Nghiên cứu chủng xạ khuẩn VN08A12 - Streptomyces toxytricini có tiềm năng ứng dụng trong xử lý bệnh bạc lá lúa và thân thiện với môi trường : Luận văn ThS. Công nghệ Nanô sinh học

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ NGUYỄN ĐÌNH HẢI NGHIÊN CỨU CHỦNG XẠ KHUẨN VN08A12 - STREPTOMYCES TOXYTRICINI CÓ TIỀM NĂNG ỨNG DỤNG TRONG XỬ LÝ BỆNH BẠC LÁ LÚA VÀ THÂN THIỆN VỚI MÔI TRƯỜNG LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ NANÔ SINH HỌC Hà Nội – 2012 ii ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHỆ NGUYỄN ĐÌNH HẢI NGHIÊN CỨU CHỦNG XẠ KHUẨN VN08A12 - STREPTOMYCES TOXYTRICINI CÓ TIỀM NĂNG ỨNG DỤNG TRONG XỬ LÝ BỆNH BẠC LÁ LÚA VÀ THÂN THIỆN VỚI MƠI TRƯỜNG Chun ngành : Cơng nghệ Nanô sinh học Mã số : Chuyên ngành đào tạo thí điểm LUẬN VĂN THẠC SĨ CƠNG NGHỆ NANƠ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS NGUN §øC QUANG Hà Nội – 2012 iii MỤC LỤC CHƢƠNG 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích đề tài CHƢƠNG 2.1 Tổng quan chung về xạ khuẩn 2.1.1 Phân bố xạ khuẩn tự nhiên 2.1.2 Đặc điểm hình thái xạ khuẩn 2.1.3 Sự hình thành bào tử xạ khuẩn .4 2.1.4 Cấu tạo xạ khuẩn .5 2.2 Các phương pháp phân loại xạ khuẩn 2.2.1 Đặc điểm hình thái tính chất ni cấy 2.2.2 Phân loa ̣i hóa ho ̣c (Chemotaxonomy) 2.2.3 Đặc điểm hóa sinh 2.2.4 Phân loại số (Numerical taxonomy) 2.2.5 Phân loa ̣i dựa triǹ h tự gene 16s rRNA 2.2.6 Phân loại xạ khuẩn chi Streptomyces 11 2.3 Các chất có hoạt tính sinh học từ xạ khuẩn 12 2.4 Bệnh bạc lúa biện pháp phòng trừ 15 2.5 Tình hình nghiên cứu kiểm sốt bệnh bằng biện pháp sinh học 16 CHƢƠNG 17 3.1 Vật liệu nghiên cứu .17 3.1.1 Chủng xạ khuẩn VN08A12 sản phẩm lên men 17 3.1.2 Vi sinh vật kiểm định 17 3.1.3 Các chủng Xoo 17 3.1.4 Giố ng đỗ xanh thử nghiê ̣m nghiên cứu .18 3.1.5 Chuột thí nghiệm 18 3.1.6 Môi trường nghiên cứu 19 iv 3.1.7 Dụng cụ, thiết bị máy móc 20 3.2 Phương pháp nghiên cứu 20 3.2.1 Định loại chủng xạ khuẩn 20 3.2.2 Chọn lọc môi trường nuôi cấy phù hợp cho khả sinh kháng sinh VN08A12 27 3.2.3 Đánh giá ảnh hưởng dịch lên men xạ khuẩn lên đậu xanh 30 3.2.4 Phương pháp thử nghiệm ảnh hưởng dịch lên men xạ khuẩn lên chuột .30 CHƢƠNG 32 4.1 Phân loại chủng xạ khuẩn VN08A12 32 4.1.1 Đặc điểm sinh học .32 4.1.2 Đặc tính hóa sinh 33 4.1.3 Trình tự 16S-rRNA của chủng VN08-A12 38 4.2 Kết chọn lọc môi trường sinh kháng sinh phù hợp cho VN08A12 42 4.3 Kết thử nghiệm ảnh hưởng sản phẩm lên men chủng VN08A12 đến sinh trưởng phát triển đỗ xanh .44 4.4 Kết thử nghiệm ảnh hưởng sản phẩm lên men chủng VN08A12 đến sinh trưởng phát triển chuột bạch .45 CHƢƠNG 47 5.1 Kết luận 47 5.2 Kiến nghị 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT APM Antibiotic Producing Medium (Môi trường sinh kháng sinh) MAPM Modified Antibiotic Producing Medium (Môi trường sinh kháng sinh cải tiến) BĐ Môi trường APM dùng bã đậu thay cho khô đậu tương BĐ1 Môi trường thay dùng bã đậu ủ ngày BĐ4 Môi trường thay dùng bã đậu ủ ngày CT Công thức DNA Deoxyribonucleic acid NA Nutrient agar Xoo Xanthomonas oryzae pv oryzae YM Yeast - extract Mannitol YS Yeast - extract Soluble starch vi DANH MỤC BẢ NG STT Tên bảng Trang Bảng 2.1 Các sản phẩm tự nhiên từ vi sinh vật ứng dụng chúng 14 Bảng 3.1 Các môi trường dùng cho nghiên cứu 19 Bảng 3.2 Danh sách về thành phần môi trường dùng cho VN08A12 27 Bảng 4.1.2 Khả sử dụng nguồn đường khác VN08A12 .33 Bảng 4.1.3 Kế t quả Search Blast trin ̀ h tự gen 16s – rRNA GenBank 40 Bảng 4.2 Vòng ức chế chủng VN08A12 10 nòi Xoo (D-d, cm) .42 Bảng 4.3 Ảnh hưởng sản phẩm lên men chủng VN08A12 đến sinh trưởng phát triển đỗ xanh 44 Bảng 4.4 Ảnh hưởng sản phẩm lên men chủng VN08A12 đến sinh trưởng phát triển chuột bạch .46 vii DANH MỤC HÌ NH STT Tên hình Trang Hình 3.1 Bản đồ phân bố 10 chủng X oryzae pv oryzae miền Bắc - Việt Nam 18 Hình 4.1.1 Hình thái học chủng xạ khuẩn VN08A12 32 Hình 4.1.2A Khả đồng hóa nguồn carbon khác 35 Hình 4.1.2B Khả chịu muối khả đồng hóa .37 Hình 4.1.3 Trình tự 16S-rRNA của chủng VN08A12 38 Hình 4.1.4 Cây phân loa ̣i chủng VN08-A12 dựa 41 Hình 4.1.4 Cây phân loa ̣i chủng VN08-A12 dựa 41 Hình 4.2A Trên mơi trường YS 43 Hình 4.2B Trên mơi trường 43 Hình 4.2 Vịng kháng khuẩn VN08A12 môi trường 43 CHƢƠNG MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Bệnh bạc lúa vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae gây bệnh gây hại Việt Nam vùng trồng lúa giới Bệnh gây giảm suất lúa gạo Châu Á lên tới 60% tổng suất lúa hàng năm [4,8] Có nhiều biện pháp ngăn chă ̣n bùng phát dịch bệnh như: chọn lọc phát triển dòng lúa mang gene kháng bệnh, dùng chất hóa học để diệt trừ vi khuẩn gây bệnh, phòng trừ dịch hại tổng hợp [17] Tuy nhiên, biện pháp vẫn chưa đem lại hiê ̣u cao Xạ khuẩn (Actinomycetes) nhóm vi sinh vật nhân sơ thuộc vào giới vi khuẩn gram dương Xạ khuẩn có đặc điểm quý riêng biệt; đó nguồn sản xuất tự nhiên chất kháng sinh chất có hoạt tính sinh học [20] Gần người ta ước tính rằng cứ 10000 chất kháng sinh khám phá từ vi sinh vật, 2/3 chất đó sản xuất từ xạ khuẩn; nhiều chất số đó thuốc kháng sinh ứng dụng sản xuất rộng rãi ngày Các nghiên nhà cứu rằng: cứ 1000 chủng xạ khuẩn phân lập cách ngẫu nhiên, khoảng 10 chủng sinh streptomycin chủng sinh tetracycline [2,3] Bộ sưu tập 3000 chủng xạ khuẩn {những chủng phân lập ngẫu nhiên từ mẫu đất Việt Nam [14]} Bảo tàng giống chuẩn Việt Nam (Viện Vi Sinh công nghệ sinh học, ĐHQGHN) hứa hẹn tiềm tìm chất kháng sinh chất có hoạt tính sinh học dùng cho việc khống chế tiêu diệt vi khuẩn X oryzae pv oryzae gây bệnh bạc lúa Việt Nam Vì thế, việc sử dụng xạ khuẩn chất có hoạt tính sinh học chúng sinh để khống chế sinh học (sử dụng cân bằng vi sinh vật sản phẩm tự nhiên chúng để kìm hãm, ức chế vi sinh vật gây bệnh đó thúc đẩy trồng phát triển tốt hơn) kiểm soát bệnh bạc lúa có triển vọng phương pháp hiệu thân thiện về mặt sinh thái môi trường Xuấ t phát từ thực tiễn , tiến hành đề tài: “Nghiên cứu chủng xạ khuẩn VN08A12 – Streptomyces toxytricini có tiềm ứng dụng xử lý dịch bệnh bạc lúa thân thiện với mơi trƣờng” 1.2 Mục đích đề tài  Phân loại đến cấp độ loài chủng xạ khuẩn có tiềm sử dụng việc phòng chống dịch bệnh bạc lúa Việt Nam  Tiến hành thử nghiệm tác động chủng xạ khuẩn nghiên cứu động vật ni thí nghiệm (chuột bạch) lồi nơng nghiệp quan trọng (cây đậu xanh) để kiểm tra tương tác chủng xạ khuẩn với sinh vật môi trường sống CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀ I LIỆU 2.1 Tổng quan chung về xạ khuẩn 2.1.1 Phân bố xạ khuẩn tự nhiên Xạ khuẩn có đất, nước, rác, phân chuồng, bùn, chí chất mà vi khuẩn nấm mốc không phát triển Sự phân bố xạ khuẩn phụ thuộc vào khí hậu, thành phần đất, mức độ canh tác thảm thực vật Theo Waksman gam đất có khoảng 29.000 - 2.400.000 mầm xạ khuẩn, chiếm - 45% tổng số VSV [32] Sự phân bố xạ khuẩn cịn phụ thuộc nhiều vào độ pH mơi trường, chúng có nhiều lớp đất trung tính kiềm yếu hoặc axit yếu 6,8 - 7,5 Xạ khuẩn có lớp đất kiềm hoặc axit lớp đất kiềm, số lượng xạ khuẩn đất thay đổi theo thời gian năm Một đặc tính quan trọng xạ khuẩn khả hình thành chất kháng sinh, 60 - 70% xạ khuẩn phân lập từ đất có khả sinh chất kháng sinh Cho tới khoảng 8000 chất kháng sinh biết giới có tới 80% xạ khuẩn sinh [2] Trong số đó có 15% có nguồn gốc từ loại xạ khuẩn Micromonospora, Actinomadura, Actinoplanes, Streptoverticillium, Streptosporangium… Điều đáng ý xạ khuẩn cung cấp nhiều chất kháng sinh có giá trị dùng y học gentamixin, tobramixin, vancomixin, rosamixi Ngồi ra, xạ khuẩn tham gia tích cực vào q trình chuyển hố nhiều hợp chất đất, nước Dùng để sản xuất nhiều enzym proteaza, amylaza, xenluloza…một số axit amin axit hữu Một số xạ khuẩn có thể gây bệnh cho người, động vật [5] 2.1.2 Đặc điểm hình thái xạ khuẩn  Khuẩn lạc Đặc điểm bật xạ khuẩn có hệ sợi phát triển, phân nhánh mạnh không có vách ngăn (chỉ trừ cuống bào tử hình thành bào tử) Hệ sợi xạ khuẩn mảnh nấm mốc với đường kính thay đổi khoảng 0,2 -1 mm đến mm, chiều dài có thể đạt tới vài cm [5,9] Kích thước khối lượng hệ sợi thường không ổn định phụ thuộc vào điều kiện sinh lý ni cấy Kích thước hệ sợi 36 cyclodextrin, arbutin, maltose, palatinose, turanose, L-lactic acid, L-alanine, inosine, cellobiose, maltotriose, D-psicose, xylitol, D-malic acid, L-alanyl-glycine, thymidine, glycogen, D-fructose, D-mannitol, D-raffinose, L-malic acid, L-asparagine, uridine, inuline, L-fucose, D-mannose, L-rhamnose, acetic acid, methyl pyruvate, L-glutamic acid, adenosine-5’- monophosphate, mannan, D-galactose, D-melezitose, α- hydroxybutyric acid, glycyl-L- glutamic acid, thymidine-5’-onophosphate, tween 40, D- galacturonic acid, D-melibiose, salicin, β- hydroxybutyric acid, propionic acid, Lpyroglutamic acid, uridine-5’- monophoshate, gentiobiose, α-methyl D-galactoside, sedoheptulosan, γ- hydroxybutyric acid, pyruvic acid, L-serine, fructose-6- phosphate, N-acetyl-D- glucosamine, D- gluconic acod, β-methyl D-galactoside, D-sorbitol, phydroxyphenyl acetic acid, succinamic acid, putrescine, glucose-1- phosphate, Nacetyl-D- mannosamine, α-D-glucose, 3-methyl glucose, stachyose, α-keto glutaric acid, succinic acid, 2,3-butanediol, glucose-6- phosphate, amygdalin, m-inositol, αmethyl D-glucoside, sucrose, α-keto valeric acid, N-acetyl L-glutamic acid, glycerol, D-L-α-glycerol phosphate, VN08A12 sử dụng Do đó, có thể thấy rằng chủng VN08A12 có thể sử dụng D-fructose, Cellobiose, L-arabinose, Rhamnose, D-mannitol làm nguồn carbon chủ yếu; đó, khả sử dụng D-fructose tốt (gần bằng khả sử dụng D-glucose) 4.1.2.2 Khả đồng hóa Melanin khả chịu muối 37 Hình 4.1.2B Khả chịu muối khả đồng hóa Melanin VN08A12 Các thử nghiệm về khả đồng hóa Melanin khả chịu muối chủng VN08A12 (theo hình 4.1.2B) cho thấy chủng khơng có khả đồng hóa Melanin có thể chịu nồng độ muối đến 4% Từ kết phân loại về hình thái, sinh lí sinh hóa đó, có thể xếp loại chủng VN08A12 thuộc vào chi Streptomyces sp 38 4.1.3 Trình tƣ ̣ 16S-rRNA của chủng VN08A12 1kb Hình 4.1.3A Ảnh điện di DNA 1.5kb Hình 4.1.3B.Ảnh điện di sản phẩm PCR tở ng sớ M Marker 10kb 1,2 gen 16s -rRNA Hình 4.1.3 Trình tƣ ̣ 16S-rRNA của chủng VN08A12 Kế t quả điê ̣n di DNA tổ ng số hình 4.1.3A cho thấ y có băng , rõ nét chứng tỏ DNA không bị đứt gãy trình tách chiết Hàm lượng DNA thu tương đối lớn để tiế n hành phản ứng PCR Tiế n hành phản ứng PCR với că ̣p mồ i 27F và 1525R, đã thu đươ ̣c đoa ̣n DNA có kić h thước khoảng 1.5kb (hình 4.1.3B) theo đúng kić h thước lí thuyế t că ̣p mồ i có thể nhân đươ ̣c Chứng tỏ đoa ̣n DNA nhân đươ ̣c chính là gen 16s-rRNA xạ khuẩn Chúng tôi, tiế n hành gel và ti nh sa ̣ch DNA để giải trin ̀ h tự bằ ng bô ̣ kit tinh sa ̣ch sản phẩ m PCR của QIAgen - Kế t quả giải triǹ h tự của gen 16S rRNA giải đoạn gen dài 1387 Nu, có trình tự sau: TGCAAGTCGAACGATGAACCTCCTTCGGGAGGGGATTAGTGGCGAACGGG TGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTTCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAA CGGGGTCTAATACCGGATACGACTGCGGAAGGCATCTTCCGCGGTGGAAA GCTCCGGCGGTGAAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGT AATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGC CACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGG GAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGA 39 TGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTG ACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGT AATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCG TAGGCGGCCAGTCACGTCGGATGTGAAAGCCCGAGGCTTAACCTCGGGTC TGCATTCGATACGGGCTGGCTAGAGTGTGGTAGGGGAGATCGGAATTCCT GGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAG GCGGATCTCTGGGCCATTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCG AACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGTTGGGAACTAGG TGTTGGCGACATTCCACGTCGTCGGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTTCCC CGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGG CCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAAC CTTACCAAGGCTTGACATATACCGGAAAGCATTAGAGATAGTGCCCCCCTT GTGGTCGGTATACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGAT GTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTGTGTTGCCAGCAT GCCCTTCGGGGTGATGGGGACTCACAGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGGA GGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCA CACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGATACCGTGAGGTGGAGC GAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCC ATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATA CGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACA CCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCTTGTGGAGG Trình tự sử dụng để Search blast GenBank để xác định trình tự tương đờ ng, kế t thể bảng 4.1.3 40 Bảng 4.1.3 Kế t quả Search Blast trin ̀ h tƣ ̣ gen 16s – rRNA GenBank Kế t quả Blas t search GenBank kế t quả cho thấ y chủng VN 08A12 có trình tự 16S rRNA hồn tồn tương đồng với loài Streptomyces toxytricini với tỉ lê ̣ 100% Chúng tơi cũn g vẽ h ình phân loại chủng VN 08A12 dựa công cu ̣ Tree view GenBank Kết thể hình 4.1.4 cho thấ y chủng nghiên cứu nằ m nhóm với nhóm chủng Streptomyces toxytricini 41 Hình 4.1.4 Cây phân loa ̣i chủng VN08A12 dƣạ trình tự gen 16S –rRNA 42 4.2 Kết chọn lọc môi trƣờng sinh kháng sinh phù hợp cho VN08A12 Kết tóm tắt bảng 4.2 hình 4.2 Bảng 4.2 Vịng ức chế chủng VN08A12 10 nòi Xoo (D-d, cm) Môi trƣờng YS Môi trường 2M Môi trường 301 Môi trường Môi trường A-16 Môi trường No R1 1.0 ± 0.1 1.2 ± 0.1 1.6 ± 0.2 1.0 ± 0.1 0.9 ± 0.3 R2 0.6 ± 0.2 0.9 ± 0.3 1.1 ± 0.1 0.6 ± 0.2 R3 0.7 ± 0.1 1.8 ± 0.1 1.6 ± 0.1 R4 0.7 ± 0.2 1.8 ± 0.1 R5 0.3 ± 0.1 R6 Nòi Xoo APM MAPM* 1.0 ± 0.1 2.0 ± 0.2 2.4 ± 0.1 0.7 ± 0.2 1.2 ± 0.2 1.3 ± 0.3 1.8 ± 0.2 1.4 ± 0.1 1.9 ± 0.1 2.0 ± 0.1 2.0 ± 0.1 2.2 ± 0.3 2.0 ± 0.3 1.6 ± 0.1 1.6 ± 0.1 1.4 ± 0.2 1.7 ± 0.4 2.0 ± 0.1 2.0 ± 0.2 2.2 ± 0.1 1.6 ± 0.1 1.8 ± 0.2 1.6 ± 0.3 2.2 ± 0.1 2.4 ± 0.3 0.6 ± 0.1 0.6 ± 0.3 0.8 ± 0.2 0.5 ± 0.1 0.8 ± 0.1 1.0 ± 0.1 0.6 ± 0.2 1.0 ± 0.1 R7 0.4 ± 0.2 0.9 ± 0.1 0.7 ± 0.1 0.8 ± 0.3 1.5 ± 0.3 0.7 ± 0.1 0.5 ± 0.1 2.0 ± 0.1 R8 0.5 ± 0.1 1.0 ± 0.1 1.0 ± 0.1 1.2 ± 0.1 1.4 ± 0.1 1.1 ± 0.3 1.6 ± 0.3 2.2 ± 0.1 R9 0.2 ± 0.1 1.0 ± 0.2 1.3 ± 0.2 0.7 ± 0.2 0.5 ± 0.2 1.3 ± 0.2 1.0 ± 0.1 1.2 ± 0.2 R10 1.0 ± 0.2 1.2 ± 0.1 1.6 ± 0.4 1.2 ± 0.1 1.2 ± 0.1 1.0 ± 0.3 1.8 ± 0.2 1.8 ± 0.2 A-3M *: Chỉ giá trị P có ý nghĩa về mặt thống kê (YS 2M, 301, A-16, No 8, A-3M APM < MAPM) Kết cho thấy môi trường cải tiến, thay thành phần khô đậu tương bằng bã đậu phù hợp cho VN08A12 Vì thế, mơi trường MAPM chọn để lên men VN08A12 cho thí nghiệm 43 MAPM MAPM1 A B Hình 4.2A Trên mơi trƣờng YS Hình 4.2A Trên mơi trƣờng YS A Hình 4.2B Trên mơi trƣờng Hình 4.2B Trên mơi trƣờng APM; MAPM APM; MAPM Hình 4.2 Vịng kháng khuẩn VN08A12 môi trƣờng khác Từ kết cho thấy, môi trường sinh kháng sinh thay khô đậu tương bằng bã đậu tương cho kết tốt Như có thể dùng môi trường cải tiến cho việc lên men VN08A12 cho thí nghiệm 44 4.3 Kết thử nghiệm ảnh hƣởng sản phẩm lên men chủng VN08A12 đến sinh trƣởng phát triển đỗ xanh Bảng 4.3 Ảnh hƣởng sản phẩm lên men chủng VN08A12 đến sinh trƣởng phát triển đỗ xanh Ngày Lô Lô Lô Lô Lô Lô Lô Lô Lô 2/8 3/8 4/8 5/8 6/8 7/8 8/8 9/8 10/8 11/8 12/8 13/8 14/8 15/8 17/8 19/8 14.65 15.95 17.10 18.10 18.83 19.03 19.40 19.58 19.90 20.05 20.35 20.55 20.88 21.08 21.73 22.85 ±1.36 ±1.24 ±1.14 ±1.22 ±1.09 ±1.18 ±1.23 ±1.21 ±1.33 ±1.31 ±1.37 ±1.35 ±1.39 ±1.45 ±1.60 ±1.89 13.13 13.93 15.23 15.93 16.33 16.73 17.10 17.38 17.53 17.93 18.03 18.35 18.53 18.63 19.60 20.78 ±1.33 `±1.41 ±1.45 ±1.38 ±1.42 ±1.40 ±1.38 ±1.42 ±1.47 ±1.34 ±1.46 ±1.58 ±1.50 ±1.56 ±1.73 ±1.72 13.90 15.05 16.73 17.48 18.08 18.55 19.05 19.11 19.34 19.55 19.92 20.16 20.39 20.50 21.00 21.97 ±1.98 ±2.09 ±2.12 ±2.12 ±2.06 ±2.10 ±2.06 ±1.98 ±2.03 ±2.05 ±2.12 ±2.09 ±2.13 ±2.13 ±2.13 ±2.16 8.98 10.05 11.30 11.55 12.08 12.60 13.03 13.33 13.58 13.90 14.15 14.50 14.73 14.95 15.63 16.55 ±1.31 ±1.54 ±1.32 ±1.40 ±1.25 ±1.39 ±1.41 ±1.36 ±1.41 ±1.42 ±1.45 ±1.40 ±1.46 ±1.53 ±1.50 ±1.19 6.35 7.45 8.35 9.23 9.60 10.20 10.78 11.33 11.68 12.18 12.63 12.98 13.38 13.60 15.03 16.45 ±3.27 ±3.53 ±3.52 ±3.59 ±3.46 ±3.56 ±3.49 ±3.32 ±3.44 ±3.20 ±3.21 ±3.11 ±3.15 ±3.06 ±3.22 ±3.30 10.13 11.28 12.53 13.45 14.15 15.13 15.63 16.05 16.38 16.73 16.98 17.28 17.53 17.73 19.08 20.30 ±1.85 ±1.95 ±1.94 ±1.98 ±1.93 ±1.74 ±1.64 ±1.95 ±1.79 ±1.71 ±1.78 ±1.71 ±1.78 ±1.71 ±1.77 ±1.74 8.73 9.75 10.65 11.45 11.63 12.03 12.40 12.85 13.23 13.53 13.95 14.28 14.65 14.98 16.74 17.63 ±2.52 ±2.67 ±2.65 ±3.54 ±2.83 ±2.93 ±3.02 ±3.00 ±3.08 ±3.11 ±3.09 ±3.16 ±3.21 ±3.37 ±2.68 ±2.91 3.88 4.70 5.40 5.60 5.89 6.50 6.79 7.08 7.26 7.37 7.63 7.74 7.97 8.11 8.11 8.47 ±1.62 ±1.79 ±1.77 ±1.66 ±1.53 ±1.77 ±1.72 ±1.77 ±1.78 ±1.80 ±1.89 ±1.85 ±1.79 ±1.88 ±1.88 ±1.94 Chiều cao (cm) 45 25 Lô 20 Lô Lô 15 Lô 10 Lô Lô Lô Lô 19/8 17/8 15/8 14/8 13/8 12/8 11/8 10/8 9/8 8/8 7/8 6/8 5/8 4/8 3/8 2/8 Thời gian (ngày đo) Biểu đồ 4.3 Ảnh hƣởng VN08A12 đến sinh trƣởng phát triển đỗ xanh Chú thích: Từ lơ 1→ lơ 5: Lơ thí nghiệm (Phun sản phẩm lên men) Từ lô → lô 8: Lô đối chứng (Không phun sản phẩm lên men) Chiều cao từng đỗ xanh đo hàng ngày từ đến 19 tháng năm 2012 Chiều cao trung bình trị số độ lệch chuẩn (SD, standard deviation) từng lơ tính ghi chép từng bảng 4.3 Biểu đồ 4.3 cho thấy lô từ 1-3 lô đậu xanh phun dịch lên men có tốc độ sinh trưởng nhanh nhất, lô đậu xanh không phun dịch lên men có tốc độ sinh trưởng chậm (ngoại trừ lô số 6) Điều chứng tỏ sản phẩm lên men chủng xạ khuẩn VN08A12 không làm giảm sinh trưởng phát triển đỗ xanh, chí nó cịn có tác dụng kích thích sinh trưởng phát triển Có thể trình lên men, tế bào xạ khuẩn tiết môi trường chất thứ cấp có tác dụng kích thích sinh trưởng thực vật hoặc tạo chất dinh dưỡng tốt cho trồng Khi phun vào đất trồng, tế bào xạ khuẩn có thể góp phần cải biến môi trường đất, biến đổi chất khó hấp thu thành dạng dễ hấp thu cho hệ rễ hấp thụ Sản phẩm lên men chủng xạ khuẩn thân thiện với môi trường trồng trọt 4.4 Kết thử nghiệm ảnh hƣởng sản phẩm lên men chủng VN08A12 đến sinh trƣởng phát triển chuột bạch 46 Sản phẩm lên men chủng xạ khuẩn VN08A12 sơ thử nghiệm đánh giá ảnh hưởng lên sức khoẻ động vật môi trường thông qua trộn lẫn vào thức ăn chuột bạch ni theo dõi phịng thí nghiệm Kết thí nghiệm thể bảng đây: Bảng 4.4 Ảnh hƣởng sản phẩm lên men chủng VN08A12 đến sinh trƣởng phát triển chuột bạch 25/08 30/08 10/09 20/09 30/09 Thí 209 ± 215 ± 217 ± 247 ± 298 ± 315 ± 329 ± 336 ± 389 ± nghiệm 7.20 6.19 8.22 7.10 7.22 7.21 210 ± 216 ± 219 ± 244 ± 301 ± 309 ± 331 ± 342 ± 346 ± 5.34 7.21 8.10 7.36 7.32 Lô Ngày 15/08 Khối lượng (gram) Đối chứng 7.44 5/10 6.11 6.25 10/10 17/10 5.50 7.67 7.69 7.71 450 400 350 300 250 200 Lơ thí nghiệm 150 Lơ đối chứng 100 50 Thời gian (ngày cân) Biểu đồ 4.4 Ảnh hƣởng VN08A12 đến sinh trƣởng chuột nuôi thí nghiệm Các giá trị bảng trị số trung bình độ lệch chuẩn giá trị tính dựa dẫn liệu đo về cân nặng (đơn vị gram) 30 chuột bạch nuôi điều kiện thí nghiệm (có tẩm dịch lên men vào thức ăn) đối chứng (thấm nước cất vô trùng vào thức ăn) Qua bảng 4.4 biểu đồ 4.4 cho thấy chuột bạch ăn thức ăn có tẩm dịch lên men không bị ảnh hưởng về sức khỏe tốc độ tăng trưởng suốt thời gian nghiên cứu 47 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận - Bằng phương pháp hình thái học kiểm tra sinh lí, sinh hóa và phân tích trình tự gen 16S rRNA chúng xác đinh ̣ chủng VN08A12 Streptomyces toxytricini - Chúng chọn lọc môi trường MAPM lên men thích hợp cho VN08A12 Đây môi trường sinh kháng sinh cải tiến: dùng bã đậu tươi để thay khô đậu tương thành phần môi trường sinh kháng sinh Việc sử dụng bã đậu, tận dụng nguồn bã đậu phế thải sản xuất đậu phụ góp phần vào việc bảo vệ môi trường có ý nghĩa kinh tế - Bằng phương pháp thực nghiệm nhận thấy tiến hành thử nghiệm tác động chủng xạ khuẩn nghiên cứu động vật ni thí nghiệm (chuột bạch) lồi nơng nghiệp quan trọng (cây đậu xanh) cho thấy chủng xạ khuẩn không gây hại cho sinh vật môi trường sống 5.2 Kiến nghị Để đạt kết cao cần thực nhiều nghiên cứu để ứng dụng VN08A12 cho việc phòng trừ bệnh Do đó, đề xuất vài hướng nghiên cứu:  Nghiên cứu chất chất kháng sinh sinh từ chủng xạ khuẩn VN08A12 để có thể nắm chế đối kháng VN08A12 Xoo  Tối ưu điều kiện nuôi cấy để có thể chuyển từ quy mơ phịng thí nghiệm lên quy mơ lớn ứng dụng để sản xuất chế phẩm trừ bệnh bạc lúa góp phần giảm thiệt hại nghiêm trọng mà bệnh gây  Thử nghiệm giống lúa khác để kiểm tra mức độ thể chủng VN08A12  Thử nghiệm nhiều loài động vật, thực vật, động vật đất, vi sinh vật… để kiểm tra tính thân thiện chủng VN08A12 môi trường 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Văn Cách (2004), Công nghệ lên men chất kháng sinh, NXB khoa học kỹ thuật, Hà Nội Vi Thị Đoan Chính (2000), Nghiên cứu khả nâng cao hoạt tính kháng sinh chủng Streptomyces rimosus R77 Streptomyces hygroscopicus 5820 kỹ thuật dung hợp tế bào trần, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện công nghệ sinh học, Hà Nội Nguyễn Hoàng Chiến (2001), Nghiên cứu chủng xạ khuẩn Streptomyces V6 sinh chất kháng sinh chống vi khuẩn gây bệnh héo xanh cà chua, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Hà Nội Dinh, H.D.O., N K., Toan, N D., Du, P V., Loan, L C (2008), “Pathotype profilce of Xanthomonas oryzae pv oryzae isolates from the rice ecosystem in Cuulong river delta”, Omonrice, 16, 34-40 Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch, 6 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (1977), Vi sinh vật học, tập 2, Nhà xuất Đại học Trung học chuyên nghiệp, Hà Nội Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Nữ Kim Thảo (2006), “Các nhóm vi khuẩn chủ yếu”, Vietsiences Đỗ Tấn Dũng & Nguyễn Văn Viên (2005), Bệnh bạc lá, Một số bệnh hại lúa biện pháp phịng trừ, NXB Nơng nghiệp, Hà Nội, 42-45 Nguyễn Thành Đạt, K.A Vinogradva V.A.Poltorac (1974), Tính biến dị bề mặt bào tử Xạ khuẩn sinh choromomycin Act.A buraviensis, microbiologia, NXB Academia cccp 10 Fang, D.a.L.a (1995), “Emerging concept of secondary metabolism in actinomycetes”, J Actinomycetologica,, 9, 98-117 11 Furuya, N., Taura, S., Thuy, B T., Ton, P H., Hoan, N V., Yoshimura, A (2002), “Experimetal technique for bacterial Blight of rice” 12 Gnanamanickan, S S (2009), Biological control of rice diseases, Springer Dordrecht 49 13 Bùi Thị Hà (2008), Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh chè Thái Nguyên, Luận văn thạc sĩ Sinh học, trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên 14 Hop, D V., Kastuhiko Ando (2010), “Taxonomic and Ecological studies of Microorganisms in Vietnam and the utilization”, Joint research project between VNUH-IMBT, Vietnam and NITE-DOB, Japan 15 Jiang Bian, YanLi, Jian Wang, Fu-Hang Song, Mei Liu, Huan-Qin Dai, Biao Ren, Hong Gao, Xinling Hu, Zhi-Heng Liu, Wen-Jun Li and Li-Xin Zhang (2009), “Amycolatopsis marina sp nov., an actinomycete isolated from an ocean sediment”, International Journal of Systermatic and Evolutionary Microbiology, 59, 477-481 16 Jongsik Chun, S.B.K., Youn Kyung Oh, Goodfellow M (1999), “Amycolatopsis thermoflava sp.nov, anovel soil actinomycete from Hainan Island, China”, Int J, Syst Bacteriol, 49, 1369 - 1373 17 Lang, N.T.L., T T.; Khuyeu, B T D.; Vu, B C (2008), “Genetics and breeding for blast and bacterial leaf blight resistance of rice (Oryza sativa L)”, Omonrice, 16, 41-49 18 Lo, C.W., N.S.L H-Y Cheah, N.K.I Wong and C.C Ho1 (2002), “Actiomycetes isolated from soil samples from the crocker range Sabah”, ASEAN Review of Biodiversity and Environmental Conservation (ARBEC), 7, 1-2 19 Vũ Triệu Mân & Lê Lương Tề (1999), Bệnh vi khuẩn, virus hại trồng, NXB Giáo dục 20 Miyadoh, S Actinomycetes: Isolation and their antibiotic screening Workshop manual 2005, VNU-CBT and NITE cooperation project 21 Moncheva, P., Tishkov, Sava, Dimitrova, Nadezhda, Chipeva, Valentina, Antonova-Nikolova, Stefka, Bogatzevska, Nevena (2002), “Characteristics of soil actinomycetes from Antarctica”, Journal of culture collections, 3, 3-14 22 Lê Xuân Phương (2001), Vi sinh vật học công nghiệp, NXB Xây dựng, Hà Nội 23 Mai Văn Quyền (1969-1970), Ảnh hưởng loại phân vô đến phát sinh, phát triển bệnh bạc vi khuẩn, Kỷ yếu kết nghiên cứu khoa học Nông nghiệp, NXB Nông nghiệp 50 24 Robert D Nolan, T.C (1988), “Isolation and Screeming of Actinomycetes”, In Actinomycetes in Biotechnology, Academic Press, london 25 Tạ Minh Sơn (1987), Bệnh bạc vi khuẩn (Xanthomonas oryzae) tạo giống chống bệnh, Luận án tiến sĩ Khoa học, viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam 26 Sakiyama, Y., Nguyen, K N T., Nguyen, M G., Miyadoh, S., Duong, V H & Ando, K (2009), “Kineosporia babensis sp nov., isolated from plant litter in Vietnam”, Int J Syst Evol Microbiol 59, 550-554 27 Shirling, E.B & D.Gottlieb (1966) Methods for characterization of Streptomyces species Int.J Syst Bacteriol., 16, 313-340 28 Srivastava, D N (1972), Bacterial leaf blight of rice, Phytopathol 26 29 Phan Huu Ton, Bui Trong Thuy and Tong Van Hai, 2003 Pathogenicity of the Bacterial Leaf Blight Strains from Northern Vietnam The 2nd National Conference on Plant Pathology and Molecular Biology 30 Hà Minh Trung (1996), Hiện trạng triển vọng nghiên cứu bệnh virus, vi khuẩn hại trồng Việt Nam, Tạp chí Bảo vệ thực vật tháng 31 Phạm Văn Ty (1972), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Tập1, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, 328 - 345 32 Waksman, S.A (1961), “The Actinomycetes Classification, identification and descriptions of genera and species”, The Williams & Wilkins Co., Baltimore, USA,