảm dần Để tiến hành sàng lọc mà không ảnh hưởng lớn tới lượng tối thiểu mà phân đoạn phân lập được, cần thực sàng lọc phương pháp pha loãng nồng độ Bằng phương pháp này, đề tài thực việc đánh giá tác dụng phân đoạn giai đoạn phân lập, làm sở cho việc phân lập theo định hướng tác dụng kháng khuẩn với mục tiêu đề tài Đối với chất tinh khiết phân lập được, nhờ có phương pháp đánh giá sàng lọc tác dụng trình phân lập mà hướng tác dụng chủng vi khuẩn thử đánh giá hiệu Ngoài ra, phương pháp pha loãng nồng độ cho phép xác định giá trị IC50 chất phân lập 3.6.3 Về hợp chất phân lập Đây nghiên cứu phân lập hai hợp chất 3,4-dihydroxybenzoic acid 2,10-bis(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5-dihydroxy-3,4,9,10-tetrahydro-2H,8H-pyrano[2,3f]chromen-8-on từ loài Cnestis palala (Lour.) Merr chi Cnestis Hợp chất LLEA1.1.3.1 phân lập xác định 3,4-dihydroxybenzoic acid, hay gọi protocatechuic acid Trong nghiên cứu Nova Syafni cộng sự, hợp chất phân lập từ loài Trichomanes chinense L cho tác dụng kháng khuẩn chủng Escherichia coli, S aureus, Vibrio cholera, Salmonella typhimurium với kích thước vùng ức chế 5,5 mm, mm, 5,5 mm, 10 mm [40] Hợp chất phân loại từ loài Aralia elata chứng minh có tác dụng kháng khuẩn [32] Cơ chế hoạt động kháng khuẩn nhóm hợp chất phenol là: gây thiếu hụt chất nền, tạo phức ion kim loại, phá vỡ màng tế bào, liên kết với chất kết dính, tạo phức với thành tế bào, ức chế enzym [41] Hợp chất LLEA1.2.3.1 phân lập xác định 2,10-bis(3,4-dihydroxyphenyl)3,5-dihydroxy-3,4,9,10-tetrahydro-2H,8H-pyrano[2,3-f]chromen-8-on, nhiên chưa thể chưa thể khẳng định cấu hình tuyệt đối hợp chất với liệu Để xác định phải cần thêm liệu phổ CD Về hoạt tính kháng khuẩn hợp chất này, LLEA1.2.3.1 có khung cấu trúc flavan, hoạt động kháng khuẩn hợp chất có khung 32 cấu trúc cho nhờ khả liên kết với chất kết dính, tạo phức với thành tế bào, ức chế enzym [41] Để đánh giá mức độ kháng khuẩn, điểm cắt kháng khuẩn hợp chất tinh khiết định nghĩa sau: hoạt tính cao có MIC µg/ml (hoặc 2,5 µM); hoạt tính đáng kể có MIC khoảng ≤ MIC ≤ 10 µg/ml (hoặc 2,5 ≤ MIC ≤ 25 µM); hoạt tính trung bình có MIC khoảng 10 < MIC ≤ 100 µg/ml (hoặc 25 ≤ MIC ≤ 250 µM), hoạt tính yếu có MIC khoảng 100 < MIC ≤ 1000 µg/ml (hoặc 250 ≤ MIC ≤ 2500 µM) khơng có hoạt tính có MIC > 1000 µg/ml (hoặc > 2500 µM) [41] Dựa theo cách đánh giá này, hai hợp chất phân lập có hoạt tính trung bình với chủng S epidermidis (MIC 16 µg/ml) hoạt tính yếu với chủng S aureus (MIC 128 µg/ml) S aureus S epidermidis tụ cầu ký sinh da niêm mạc, xâm nhập qua vết thương lỗ chân lông gây bệnh da liễu: nhọt, đầu đinh, áp xe, bệnh eczema,… [1] Như vậy, kết hoạt tính kháng khuẩn hợp chất phân lập từ dịch chiết Lở leo chứng minh công dụng thuốc thuốc chữa bệnh da sử dụng theo kinh nghiệm dân gian người dân Hịa Bình 33 KẾT LUẬN Sau q trình thực hiện, đề tài hồn thành mục tiêu ban đầu đề thu số kết luận sau: Từ thân Lở leo, kỹ thuật chiết xuất, phân lập theo định hướng sàng lọc tác dụng kháng khuẩn, phân lập hai hợp chất tinh khiết 3,4dihydroxybenzoic acid (hợp chất 1) 2,10-bis(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5dihydroxy-3,4,9,10-tetrahydro-2H,8H-pyrano[2,3-f]chromen-8-on (hợp chất 2) Đối với S aureus S epidermidis, hợp chất có giá trị MIC 128 µg/ml 16 µg/ml IC50 46,78 ± 1,36 µg/ml 5,67 ± 1,36 µg/ml; hợp chất có giá trị MIC 128 µg/ml 16 µg/ml IC50 43,23 ± 2,45 µg/ml 6,34 ± 2,45 µg/ml - ĐỀ XUẤT Đánh giá thêm tác dụng chất phân lập số chủng vi sinh vật khác - Đánh giá tác dụng phối hợp hiệp đồng phân đoạn chất phân lập với số kháng sinh chủng vi khuẩn kháng kháng sinh 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Trần Định Công, Kiều Khắc Đôn cộng (2007), Vi sinh vật học, Trung tâm Thông tin – Thư viện Đại Học Dược Hà Nội, Hà Nội, tr 190, 192, 242, 243 Phạm Hoàng Hộ (2003), Cây cỏ Việt Nam, 1, Nhà xuất Trẻ, tr 756-757 Hoàng Quỳnh Hoa, Đỗ Ngọc Quang cộng (2021), "Đặc điểm thực vật tác dụng kháng vi sinh vật Dây khế (Cnestis palala (Lour.) Merr.)", Nghiên cứu Dược & Thông tin thuốc, 12(3), tr 52-60 Nguyễn Thị Kim Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, NXB Đại học quốc gia TP.Hồ Chí Minh, tr 151-201, 212-253, 323-355, 409-454 Lê Thị Thu Thuỷ (2008), Điều tra thuốc chữa bệnh da xã Long Sơn, huyện Kim Bơi, tỉnh Hồ Bình, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội Tiếng Anh Adisa R A., Choudhary M I., et al (2010), "Hypoglycaemic and biochemical properties of Cnestis ferruginea", Afr J Tradit Complement Altern Med, 7(3), pp 185-94 Adisa R A., Olorunsogo O O (2013), "Robustaside B and para‑hydroxyphenol: phenolic and antioxidant compounds purified from Cnestis ferruginea D.C induced membrane permeability transition in rat liver mitochondria", Mol Med Rep, 8(5), pp 1493-8 Adisa RA, Abass-Khan A, et al (2011), "Purification and characterization of phenolic compounds from the leaves of Cnestis ferruginea (De Candolle): Investigation of antioxidant property", Res J Phytochem, 5, pp 177-189 Akharaiyi FC, Boboye BE, et al (2012), "Hepatoprotective effect of ethanol leaf extract of Cnestis ferruginea on Swiss albino mice induced with paracetamol", International Research Journal of Pharmaceuticals (IRJP), 2(4), pp 120-126 10 Basil Nita (2017), "Antioxidant activity of Cnestis ferruginea and Uvaria chamae seed extracts", British Journal of Pharmaceutical Research, 16(1), pp 1-8 11 Bonev B., Hooper J., et al (2008), "Principles of assessing bacterial susceptibility to antibiotics using the agar diffusion method", J Antimicrob Chemother, 61(6), pp 1295-301 12 Dej-adisai Sukanya, Tinpun Kittiya, et al (2015), "Bio-activities and phytochemical investigation of Cnestis palala (Lour.) Merr", African Journal of Traditional, Complementary and Alternative Medicines, 12(3), pp 27-37 13 Dickert H, Machka K, et al (1981), "The uses and limitations of disc diffusion in the antibiotic sensitivity testing of bacteria", Infection, 9(1), pp 18-24 14 Enemor EC, Ngwoke KG, et al (2015), "Phytochemical analysis and antimicrobial activity of ethanolic stem extracts of Cnestis ferruginea on multidrug resistant bacteria isolated from raw retail meat sold in Awka, Nigeria", Journal of Pharmaceutical Sciences and Research, 7(11), pp 1044 15 Fitmawati, Nery sofiyanti, et al (2017), "Traditional medicinal formulation: obat pahit from Lingga Malay ethnic in Riau Archipelago, Indonesia", Biodiversitas Journal of Biological Diversity, 18(3), pp 1196-1200 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 Franklin R Cockerill, Matthew A Wikler, et al (2012), "Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard - Ninth Edition", Clinical and Laboratory Standards Institude, 32(2), pp 13-19 Garon D., Chosson E., et al (2007), "Poisoning by Cnestis ferruginea in Casamance (Senegal): an etiological approach", Toxicon, 50(2), pp 189-95 Hadacek Franz, Greger Harald (2000), "Testing of antifungal natural products: methodologies, comparability of results and assay choice", An International Journal of Plant Chemical Biochemical Techniques, 11(3), pp 137-147 Ibironke G F., Odewole G A (2012), "Analgesic and anti-inflammatory properties of methanol extract of Cnestis ferruginea in rodents", Afr J Med Med Sci, 41(2), pp 205-10 Ishola I O., Agbaje O E., et al (2012), "Bioactivity guided isolation of analgesic and anti-inflammatory constituents of Cnestis ferruginea Vahl ex DC (Connaraceae) root", J Ethnopharmacol, 142(2), pp 383-9 Ishola I O., Akindele A J., et al (2011), "Analgesic and anti-inflammatory activities of Cnestis ferruginea Vahl ex DC (Connaraceae) methanolic root extract", J Ethnopharmacol, 135(1), pp 55-62 Ishola IO, Ashorobi (2007), "Anti-stress potential of aqueous root extract of Cnestis ferruginea", Int J Pharmacol, 3(3), pp 295-8 Ishola Ismail O, Agbaje Oluwatoyin E, et al (2012), "Bioactivity guided isolation of analgesic and anti-inflammatory constituents of Cnestis ferruginea Vahl ex DC (Connaraceae) root", 142(2), pp 383-389 Ishola Ismail O, Akindele Abidemi J, et al (2014), "Anticonvulsant effect of methanolic extract and isolation of active constituents from Cnestis ferruginea Vahl ex DC (Connaraceae)", West Afr J Pharm, 25, pp 9-19 Ishola Ismail O, Chatterjee Manavi, et al (2012), "Antidepressant and anxiolytic effects of amentoflavone isolated from Cnestis ferruginea in mice", Pharmacology Biochemistry and Behavior, 103(2), pp 322-331 Jeannoda V L., Creppy E E., et al (1984), "Isolation and partial characterization of glabrin, a neurotoxin from Cnestis glabra (Connaraceae) root barks", Biochimie, 66(7-8), pp 557-62 Jeannoda V L., Rakoto-Ranoromalala D A., et al (1985), "Natural occurrence of methionine sulfoximine in the Connaraceae family", J Ethnopharmacol, 14(1), pp 11-7 Jiang Lin (2011), "Comparison of disk diffusion, agar dilution, and broth microdiultion for antimicrobial susceptibility testing of five chitosans" Klancnik Anja, Piskernik Saša, et al (2010), "Evaluation of diffusion and dilution methods to determine the antibacterial activity of plant extracts", Journal of microbiological methods, 81(2), pp 121-126 Kouakou K., Panda S K., et al (2019), "Isolation of Antimicrobial Compounds From Cnestis ferruginea Vahl ex DC (Connaraceae) Leaves Through BioassayGuided Fractionation", Front Microbiol, 10, pp 705 Lar M.S.M (2014), "Phytochemical analysis of Cnestis palala (Lour.) Merr and its antimicrobial activity", Universities Research Journal, 6(1), pp 161-172 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 Ma Seung-Jin, Ko Byoung-Seub, et al (1995), "Isolation of 3, 4-dihydroxybenzoic acid with antimicrobial activity from bark of Aralia elata", Korean Journal of Food Science and Technology, 27(5), pp 807-812 Murakoshi I., Sekine T., et al (1993), "Absolute configuration of L-methionine sulfoximine as a toxic principle in Cnestis palala (Lour.) Merr", Chem Pharm Bull (Tokyo), 41(2), pp 388-90 Nodza George Isaac, Onuminya Temitope Olabisi, et al (2020), "Ethnobotanical survey of medicinal plants used in treating snakebites in Benue, Nigeria", 23(2), pp 147-158 Nonaka Genichiro, Nishioka Itsuo, et al (1981), "Tannins and related compounds I Rhubarb (1)", Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 29(10), pp 2862-2870 Olayemi F O., Raji Y (2011), "Quinolizidine alkaloids: the bioactive principles in Cnestis ferruginea (de Candolle) with male antifertility activities", Afr J Med Med Sci, 40(3), pp 253-63 Olugbade TA, Oluwadiya JO, et al (1982), "Chemical constituents of Cnestis ferruginea DC I Petroleum ether fraction", Journal of Ethnopharmacology, 6(3), pp 365-370 Paim Luís Fernando Nunes Alves, Toledo Cássio Augusto Patrocínio, et al (2020), "Connaraceae: An updated overview of research and the pharmacological potential of 39 species", Journal of ethnopharmacology, 261, pp 112980 Parvez M, Rahman A (1992), "A novel antimicrobial isoflavone galctoside from Cnestis ferruginea (Connaraceae)", Journal of the Chemical Society of Pakistan, 14(3), pp 221-223 Syafni Nova, Putra Deddi Prima, et al (2012), "3, 4-dihydroxybenzoic acid and 3, 4-dihydroxybenzaldehyde from the fern Trichomanes chinense L.; isolation, antimicrobial and antioxidant properties", Indonesian Journal of Chemistry, 12(3), pp 273-278 Tamokou JDD, Mbaveng AT, et al (2017), "Antimicrobial activities of African medicinal spices and vegetables", Medicinal spices and vegetables from Africa, Elsevier, pp 207-237 Van Sam Hoang, Baas Pieter, et al (2008), "Traditional medicinal plants in Ben En national park, Vietnam", 53(3), pp 569-601 Vickery Margaret, Vickery Brian (1980), "Coumarins and related compounds in members of the Connaraceae", Toxicology Letters, 5(2), pp 115-118 Wiart Christophe (2006), Medicinal plants of Asia and the Pacific, CRC press, pp 240-243 Wilkins Tracy D, Thiel Teresa (1973), "Modified broth-disk method for testing the antibiotic susceptibility of anaerobic bacteria", Antimicrobial agents chemotherapy, 3(3), pp 350-356 Yakubu MT, Adams DM, et al (2011), "Laxative activity of aqueous root extract of Cnestis ferruginea (VAHL EX DC) in loperamide-induced constipated rats", Nigerian Journal of Gastroenterology and Hepatology, 3(1-2), pp 21-29 PHỤ LỤC Phụ lục Giấy giám định tên khoa học ... HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ VÂN ANH Mã sinh vi? ?n: 1701023 NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG KHÁNG MỘT SỐ VI KHUẨN NHÓM Staphylococcus CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT CỦA LỞ LEO (Cnestis palala (Lour. ) Merr .) KHÓA... 1.3 Tác dụng sinh học chi Cnestis 1.3.1 Hoạt tính kháng khuẩn Một nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn C palala Dej-adisai cộng cho thấy: Các cao ethanol lá, thân vỏ thân C palala có tác dụng kháng khuẩn. .. Quang cộng (202 1), "Đặc điểm thực vật tác dụng kháng vi sinh vật Dây khế (Cnestis palala (Lour. ) Merr .)" , Nghiên cứu Dược & Thông tin thuốc, 12( 3), tr 52-60 Nguyễn Thị Kim Phụng (200 7), Phương pháp