Đang tải... (xem toàn văn)
Kỹ thuật PCR biến tính ở nhiệt độ thấp (CO - amplification at Lower Denaturation temperature - PCR; COLD - PCR) được cải tiến để ưu tiên làm giàu các đột biến (mt) chiếm tỉ lệ thấp trong quần thể thể dại (wt) qua quá trình nhân bản, nhờ đó giúp phát hiện quần thể đột biến kháng thuốc Nucleos(t)ide Analogs của HBV với độ nhạy 5% mt/wt. Thử nghiệm kỹ thuật này trên 50 mẫu huyết thanh của bệnh nhân nhiễm HBV (107 - 108 IU/ml), chúng tôi phát hiện 38 mẫu đột biến, trong đó 32 mẫu đột biến kháng thuốc gồm: 24 mẫu đột biến đơn rtV207M và rtV173G kháng LMV, rtN238A/K/T kháng ADV; 8 mẫu đột biến kép rtV207M/I - rtI187V kháng LMV, rtM204I - rtV207M/I và rtL180M - rtM204I - rtV207M/I kháng LMV, ADV và giảm hiệu quả của ETV. Với 2 mẫu đột biến kháng LMV, kỹ thuật COLD - PCR đã cho phép phát hiện đột biến kép rtV207M - rtV207I, trong khi kỹ thuật PCR thông thường chỉ phát hiện đột biến đơn rtV207M. Như vậy, kỹ thuật COLD - PCR có tiềm năng ứng dụng trong phát hiện sớm đột biến kháng thuốc để tư vấn kịp thời thuốc điều trị phù hợp cho bệnh nhân.
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC XÂY DỰNG KỸ THUẬT COLD - PCR ĐỂ PHÁT HIỆN SỚM QUẦN THỂ ĐỘT BIẾN KHÁNG THUỐC NUCLEOS(T)IDE ANALOGS Ở HEPATITIS VIRUS B Chu Văn Sơn1, Lê Thị Ngân4, Nguyễn Đăng Hoàn3, Vũ Thiên Sơn1, Phạm Thị Hạnh1, Nguyễn Minh Hằng2, Nguyễn Văn Dũng5, Vũ Bích Thảo6, Nguyễn Phạm Anh Hoa7, Phùng Thị Bích Thuỷ2, Nguyễn Thị Vân Anh1 Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội; Khoa Nghiên cứu Sinh học Phân tử Bệnh truyền nhiễm, Bệnh viện Nhi Trung Ương; Khoa Nhi Tiêu hóa - Dinh dưỡng- Lây, Bệnh viện Đa khoa Xanh Pôn; Khoa Vi sinh, Bệnh viện Bạch Mai; Trung tâm Bệnh nhiệt đới, Bệnh viện Bạch Mai; Khoa Khám bệnh theo yêu cầu, Bệnh viện Bạch Mai; Khoa Gan mật, Bệnh viện Nhi Trung Ương Kỹ thuật PCR biến tính nhiệt độ thấp (CO - amplification at Lower Denaturation temperature - PCR; COLD - PCR) cải tiến để ưu tiên làm giàu đột biến (mt) chiếm tỉ lệ thấp quần thể thể dại (wt) qua q trình nhân bản, nhờ giúp phát quần thể đột biến kháng thuốc Nucleos(t)ide Analogs HBV với độ nhạy 5% mt/wt Thử nghiệm kỹ thuật 50 mẫu huyết bệnh nhân nhiễm HBV (107 - 108 IU/ml), phát 38 mẫu đột biến, 32 mẫu đột biến kháng thuốc gồm: 24 mẫu đột biến đơn rtV207M rtV173G kháng LMV, rtN238A/K/T kháng ADV; mẫu đột biến kép rtV207M/I - rtI187V kháng LMV, rtM204I - rtV207M/I rtL180M - rtM204I - rtV207M/I kháng LMV, ADV giảm hiệu ETV Với mẫu đột biến kháng LMV, kỹ thuật COLD - PCR cho phép phát đột biến kép rtV207M - rtV207I, kỹ thuật PCR thông thường phát đột biến đơn rtV207M Như vậy, kỹ thuật COLD - PCR có tiềm ứng dụng phát sớm đột biến kháng thuốc để tư vấn kịp thời thuốc điều trị phù hợp cho bệnh nhân Từ khoá: HBV, NAs, đột biến kháng thuốc, COLD-PCR I ĐẶT VẤN ĐỀ Nhóm thuốc có cấu trúc tương tự Nucleos(t) ide Analogs (NAs), gồm loại Lamivudine (LMV), Telbivudine (LdT), Adeforvir dipivoxil (ADV), Tenofovir dipivoxil (TDV) Entecavir (ETV), sử dụng phổ biến điều trị viêm gan B mạn tính Nhóm thuốc Tác giả liên hệ: Nguyễn Thị Vân Anh, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG_ Hà Nội Email: vananhbiolab@gmail.com Ngày nhận: 27/03/2019 Ngày chấp nhận: 13/05/2019 12 có tác dụng ức chế enzym reverse trancriptase (RTase) xúc tác trình phiên mã ngược từ mRNA thành DNA HBV, làm giảm nhân lên HBV [1,2] Tuy nhiên, thời gian điều trị kéo dài xuất đột biến vùng gen mã hóa cho enzym RTase HBV dẫn đến tình trạng kháng thuốc bệnh nhân, gây khó khăn việc xác định hướng điều trị [3] Hiện nay, PCR kết hợp giải trình tự gen coi phương pháp “chuẩn vàng” để phát đột biến điểm kháng NAs Tuy nhiên kỹ thuật có độ nhạy thấp, khó phát TCNCYH 121 (5) - 2019 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC quần thể đột biến (mutant; mt) chiếm tỷ lệ thấp 20% so với thể dại (wild-type; wt) nên không phù hợp để phát sớm đột biến xuất trình điều trị thuốc [1] Phương pháp xác định đột biến giải trình tự hệ (Next Generation Sequencing; NGS) cho phép phát tất đột biến tồn quần thể với độ nhạy cao (khoảng 1%), nhiên có giá thành cao, khó phân tích yêu cầu thời gian phân tích liệu kéo dài nên chưa thể áp dụng rộng rãi cho xét nghiệm HBV kháng thuốc cộng đồng [1] Để khắc phục nhược điểm độ nhạy thấp nhân khơng chọn lọc PCR kết hợp giải trình tự Sanger, PCR biến tính nhiệt độ thấp phát triển nhóm nghiên cứu Li cộng [3], Liu cộng [4] cải tiến PCR truyền thống nhằm làm giàu có định hướng allele quần thể, từ làm tăng tỉ lệ allele hiếm/allele ưu thế, cuối tăng độ nhạy phản ứng Trong nghiên cứu xây dựng kỹ thuật COLD-PCR áp dụng cho việc nhân đặc hiệu vùng gen có kích thước < 200 bp chứa hầu hết đột biến kháng NAs gen mã hoá enzym RTase HBV Kỹ thuật kết hợp với giải trình tự gen đánh giá độ nhạy áp dụng thử nghiệm phát đột biến kháng thuốc NAs HBV mẫu huyết bệnh nhân viêm gan B mạn tính, thể tiềm ứng dụng phát sớm đột biến kháng thuốc để tư vấn kịp thời thuốc điều trị phù hợp cho bệnh nhân chưa điều trị thuốc NAs có tải lượng HBV > 106 IU/ml (trung bình 107 IU/ml) thu thập bệnh viện Nhi Trung Ương bệnh viện Đa khoa Xanh Pôn; + 20 mẫu huyết bệnh nhân người lớn điều trị với thuốc ba loại thuốc ETV, ADV TDF, có tải lượng HBV khơng giảm q trình điều trị > 106 IU/ml (trung bình 108 IU/ml), giảm xuống thấp khơng phát mà sau lại tăng bất thường (> 102 IU/ml) thu thập bệnh viện Bạch Mai Các mẫu bảo quản -80oC để phục vụ cho việc tách chiết DNA hệ gen, nhân đoạn gen chứa đột biến kháng thuốc NAs kỹ thuật PCR COLD-PCR theo chu trình nhiệt trình bày mục 2.2 2.4, giải trình tự đoạn gen để phân tích xuất điểm đột biến II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP K/T, rtM250I/V thuộc domain B-C-D-E Với kỹ thuật COLD-PCR, mồi xuôi rtHBV-Fw1/ Fw2 mồi ngược rtHBV- Rv1/Rv2 thiết Đối tượng Tổng cộng 50 mẫu huyết bệnh nhân viêm gan B mạn tính thu thập từ tháng đến tháng năm 2019, đó: + 30 mẫu huyết bệnh nhân nhi TCNCYH 121 (5) - 2019 Phương pháp 2.1 Thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho PCR COLD-PCR nhân vùng gen chứa đột biến kháng thuốc NAs Các cặp mồi xuôi ngược thiết kế dựa vùng bảo thủ trình tự gen mã hóa cho domain B-C-D-E enzym RTase HBV [3] kết so sánh sở liệu genome genotype HBV (A-I) ngân hàng gen NCBI Với kỹ thuật PCR, mồi xuôi rtHBV-Fw mồi ngược rtHBV - Rv thiết kế để khuếch đại đoạn trình tự P1-2 mang vị trí đột biến thường gặp rtV173G/ L/T, rtL180M, A181V/T, rtA194T, rtS202I/G, rtM204I/V, rtV207I/M/L, rtN236T, rtN/H238A/ kế để khuếch đại đoạn trình tự P1/P2 tương ứng thuộc domain B-C/D-E P1 P2 < 200 bp để đảm bảo chênh lệch nhiệt độ nóng chảy (Tm) sợi đơi homoduplex (mt13 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC mt; wt-wt) heteroduplex (mt-wt) Thơng tin mồi gen nhân trình bày bảng Bảng Thơng tin mồi, trình tự, kích thước vùng gen chứa đột biến kháng NAs HBV Cặp mồi Trình tự (5’ - 3’) rtHBV-Fw TCCTGCTCAAGGAACCTCTATG rtHBV-Rv TGTACAATATGTTCCTGTGG rtHBV-Fw1 CACCTGTATTCCCATCCCATC Vị trí gen Nu 532-929 AGGGACTCAAGATGCTGTACA rtHBV-Fw2 C A G T TATAT G G AT G AT G T G G TATTGG rtHBV-Rv2 TGTACAATATGTTCCTGTGG 2.2 Nhân dòng tạo plasmid chứa trình tự gen thể dại DNA hệ gen HBV tách chiết từ số mẫu huyết bệnh nhân viêm gan B mạn tính sử dụng sinh phẩm ANAPURE VIRAL DNA/RNA mini kit (ANABIO R&D, Việt Nam) sau sử dụng làm khuôn cho PCR nhân đoạn gen P1-2 có kích thước 398 bp cặp mồi rtHBV-Fw rtHBVRv với chu trình nhiệt 95oC - 10 phút; 35 chu kỳ gồm bước: 95oC - 15 giây, 60oC - 20 giây, 72OC - 20 giây; 72oC - phút Các sản phẩm PCR giải trình tự kiểm tra vắng mặt đột biến kháng thuốc NAs, sau nhân dòng vào vector pTOP-TA (Enzynomics, Hàn Quốc) Chủng E coli mang plasmid tái tổ hợp chứa đoạn gen 398 bp sàng lọc dựa phương pháp sàng lọc khuẩn lạc “xanh - trắng” khẳng định colony-PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu rtHBV Rv/Fw Khuẩn lạc tái tổ hợp sử dụng để 14 398 Vị trí axit amin (đột biến đại diện vùng) rtI169-rtG258 rtI169-rtS213 Nu 595-788 rtHBV-Rv1 Kích thước (bp) 194 rtM204I (LMV, LdT) rtV207L/M/I (LMV, LdT) rtA194T (TDF) rtG210- rtG258 Nu 732-929 198 rtN236T (ADV) rtM250V(ETV) tách plasmid dạng thể dại 2.3 Thiết kế tổng hợp gen tạo mẫu chuẩn chứa trình tự gen đột biến Các đoạn oligonucleos(t)ide mang đột biến điểm thay nucleos(t)ide vị trí tương ứng với đột biến đại diện thuê tổng hợp nhân dòng vào vector pUC19 Phusa Biochem, Việt Nam Trong đó, đoạn gen 194 bp chứa đột biến rtA194T (G709A), rtM204I (G741T), rtV207M (G748A); đoạn gen 198 bp chứa đột biến rtN236T (A836C), rtM250V (A877G) Các plasmid chứa đột biến giải trình tự để khẳng định vị trí đột biến 2.4 Xây dựng chu trình COLD-PCR phát đột biến kháng thuốc NAs HBV dựa mẫu chuẩn Dựa vào Tm dạng sợi đơi (đột biến thể dại), nhiệt độ biến tính tới hạn Tc xác định cách sử dụng DNA mang gen thể dại làm khuôn mẫu với hệ thống PCR TCNCYH 121 (5) - 2019 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC mô tả với chu trình nhiệt 95°C - 10 phút, 10 chu kỳ gồm 95°C - 15 giây, 60°C - 20 giây, 72oC - 20 giây 35 chu kỳ Tx - 15 giây, 60°C - 20 giây 72oC - 20 giây Giá trị Tx nhỏ mà khơng xuất sản phẩm PCR gel điện di argarose lựa chọn nhiệt độ biến tính tới hạn Tc cho hệ thống Sau xác định giá trị Tc, điều kiện cho COLD-PCR thiết lập sau: 95oC-10 phút, 10 chu kỳ (95oC - 15 giây, 60oC - 20 giây, 72oC - 20 giây), 30 chu kỳ (95oC - 15 giây, 70oC - 90 giây, Tc - 15 giây, 60oC - 20 giây, 72oC - 20 giây; 72oC - phút) Các phương pháp tinh DNA giải trình tự tương tự sử dụng cho sản phẩm PCR thông thường 2.5 Xác định ngưỡng phát kỹ thuật COLD-PCR Các plasmid tái tổ hợp chứa đoạn trình tự thể dại đột biến trộn lẫn để chuẩn bị mẫu plasmid hỗn hợp có tỉ lệ phần trăm đột biến/thể dại 100%, 10%, 5% 1%, sử dụng làm khuôn cho PCR, COLDPCR sau kết hợp giải trình tự Sanger để tính tốn độ nhạy phản ứng Thành phần phản ứng gồm 1X Hot-Taq Buffer; 0,2 mM dNTP; 1U Hot-Taq; 500 nM rtHBV-Rv/Fw (cho PCR) rtHBVRv1/Fw1 hay rtHBV Rv2/ Fw2 (cho COLD-PCR) H2O vừa đủ 25 µl Chu trình nhiệt PCR COLD-PCR thực giống tối ưu mục 2.2 2.4 Sản phẩm PCR COLD- PCR gửi tinh giải trình tự hãng First base (Singapore) Đạo đức nghiên cứu Nghiên cứu thông qua Hội đồng Y đức số 39/BVNTW-VNCSKTE ngày 9/1/2019 Bệnh viện Nhi Trung Ương theo đề tài mã số 108.04-2017.307 thực theo quy định đạo đức nghiên cứu Y học Bệnh nhân cung cấp đầy đủ thông tin nghiên cứu, bảo mật thông tin cá nhân ký vào phiếu đồng thuận tham gia nghiên cứu III KẾT QUẢ Thông tin bệnh nhân mẫu bệnh phẩm thu thập Thông tin tổng hợp tuổi, giới số cận lâm sàng nồng độ men gan (ALT, AST), HBV kháng nguyên (HBeAg) tải lượng HBV huyết bệnh nhân thu thập theo mô tả phần Phương pháp tổng hợp bảng 2, Bảng Thông tin bệnh nhân tham gia nghiên cứu Đặc điểm Trẻ em N = 30 Min - max 0,1 - 18,2 Tuổi (min - max) Người lớn Trung bình N = 20 4,92 Min - max Trung bình 23 - 63 38,7 Giới Nam 19 14 Nữ 11 ALT(IU/L) TCNCYH 121 (5) - 2019 18,9 - 889,4 125 225,1 - 666 125,7 15 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Đặc điểm Trẻ em N = 30 Min - max Người lớn Trung bình 21,3 - 1919,8 AST(IU/L) N = 20 143 Min - max 27,3 - 937 Trung bình 155,6 HBeAg (+/ - ) Dương tính 28 16 Âm tính Tải lượng HBV (IU/mL) 106 - 109 107 102 - 109 Ghi chú: Các chữ viết tắt: ALT, Alanine Amino Transferase; AST, Aspartate Amino Transferase; IU, đơn vị quốc tế; HBeAg, Kháng nguyên HBV; HBV, hepatitis B virus, Plasmid chứa gen thể dại gen mang đột biến điểm Hình Peak trình tự DNA sản phẩm PCR nhân từ plasmid mang đoạn gen thể dại đột biến (A) Các trình tự thể dại; (B): trình tự đột biến điểm tương ứng rtA194T (G709A), rtM204I (G741T), rtV207M (G748A), rtN236T(A836C), rtM250V(A877G) Vị trí đột biến thay nucleotide đánh dấu màu xanh 16 TCNCYH 121 (5) - 2019 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Các plasmid chứa gen thể dại đột biến kiểm tra có mặt đoạn gen chèn vào PCR kết hợp giải trình tự sử dụng cặp mồi thiết kế đặc hiệu cho vùng chứa đột biến đại diện trình bày bảng 1, Kết giải trình tự mẫu đột biến mẫu thể dại hình cho thấy trình tự đoạn gen thể dại đoạn gen mang đột biến có khác biệt vị trí đột biến thiết kế, tương ứng rtA194T (G709A), rtM204I (G741T), rtV207M (G748A), rtN236T (A836C) rtM250V (A877G), Như vậy, chúng tơi nhân dòng thành công đoạn gen thể dại đoạn gen chứa đột biến nêu để tạo mẫu chuẩn đánh giá độ nhạy COLD - PCR phát tỷ lệ % quần thể đột biến, Nhiệt độ biến tính tới hạn chu trình nhiệt cho COLD-PCR Nhiệt độ nóng chảy vùng gen P1 dài 194 bp P2 dài 198 bp xác định 83,5oC 81,5oC theo phương pháp mơ tả Từ chúng tơi thiết lập giá trị Tx giao động khoảng nhiệt độ nóng chảy để xác định nhiệt độ biến tính tới hạn Tc Hình Kết điện di sản phẩm PCR gradient xác định nhiệt độ biến tính tới hạn vùng gen P1 P2 (A): Vùng P1 nu 595 - 788; (B): Vùng P2 nu 732 - 929 Thứ tự giếng theo nhiệt độ biến tính Giếng 1: đối chứng âm, giếng 2: 81oC, giếng 3: 81,5oC, giếng 4: 82oC, giếng 5: 82,5oC, giếng 6: 82oC, giếng 7: 82,5oC, giếng 8: 83oC, giếng 9: DNA 100 bp Kết hình cho thấy băng sản phẩm PCR không xuất nhiệt độ nhỏ 82oC vùng gen P1 (hình 2A), nhỏ 81,5oC vùng gen P2 (hình 2B) Do đó, 81,5oC lựa chọn nhiệt độ biến tính tới hạn cho COLD-PCR nhân P1 P2 chu trình nhiệt, với hy vọng 81,5oC, đoạn DNA sợi đôi heteroduplex tạo sợi đơn thể dại sợi đơn đột biến ưu tiên nhân lên chu kỳ PCR Xác định ngưỡng phát kỹ thuật COLD-PCR mẫu chuẩn plasmid Ngưỡng phát kỹ thuật PCR COLD-PCR xác định dựa mẫu chuẩn hỗn hợp plasmid mang loại đột biến định rtL180M, rtA194T, rtM207V, rtN236T, rtM250V thể dại với tỷ lệ quần thể đột biến/thể dại 1%, 5%, 10% TCNCYH 121 (5) - 2019 17 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Hình Peak trình tự DNA chứa đột biến M204I mẫu chuẩn có tỷ lệ đột biến khác nhân COLD-PCR (trái) PCR (phải) Vị trí đột biến nu 741 (G->T) đánh dấu xanh da trời Kết giải trình tự Sanger với mẫu chuẩn vị trí rtM204I (hình 3) cho thấy, khuôn mẫu chuẩn tỉ lệ 10% mt/wt, kỹ thuật COLD - PCR cải tiến kỹ thuật PCR thông thường cho thấy xuất peak đột biến (T) vị trí nucleos(t)ide thể dại (G) tương ứng Tuy nhiên, kỹ thuật COLD - PCR cho thấy tín hiệu nu (T) cao hẳn so với kỹ thuật PCR thông thường Tương tự với mẫu có tỷ lệ 5% mt/wt, COLD - PCR cho phép phát peak nhỏ tương ứng với đột biến nu (T) PCR thấy peak nu (G) Ở tỉ lệ 1% mt/wt, kỹ thuật chưa phát hiên xuất đột biến Kết tương tự xảy với đột biến rtA194T (G709A), rtV207M (G748A), rtN236T (A836C) rtM250V (A877G) Như vậy, ngưỡng phát kỹ thuật COLD - PCR tối ưu 5% Thử nghiệm kỹ thuật COLD - PCR phát đột biến kháng thuốc NAs mẫu huyết bệnh nhân viêm gan mạn tính DNA hệ gen HBV tách chiết từ mẫu huyết 50 bệnh nhân viêm gan B mạn tính sử dụng làm khn cho việc phát đột biến điểm kháng thuốc NAs kỹ thuật PCR COLD - PCR xây dựng Kết phân tích trình tự đột biến vùng P1 - 2, P1 P2 mẫu bệnh tổng hợp trình bày bảng Bảng Tính chất đột biến vùng gen rtHBV mẫu huyết phát kỹ thuật COLD - PCR kết hợp giải trình tự gen STT 18 Tổ hợp đột biến V207M Bệnh nhân trẻ em (n = 30) Bệnh nhân người lớn (n = 20) n (%) n (%) 13,33 25 Phổ kháng thuốc LMV R ADV S ETV TDF S S TCNCYH 121 (5) - 2019 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC STT Tổ hợp đột biến Bệnh nhân trẻ em (n = 30) Bệnh nhân người lớn (n = 20) Phổ kháng thuốc n (%) n (%) LMV ADV ETV TDF V173G 3,33 0 R S S S I187V* 6,67 20 S S S S N238T/A/K 11 36,67 15 S R S S V207M, V207I 6,67 0 R S S S V207M, I187V* 3,33 0 R S S S V207M, V207I, I187V* 3,33 10 R S S S V207M, V207I, M204I 0 R S I S V207M, L180M, M204I, V207I 3,33 0 R R I S Tổng mẫu có đột biến 23 76,67 15 71,43 Tổng mẫu có đột biến kháng thuốc 21 70,00 11 52,38 Chú thích: ADV, adefovir dipivoxil; ETV, entecavir; LMV, Lamivudine; TDF, Tenofovir; R (Resistant), kháng thuốc; I, (Intermediate), giảm hiệu thuốc; S (Sensitive), nhạy cảm với thuốc; *đột biến làm giảm tốc độ chép virus Từ kết trình bày bảng 3, thấy với số lượng mẫu khảo sát hạn chế (n = 50), chúng tơi nhận thấy vị trí rtV207 rtN238 điểm thường xuyên xảy đột biến Trên tổng số 38 bệnh nhân phát có đột biến có tới 32 bệnh nhân mang đột biến kháng thuốc gồm 21 bệnh nhân nhi 11 bệnh nhân người lớn (chiếm tỷ lệ tương ứng 70% 52,4% với đối tượng khảo sát khảo sát) Các trường hợp phát đột biến gồm: mẫu đột biến rtV207M, mẫu đột biến rtV173G kháng LMV, 14 mẫu đột biến rtN238A/K/T kháng ADV, mẫu đột biến rtI187V làm giảm khả chép virus, tương ứng 18% 2%, 26% 12% tỷ lệ mẫu đột biến/tổng số mẫu khảo sát; mẫu đột biến kép gồm mẫu chứa rtV207M và/hoặc rtV207I và/hoặc I187V kháng LMV, tương ứng 8%; mẫu chứa tổ hợp rtM204I rtV207M/I kháng LMV giảm hiệu ETV, tương ứng 2%; mẫu chứa tổ hợp rtL180M, rtM204I, rtV207M/I kháng đồng thời LMV, ADV, giảm hiệu ETV, tương ứng 2% TCNCYH 121 (5) - 2019 19 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Hình Peak trình tự DNA chứa đột biến V207I (G750A G750T) mẫu huyết phát kỹ thuật COLD-PCR (hàng trên) mà không phát kỹ thuật PCR (hàng dưới) Đặc biệt, khác biệt hai kỹ thuật thể mẫu bệnh chứa đột biến kháng thuốc LMV mà COLD - PCR phát đồng thời đột biến rtV207M (G748A), rtV207I (G750A/T), PCR thông thường phát thấy đột biến rtV207M (hình 4) Với đột biến lại, kết tương đồng kỹ thuật, nhiên với mẫu bệnh có tỉ lệ đột biến duới 50% peak đột biến rõ ràng mẫu nhân COLD - PCR so sánh với PCR thông thường IV BÀN LUẬN Trong nghiên cứu xây dựng kỹ thuật COLD - PCR kết hợp với giải trình tự gen để phát đột biến kháng thuốc nằm vùng RT polymerase HBV (rtHBV) với ngưỡng phát 5% đột biến/quần thể, vượt trội so với PCR truyền thống kết hợp với giải trình tự gen (ngưỡng phát 10 20%) Nghiên cứu giải hạn chế nghiên cứu Liu cộng (2014) đoạn trình tự nhân lên < 141 bp thuộc domain B - C nên bỏ sót đột biến thuộc domain D - E như: rtN236T, rtN/H238A/K/T kháng ADV rtM250I/V kháng ETV [5] Kết 20 thử nghiệm bước đầu kỹ thuật COLD - PCR 50 bệnh nhân cho thấy tỷ lệ đột biến liên quan tới tính kháng thuốc LMV ADV nhóm đối tượng bệnh nhân nhi chưa điều trị bệnh nhân người lớn điều trị cao, lên tới 70% 52,4% Các bệnh nhân nhi mang tỷ lệ đột biến cao mắc phải truyền từ mẹ sang thông tin đột biến góp phần quan trọng cho bác sĩ lâm sàng tư vấn điều trị Tỷ lệ đột biến cao > 50% kháng LMV ADV phát nghiên cứu Nguyễn Nghiêm Luật cộng [6], cao TCNCYH 121 (5) - 2019 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC so với tỷ lệ đột biến phát số nghiên cứu khác mẫu huyết có tải lượng HBV thấp lựa chọn ngẫu nhiên [7 - 9] Sự đột biến kháng thuốc đa dạng xảy nhiều điểm đột biến V207M (kháng LMV) N238A/T (kháng ADV) phổ biến nhất, đối tượng bệnh nhân nhi chưa qua điều trị bệnh nhân người lớn qua điều trị thuốc Những đột biến kháng LMV - ADF (M204I+/ - L180M) chiếm tỷ lệ 3,33% bệnh nhân nhi chưa qua điều trị 5% bệnh nhân đã/đang điều trị, tổ hợp đột biến tồn trước tiếp cận liệu pháp ETV nguyên nhân làm giảm hiệu sử dụng thuốc làm tăng đột biến kháng ETV Nghiên cứu chưa phát thấy trường hợp có đột biến điểm kháng ETV hay TDF, tương tự báo cáo Nguyễn Văn Dũng cộng chưa phát thấy trường hợp mang hai loại đột biến 52 mẫu huyết nhiễm HBV điều trị TDF [10] Do ngưỡng phát kỹ thuật COLD - PCR cải thiện, phát thêm trường hợp bệnh nhân mang đột biến V207I quy định tính kháng LMV so sánh với PCR truyền thống Tuy vậy, nghiên cứu bước đầu áp dụng kỹ thuật COLD - PCR kết hợp giải trình tự để phát đột biến kháng thuốc, cần thực số lượng mẫu lớn để khẳng định giá trị sử dụng kỹ thuật V KẾT LUẬN Chúng xây dựng kỹ thuật COLD PCR cho phép làm giàu đột biến kháng thuốc NAs với ngưỡng phát 5%, bước đầu áp dụng kỹ thuật COLD - PCR mẫu huyết cho thấy hiệu phát đột biến cao kỹ thuật PCR truyền thống Mặc dù nghiên cứu thực cỡ mẫu hạn chế cần khảo sát cỡ TCNCYH 121 (5) - 2019 mẫu lớn tương lai, kết cho thấy COLD - PCR kết hợp giải trình tự gen tiềm sàng lọc sớm đột biến kháng thuốc, nhằm tư vấn thuốc điều trị phù hợp cho bệnh nhân Lời cảm ơn Nghiên cứu tài trợ Quỹ Phát triển khoa học công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) đề tài mã số 108.04 2017.307 TÀI LIỆU THAM KHẢO Lok A.S., Zoulim F., Locarnini S et al (2007) Antiviral drug-resistant HBV: Standardization of nomenclature and assays and recommendations for management Hepatology 46, 254 - 265 Karayiannis P (2003) Hepatitis B virus: old, new and future approaches to antiviral treatment J Antimicrob Chemother, 51, 761 – 785 Zoulim F and Locamini S (2009) Hepatitis B Virus Resistance to Nucleos(t) ide Analogues Gastroenterology, 137, 1593 1608 Li J., Wang L., Mamon H et al (2008) Replacing PCR with COLD-PCR enriches variant DNA sequences and redefines the sensitivity of genetic testing Nature Medicine, 14, 579 – 584 Liu C., Lin J., Chen H et al (2014) Detection of hepatitis B virus genotypic resistance mutations by coamplification at lower denaturation temperature-PCR coupled with Sanger sequencing Journal of Clinical Microbiology, 52, 2933 – 2939 Nguyễn Nghiêm Luật cộng (2014) Phát đột biến kháng thuốc virus viêm gan B từ bệnh nhân bị viêm gan B mạn miền Bắc Việt Nam Tạp chí Y học Việt Nam, 421, 158 - 163 21 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Nguyễn Thị Hải Yến, Nguyễn Thanh Bảo, Cao Minh Nga (2015) Phát đột biến kháng thuốc HBV bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính chưa điều trị kỹ thuật giải trình tự chuỗi Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh, 19, 365 - 368 Nguyễn Hùng Cường, Nguyễn Bảo Trân, Hoàng Thị Thanh Huyền (2013) Nghiên cứu tỉ lệ đột biến gen kháng thuốc HBV đối tượng tiêm chích ma túy gái mại dâm Hải Phòng Tạp chí Y- Dược học quân sự, 6, 57 - 63 Đặng Mai Anh Tuấn, Võ Đức Xuyên An, Phạm Hùng Vân (2010) Tìm hiểu đột biến kháng Adefovir lamivudine HBV tách chiết từ huyết bệnh nhân viêm gan B mạn tính Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh, 4, 287 - 293 10 Nguyễn Văn Dũng, Trịnh Thị Ngọc, Nguyễn Thị Lan Anh (2016) Hiệu điều trị đột biến tháng thuốc virut viêm gan B bệnh nhân viên gan virut B mạn điều trị Tenofovir Tạp chí Y học lâm sàng, 94, 39 - 47 Summary MODIFICATION OF COLD-PCR FOR EARLY DETECTION OF NUCLEOSIDE ANALOGS DRUG-RESISTANCE MUTATIONS IN HEPATITIS B VIRUS CO - amplification at Lower Denaturation temperature - PCR (COLD - PCR) method was modified to enrich rare mutations (mt) vs wild types (wt) in a population during the amplification, thereby enabling detection of Nucleotide Analog (NA) resistant HBV mutations with high sensitivity of 5% mt/wt Applying the modified method to test on 50 serum samples of patients with chronic hepatitis B infections (107 - 108 IU/ml), we found 38 samples having mutations, in which 32 samples having mutations associated NA drug - resistance There were 24 samples containing single mutations including rtV207M and rtV173G associated to LMV resistance, rtN238A/K/T associated to ADV resistance; multiple mutations included: samples containing muliple mutations including rtV207M/I - rtI187V associated to LMV resistance; rtM204I rtV207M/I and rtL180M - rtM204I - rtV207M/I associated to LMV and ADV resistance and reduced ETV efficacy On two samples containing LMV resistant mutations, COLD - PCR detected double rtV207M - rtV207I mutations whereas conventional PCR detected only single rtV207M mutations In conclusion, COLD - PCR method is potential for early detection of drug - resistance mutations, thereby instructing appropriate treatment regimens for chronic hepatitis B patients Keywords: HBV, NAs, drug resistant mutations, COLD-PCR 22 TCNCYH 121 (5) - 2019 ... NAs kỹ thuật PCR COLD - PCR xây dựng Kết phân tích trình tự đột biến vùng P1 - 2, P1 P2 mẫu b nh tổng hợp trình b y b ng B ng Tính chất đột biến vùng gen rtHBV mẫu huyết phát kỹ thuật COLD - PCR... 198 bp chứa đột biến rtN236T (A836C), rtM250V (A877G) Các plasmid chứa đột biến giải trình tự để khẳng định vị trí đột biến 2.4 Xây dựng chu trình COLD- PCR phát đột biến kháng thuốc NAs HBV dựa... thường IV B N LUẬN Trong nghiên cứu xây dựng kỹ thuật COLD - PCR kết hợp với giải trình tự gen để phát đột biến kháng thuốc nằm vùng RT polymerase HBV (rtHBV) với ngưỡng phát 5% đột biến /quần thể,