Nghiên cứu loài vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây hại trên một số cây trồng cạn tại vùng hà nội và phụ cận vụ hè thu 2007 và vụ xuân hè 2008

Luận văn, thạc sỹ, tiến sĩ, cao học, kinh tế, nông nghiệp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-

NGÔ THỊ VIỆT HÀ

NGHIÊN CỨU LOÀI VI KHUẨN RALSTONIA SOLANACEARUM

SMITH GÂY HẠI TRÊN MỘT SỐ CÂY TRỒNG CẠN

HÀ NỘI - 2008

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược ai công bố trong bất cứ công trình nào khác

Tôi xin cam ñoan rằng mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này ñã ñược cám ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc

Tác giả luận văn

Ngô Thị Việt Hà

Tôi cũng xin ñược chân thành cảm ơn TS Hà Viết Cường cùng tập thể cán

bộ, công nhân viên Trung tâm nghiên cứu Bệnh cây nhiệt ñới - trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã nhiệt tình giúp ñỡ và tạo mọi ñiều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực tập

Bên cạnh ñó tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tất cả người thân, bạn bè những người luôn bên cạnh ñộng viên giúp ñỡ tôi trong quá trình học tập và thực hiện ñề tài

Hà Nội, ngày tháng năm 2008 Tàc giả luận văn

Ngô Thị Việt Hà

MỤC LỤC

2.1.1 Lịch sử nghiên cứu bệnh héo xanh vi khuẩn Ralstonia

2.1.2 Bảo tồn, lan truyền, xâm nhập, gây bệnh của vi khuẩn gây bệnh

2.1.3 Mức ñộ phổ biến và tác hại của bệnh héo xanh vi khuẩn 10

2.1.4 Các nghiên cứu về phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn

3 Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu 19

3.4.1 Phương pháp ñiều tra bệnh héo xanh vi khuẩn trên ñồng ruộng 21

3.4.2 Những nghiên cứu trong phòng thí nghiệm 21

3.4.2.3 ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy ñến sự phát triển của khuẩn

3.4.2.4 ảnh hưởng của các ngưỡng nhiệt ñộ ñến sự phát triển của khuẩn

3.4.2.5 Nghiên cứu các ñặc tính sinh hoá của các dòng vi khuẩn gây bệnh

3.4.2.6 Phương pháp kiểm tra vi khuẩn héo xanh bằng kỹ thuật PCR 23

3.4.3.1 Phương pháp lây bệnh nhân tạo 26

3.4.3.2 Phương pháp thử phản ứng siêu nhạy trên cây thuốc lá của các 26

dòng vi khuẩn gây bệnh

4.1 Tình hình bệnh héo xanh vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith

trên một số cây trồng cạn vùng Hà nội và phụ cận vụ hè thu 2007 và

4.2 ðiều tra, khảo sát ảnh hưởng của chế ñộ luân canh ñến sự phát

4.3 Nghiên cứu về vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith gây bệnh

4.3.1 ðặc ñiểm hình thái khuẩn lạc vi khuẩn Ralstonia solanacearum

Smith trên các môi trường nuôi cấy khác nhau 47

4.3.2 ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy ñến sự phát triển của các

4.3.3 ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến sự phát sinh, phát triển của vi khuẩn

4.3.4 Xác ñịnh nòi sinh học (biovar) của một số dòng vi khuẩn gây

bệnh héo xanh phân lập ñược tại Hà Nội và phụ cận 54

4.3.5 Kết quả xác ñịnh vi khuẩn R solanacearum bằng kỹ thuật PCR 56

4.4.1 Thử phản ứng siêu nhạy của các dòng vi khuẩn gây bệnh héo

xanh phân lập trên cây thuốc lá (Nicotiana tabacum) 59

4.4.2 Khảo sát tính gây bệnh của vi khuẩn R solanacearum trên các

DANH MỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT

B polymixa Bacillus polymixa

CC4 Cà chua – Trâu Quỳ, Gia Lâm, Hà Nội

KT3 Khoai tây – Lộc Bình, Lạng Sơn

P fluorescens Pseudomonas fluorescens

TZC Triphenyl Tetrazolium Chloride

nhiễm R solanacearum sẽ không có triển vọng xuất khẩu sang thị trường châu

Âu cũng như thị trường khu vực châu Á Thái Bình Dương Bệnh héo xanh vi

khuẩn do vi khuẩn R solanacearum gây ra có nguồn gốc từ ñất gây hại rất phổ

biến và nghiêm trọng ở vùng nhiệt ñới và cận nhiệt ñới Bệnh khó phòng chống

do vi khuẩn có khả năng tồn tại lâu dài trong ñất, trong cơ thể ký chủ thực vật như thân, hạt giống, củ giống, tàn dư thực vật,

Ngoài ra, vi khuẩn R solanacearum có phổ ký chủ rất rộng: gây hại trên

44 họ thực vật, bao gồm hơn 200 loài cây [22], trong ñó ñáng chú ý nhất là các cây có ý nghĩa kinh tế cao như cà chua, khoai tây, thuốc lá, ớt, cà, lạc, vừng, hồ tiêu, ñậu tương, dâu tằm, chuối,

Ở nước ta, với ñiều kiện khí hậu nhiệt ñới gió mùa, nóng ẩm, mưa nhiều rất thích hợp cho sự phát triển của bệnh héo xanh vi khuẩn Trong thực tế, bệnh

ñã phát triển và gây hại nghiêm trọng ở nhiều vùng trồng cà chua, khoai tây, thuốc lá, lạc, cà, [4]

Trong thời gian tới theo các nhà khoa học dự báo, cùng với sự thay ñổi khí hậu toàn cầu, bệnh héo xanh vi khuẩn sẽ ngày càng gây hại nghiêm trọng hơn trong sản xuất, các biện pháp hoá học thì ngày càng tỏ ra kém hiệu quả ñối với bệnh này

Do thiếu kiến thức, có nơi, có lúc, nông dân dùng các loại thuốc hoá học

ñể phòng chống bệnh do R solanacearum gây ra Tuy nhiên, việc phòng chống không những không ñạt hiệu quả như mong muốn mà còn gây ô nhiễm nông sản, môi trường và tác hại tới sức khoẻ con người Thực tế mấy năm qua cho thấy mặc dù bệnh héo xanh vi khuẩn ñã ñược nghiên cứu nhiều và ñã ñạt ñược một số kết quả nhất ñịnh, xong việc áp dụng chúng vào sản xuất trên ñồng ruộng chưa ñem lại nhiều ý nghĩa thiết thực

ðể góp phần khắc phục những trở ngại cho sản xuất do bệnh héo xanh vi khuẩn, cần thiết phải có những nghiên cứu về bệnh héo xanh vi khuẩn, qua ñó ñể góp phần ổn ñịnh năng suất, ñảm bảo hiệu quả và thúc ñẩy sản xuất nông nghiệp Trên cơ sở ñòi hỏi bức xúc của thực tế sản xuất Chúng tôi ñã tiến hành thực hiện

ñề tài:

“Nghiên cứu loài vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith gây hại trên một số cây trồng cạn tại vùng Hà Nội và phụ cận vụ hè thu 2007 và vụ xuân hè 2008”

1.1 Mục ñích của ñề tài

- điều tra, ựánh giá mức ựộ phổ biến của bệnh héo xanh vi khuẩn do vi

khuẩn R solanacearum Smith gây hại trên một số cây trồng cạn ở vùng Hà Nội

và phụ cận vụ hè thu 2007 và vụ xuân hè 2008

- Nghiên cứu một số ựặc ựiểm sinh học của loài vi khuẩn R solanacearum

Smith gây hại trên một số cây trồng cạn ở vùng Hà Nội và phụ cận

1.2 Yêu cầu của ựề tài

- đánh giá ựược tình hình bệnh héo xanh vi khuẩn trên một số cây trồng

cạn tại vùng Hà Nội và phụ cận vụ hè thu 2007 và vụ xuân hè 2008

- Nghiên cứu một số ựặc ựiểm sinh học của loài vi khuẩn R solanacearum

Smith gây hại trên một số cây trồng

1.3 đối tượng và phạm vi nghiên cứu

- đối tượng nghiên cứu: ựối tượng gây bệnh héo xanh vi khuẩn trên cà

chua, lạc, thuốc lá, ớt, cà pháo, khoai tây, mướp ựắng tại vùng Hà Nội và phụ cận

- Phạm vi nghiên cứu: ựiều tra, ựánh giá mức ựộ phổ biến của bệnh héo

xanh vi khuẩn do vi khuẩn R solanacearum Smith gây hại trên một số cây trồng

cạn ở vùng Hà Nội và phụ cận vụ hè thu 2007 và vụ xuân hè 2008

- Nghiên cứu một số ựặc ựiểm sinh học của loài vi khuẩn R solanacearum

Smith gây hại trên một số cây trồng cạn ở vùng Hà Nội và phụ cận

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Những nghiên cứu ngoài nước

2.1.1 Lịch sử nghiên cứu bệnh héo xanh vi khuẩn Ralstonia solanacearum

Bệnh héo xanh vi khuẩn là một trong những bệnh hại cây trồng quan trọng

nhất trên thế giới Bệnh gây ra bởi nguyên nhân là vi khuẩn Pseudomonas solanacearum (P solanacearum), gây hại trên một số cây trồng vùng nhiệt ựới,

cận nhiệt ñới và một số vùng có nhiệt ñộ ấm trên thế giới, là loại bệnh hại chính trên nhiều loài cây trồng quan trọng [22]

Vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith (trước ñây là P solanacearum),

gây nên bệnh héo xanh vi khuẩn Thuộc lớp Betaproteobacteria, bộ Burkholderiales, họ Ralstoniaceae [16] Bệnh gây héo trên 200 loài cây, trong

ñó có những loài cây trồng quan trọng như lạc, khoai tây, cà chua, thuốc lá, chuối, mặc dù bệnh héo xanh vi khuẩn chủ yếu gây hại ở các vùng nhiệt ñới, cận nhiệt ñới nhưng chúng cũng là mối nguy hiểm trên một số cây trồng của vùng có khí hậu lạnh hơn ñặc biệt là khoai tây [18 ]

Loài vi khuẩn R solanacearum, không phải là một ñơn vi khuẩn ñồng

dạng về sinh học hay phạm vi ký chủ, mà là một nhóm các dòng vi khuẩn biến thể phức tạp, vi khuẩn rất dễ biến dị, phân hoá thành nhiều chủng, thể hiện qua các race, biovar, biotype, khác nhau về tính chuyên hoá cây ký chủ, sự phân bố ñịa lý, tính ñộc cũng như các ñặc tính sinh lý, sinh hoá Buddenhagen và ctv

(1962) (dẫn theo [16]), ñã xác ñịnh vi khuẩn R solanacearum làm 3 chủng sinh

lý chính (race)

Race 1: gây hại trên các cây thuốc lá, cà chua, khoai tây, cà, chuối lưỡng bội, một số cây cỏ dại và các cây thuộc họ cà khác, nhiệt ñộ thích hợp cho chúng phát triển là từ 35- 370C

Race 2: chủ yếu gây bệnh trên chuối tam bội (nguyên nhân gây nên bệnh

Moko trên chuối) và loài Heliconia spp., nhiệt ñộ thích hợp cho chúng phát triển

là từ 35-370C

Race 3: gây hại chủ yếu trên khoai tây và cà chua, nhóm này có ñộc tính cao ñối với các cây thuộc họ cà, nhiệt ñộ thích hợp cho chúng phát triển là 270C,

ngoài ra, chúng còn gây hại trên một số cây ký chủ dại khác như Solanum dulcamara, S nigrum, S.cinereum (ở Australia)

Sau ñó, Buddenhagen (1986) (dẫn theo [16]), ñã xác ñịnh ñược thêm 2 races nữa, chúng gây hại trên gừng và trên dâu tằm nhưng các ñặc ñiểm sinh học của chúng chưa ñược xác ñịnh rõ ràng

Race 1 và 2 thường phân bố ở vùng nhiệt ñới, nhiệt ñộ cho chúng phát triển thuận lợi là từ 33- 370C Race 3 ñược tìm thấy nhiều ở vùng ôn ñới và ở những vùng núi cao có khí hậu ôn hoà của vùng nhiệt ñới, nhiệt ñộ thích hợp cho race 3 phát triển là từ 27-280C [28]

Hayward (1964) (dẫn theo [16]), ñã xác ñịnh ñược 4 biovars của vi khuẩn

R solanacearum, khả năng của chúng là sản sinh ra axit oxi hoá các nguồn

cacbon trong quá trình sử dụng các nguồn cacbon (3 loại ñường ña và 3 loại rượu

6 cacbon ) Còn biovar 5 ñược Buddenhagen (1986) (dẫn theo [16]), xác ñịnh

trong khi nghiên cứu chủng vi khuẩn R solanacearum gây hại trên cây dâu tằm

Sử dụng kỹ thuật RFLP (Restriction fragment length polymorphism) trong

việc ñánh giá mối quan hệ của 62 chủng vi khuẩn P solanacearum tương ứng

với các biotype từ I ñến IV thuộc các race 1, 2 và 3 Cook và Sequeira (1988), [15], ñã chia loài vi khuẩn gây bệnh héo xanh làm 2 nhóm Nhóm 1 gồm các chủng thuộc race 1 biovar 3 và 4 Nhóm 2 gồm các chủng của race 1 biovar 1, race 2 và race 3 Dựa vào ý tưởng của Cook và Sequeira, Seal và ctv (1999) [36],

sử dụng kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction) ñể phân chia loài vi khuẩn R solanacearum trong tổng số 104 mẫu phân lập ñược thu từ 24 nước trên thế giới

thuộc các khu vực như Châu Âu, khu vực Trung và Nam châu Mỹ, Trung Quốc, Châu Á, phía tây và phía ñông Châu Phi, Ấn ðộ, Australia Bằng sự xác ñịnh DNA của 2 tiểu phần riboxom 16S và 23S (16S rDNA và 23S rDNA) của vi

khuẩn, kết quả xác ñịnh ñược các biovar 3, 4 và 5 thuộc Division I, các biovar 1,

N2, 2 và gồm cả vi khuẩn gây héo mạnh dẫn ở chuối, Pseudomonas syzygii

thuộc Division II

Poussier và ctv (1999) [35], Dựa vào kỹ thuật PCR-RFLP phân tích ñoạn

gen thuộc vùng hrp của các chủng vi khuẩn R solanacearum của một số nước

thuộc Châu Phi như Reunion, Madagaskar, Zimbabwe và Angola, ñã xác ñịnh ñược các chủng vi khuẩn này có quan hệ mật thiết với các chủng vi khuẩn thuộc Division "Asiaticum” (Division I)

Việc xác ñịnh ñược các chủng (races) là rất quan trọng trong dịch tễ học cũng như trong vấn ñề phòng trừ bệnh héo xanh vi khuẩn [22]

Ngày nay, loài vi khuẩn R solanacearum ñược chia ra làm 5 races và 5

biovars dựa trên phạm vi gây bệnh trên cây ký chủ và sử dụng các nguồn dinh dưỡng (cacbonhydrate)

Trước ñây ở Nhật Bản, các race 1 và 3, biovar N2, 3 và 4 ñã ñược xác ñịnh gây hại trên các cây trồng thuộc họ cà như cà chua, khoai tây, thuốc lá, cà [39]

Tại Nhật Bản, vi khuẩn gây bệnh héo xanh ñược công bố gây hại trên hơn

40 loài, trong 20 họ thực vật Dựa vào kết quả lây bệnh nhân tạo các dòng vi khuẩn phân lập của Nhật Bản, Tsuchiya và ctv (2004), [39], phân chia các chủng

vi khuẩn R solanacearum thành 4 nhóm gây bệnh, từ nhóm I ñến nhóm III gây

hại chính trên các cây trồng họ cà, thuộc race 1, còn nhóm IV gây hại trên khoai tây, thuộc race 3

Nghiên cứu biovar trên các chủng vi khuẩn của Nhật Bản, các chủng vi khuẩn của Nhật Bản ñược chia thành 3 biovar ñó là biovar 3, 4 và N2 Biovar 3

và 4 là phổ biến nhất, còn biovar N2 của Nhật Bản có một số ñặc ñiểm của kiểu

hình khác với biovar 2 và N2 của nước ngoài So sánh về trình tự DNA của tiểu phần riboxom 16S trong nghiên cứu về tắnh ựa dạng của gen của loài vi khuẩn

R solanacearum thu thập tại Nhật Bản và một số nước đông Nam châu Á, Tsuchiya và ctv (2004) [39], ựã xác ựịnh loài vi khuẩn R solanacearum thuộc

nhóm 1 của Nhật Bản (bao gồm các chủng của biovar N2, 3 và 4 thuộc race 1) có quan hệ gần với các chủng của biovar 3, 4 và 5 thuộc Division I thuộc châu Á và Australia, còn các chủng vi khuẩn thuộc nhóm 2 (biovar N2 thuộc race 3) của Nhật Bản cũng có quan hệ gần với biovar 2 và N2 của Indonesia thuộc subdivision 2b

2.1.2 Bảo tồn, lan truyền, xâm nhập, gây bệnh của vi khuẩn gây bệnh héo xanh R solanacearum

Vi khuẩn gây bệnh bảo tồn trong ựất, trong tàn dư cây bệnh Ở vùng nhiệt ựới, nhiều loài cỏ dại ựã là ký chủ phụ của loài vi khuẩn này, chúng là cầu nối giữa nguồn bệnh với cây trồng

Ngoài ra, vi khuẩn gây bệnh còn bảo tồn trong hạt giống, vật liệu làm giống Từ những năm của thập niên 20, thế kỷ 20, bệnh héo xanh vi khuẩn ựã ựược chứng minh là có truyền qua hạt giống Ở Indonesia, những hạt lạc ựược thu từ những cây lạc bị nhiễm bệnh thì có thể truyền bệnh cho vụ sau [30] Người ta ựã tìm thấy vi khuẩn trên vỏ quả, trên vỏ lụa và trong phôi hạt Theo các tài liệu ựã ựược công bố của các tác giả Perseley (1986), Kelman và ctv (1994), Singh (1995), (dẫn theo [16]), nêu rằng chủng vi khuẩn thuộc race 1 gây bệnh trên cà chua, ớt, cà có truyền qua hạt giống, những củ khoai tây giống bị nhiễm bệnh héo xanh có mang mầm bệnh từ vùng này sang vùng khác

Sự lan truyền của vi khuẩn rất ựa dạng Lan truyền nhờ môi giới côn trùng như race 2 gây bệnh Moko trên chuối [16] Vi khuẩn lan truyền từ cây này sang

cây khác trên ñồng ruộng nhờ nước mưa, nước tưới, gió bụi, các dụng cụ lao ñộng trong quá trình chăm sóc cây trồng Race 3 có thể lan truyền dễ dàng theo dòng nước [41]

Tuyến trùng, ñặc biệt là tuyến trùng nốt sưng (Meloidogyne spp.) cũng là

môi giới lan truyền bệnh héo xanh vi khuẩn trên ñồng ruộng Tuyến trùng chích vào rễ cây trồng, tạo vết thương giúp cho vi khuẩn xâm nhập vào cây trồng dễ dàng hơn [22]

Một nguyên nhân nữa cũng rất quan trọng trong việc giúp cho vi khuẩn lan truyền từ vùng này sang vùng khác ñó là việc buôn bán, trao ñổi các sản phẩm nông nghiệp Ở Australia, việc trao ñổi vật liệu giống khoai tây nhiễm bệnh là nguyên nhân làm xuất hiện bệnh ở vùng

có nhiệt ñộ thấp hơn New South Wales [34]

Vi khuẩn xâm nhập vào rễ cây trồng thông qua vết thương, qua lỗ khí khổng, bì khổng trên củ khoai tây Vi khuẩn di chuyển theo bó mạch, quá trình

di chuyển của vi khuẩn trong bó mạch càng tăng khi gặp nhiệt ñộ cao và tốc ñộ

di chuyển của vi khuẩn còn phụ thuộc vào từng bộ phận của cây trồng Ví dụ:

trên thuốc lá, vi khuẩn R solanacearum di chuyển trên thân nhanh hơn ở trên rễ

của cây [18 ], [33] Trong quá trình phát triển, vi khuẩn sản sinh ra các men pectinase, cellulose ñể phân huỷ mô, tế bào thực vật, ngoài ra vi khuẩn còn sản sinh ra các ñộc tố ở dạng exopolysaccharite, lipopolysaccharite làm vít tắc mạch dẫn, cản trở sự vận chuyển nước, nhựa nguyên và nhựa luyện trong cây, làm cây

bị héo nhanh chóng ðặc tính gây bệnh của các dòng vi khuẩn R solanacearum

ñược quyết ñịnh bởi gen ñộc hrp

Nhiệt ñộ là ñiều kiện tự nhiên rất quan trọng, chúng ảnh hưởng ñến khả năng gây bệnh, phân bố của vi khuẩn, cũng như khả năng bảo tồn của vi khuẩn ở

trong ñất [22] Vi khuẩn R solanacearum phát triển thuận lợi ở khoảng nhiệt ñộ

từ 24- 350C Do ñó, vùng ôn ñới bệnh héo xanh vi khuẩn hiếm khi xuất hiện vì các tháng mùa ñông ña số có nhiệt ñộ dưới 100C [16] Ẩm ñộ cũng là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng ñến sự phát sinh gây hại, bảo tồn của vi khuẩn Khi gặp ñiều kiện thuận lợi nhiệt ñộ cao kết hợp với hiện tượng mưa nắng xen kẽ sẽ là ñiều kiện tốt cho bệnh héo xanh vi khuẩn phát sinh, lan truyền nhanh chóng trên ñồng ruộng Ở Ấn ðộ, giống vừng Madhavi gieo ngày 21 tháng 8 có tỷ lệ nhiễm bệnh héo xanh vi khuẩn là 40,5%, trên giống Pb Til No.1 gieo ngày 2 tháng 7 có tỷ lệ nhiễm bệnh 15,1% Như vậy, nhiệt ñộ và ẩm ñộ có tác ñộng rất lớn ñến sự phát sinh, phát triển và gây hại của vi khuẩn gây bệnh héo xanh Ẩm ñộ của ñất thích hợp cho vi khuẩn phát sinh, phát triển là khoảng - 0,5 ñến -1 bar (ñơn vị ño áp suất) [16]

Cây trồng khi bị nhiễm bệnh héo xanh vi khuẩn thường có triệu chứng tái xanh héo cụp xuống Cây mới bắt ñầu bị bệnh cây bệnh có thể héo rũ một cành, một số cành, ban ngày tái xanh héo cúp xuống, trong ñêm có thể hồi phục lại nhưng chỉ sau 2, 3 ngày cây không thể hồi phục ñược nữa, toàn thân cây héo rũ, dẫn tới héo xanh và chết Trên cây bị bệnh, các lá gốc bị héo rũ trước, vỏ thân ở phần thân dưới xù xì, cắt ngang thân thấy các bó mạch bị biến màu thành màu nâu ñen, ấn mạnh gần miệng cắt thấy dịch vi khuẩn màu trắng ñục chảy ra Thân cây dần dần bị thối mềm

Vi khuẩn R solanacearum Smith có hình gậy Vi khuẩn hảo khí, không

sinh nha bào, nhuộm gram âm, kích thước từ 0,5- 0,7 x 1,5 -2µm, có từ 1 – 3 lông roi ở một ñầu của vi khuẩn [28] Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường TZC (Triphenyl Tetrazolium Chloride), khuẩn lạc của vi khuẩn nhày, hình dạng không ñều hoặc hình tròn, rìa khuẩn lạc có màu trắng, tâm màu phớt hồng Môi

trường TZC là môi trường chỉ thị của vi khuẩn gây bệnh héo xanh, ngoài ra môi trường TZC còn ñược sử dụng ñể phát hiện các dòng vi khuẩn còn ñộc tính Những khuẩn lạc của vi khuẩn bị mất ñộc tính thường nhỏ, màu kem hay ñỏ sẫm [27]

Vi khuẩn có khả năng phân giải gelatin, khử nitrat, tạo H2S, không thuỷ phân tinh bột, tạo bong bóng khí trong nước oxy già 3% [19], (dẫn theo [3])

2.1.3 Mức ñộ phổ biến và tác hại của bệnh héo xanh vi khuẩn

Vi khuẩn R solanacearum gây bệnh héo xanh, có tính chuyên hoá rộng,

gây hại trên nhiều cây trồng khác nhau, trên 200 loài thực vật, ñặc biệt vi khuẩn gây hại nặng trên những cây trồng thuộc nhiệt ñới và cận nhiệt ñới, trên những cây trồng có giá trị kinh tế như cà chua, thuốc lá, khoai tây, chuối, lạc, ớt, bông, cao su, khoai lang, sắn, gừng, cà, dâu tằm, một số cây trồng thuộc họ bầu bí, Ngoài ra, người ta còn tìm thấy nòi biovar 3 của vi khuẩn còn gây hại trên một

số cây trồng lâu năm như cây ñiều (Anacardium occidentale) ở Indonesia [38], trên na (Annona spp.) và cây cọ Alexandra (Archontophoenix alexandrae) ở Queensland, Australia [31], [13] Một số loài cỏ dại như Stylosanthes, Agretatum conyzoides, Amarathus

Nghiên cứu về ñặc tính chuyên hoá của cây ký chủ, sự phân bố ñịa lý của

loài vi khuẩn R solanacearum Denny và Hayward (2005) [19], ñã ñưa ra bảng

phân bố ñịa lý, phạm vi ký chủ của các race và các biovar của vi khuẩn gây bệnh héo xanh

Race Phạm vi ký chủ Phân bố ñịa lý Biovar

1

3 Khoai tây, một số cây

thuộc họ cà

Phân bố rộng trừ Mỹ và Canada

2

Vi khuÈn g©y h¹i trªn tÊt c¶ c¸c giai ®o¹n cña c©y trång, nh−ng g©y h¹i m¹nh nhÊt vµo giai ®o¹n c©y ra hoa vµ cho qu¶, bÖnh lµm gi¶m n¨ng suÊt cña c©y trång rÊt nghiªm träng

Machmud (1985) [29], nhËn xÐt r»ng, ë nh÷ng vïng bÖnh hÐo xanh g©y h¹i m¹nh th× thiÖt h¹i vÒ n¨ng suÊt cña c©y trång lµ rÊt nghiªm träng: 90% trªn l¹c, 16% víi cµ chua, 8% víi hå tiªu ¦íc tÝnh thiÖt h¹i trªn l¹c hµng n¨m ë Indonesia do bÖnh hÐo xanh vi khuÈn g©y ra vµo kho¶ng 50.000 – 150.000 tÊn

Ở Fiji, bệnh héo xanh do vi khuẩn R solanacearum gây nên là bệnh quan trọng nhất, vi khuẩn gây hại chủ yếu trên khoai tây, ớt, cà, cà chua Bệnh gây thiệt hại lớn về kinh tế, trung bình từ 40 – 60%, có thể lên tới 90% ước tính làm giảm khoảng 3 triệu ñô la Fiji trong nhập khẩu khoai tây và khoảng 230 nghìn ñô

la Fiji trong sản xuất sản xuất cà chua trong nước năm 1984 [26]

Trong nghiên cứu của Machmud (1993) [30], về bệnh héo xanh vi khuẩn gây hại trên lạc ở Indonesia - tiến hành từ mùa mưa 1984/85 ñến mùa khô 1991- nhận xét tỷ lệ nhiễm bệnh héo xanh vi khuẩn trên những giống lạc kháng bệnh trên ñồng ruộng là từ 15 - 35%, còn trên các giống mẫn cảm là từ 60-90% Vi

khuẩn R solanacearum thường gây hại nặng nhất trên khoai tây, thuốc lá và cà

chua Theo báo cáo của Zehz (1969) (dẫn theo [16]), ở Philippines bệnh héo

xanh vi khuẩn gây thiệt hại năng suất trung bình trên cà chua, cà, ớt và thuốc lá trong những năm 1966 Ờ 1968 tương ứng là 15 %, 10%, 10% và 2-5%

Ở đài Loan, các giống cà chua lai cung cấp cho thị trường rau an toàn ựều

bị nhiễm bệnh héo xanh, giống Hualien ASVEG No.5 có tỷ lệ nhiễm trung bình

là 15%, giống Taichung ASVEG No.4 có tỷ lệ nhiễm trung bình là 26%, còn trên các giống cà chua lai khác tỷ lệ nhiễm trung bình là 55%, ước tắnh thiệt hại lên tới 496000 NT$/ha (New Taiwan Dolar) [23]

Tại Nepan, theo báo cáo của Gurung (1997) [21], có thời kỳ sản xuất khoai tây ở ựây hầu như bị mất trắng nguyên nhân do bệnh héo xanh phá hại, có những vùng bệnh gây thiệt hại năng suất lên tới 100%, còn ựa số thiệt hại là 50% năng suất khoai tây

Tại Venezuela, Garcắa và ctv (1999) [20], ựã nghiên cứu sự phân bố, sự

gây hại của vi khuẩn R solanacearum trên một số giống khoai tây tại một số

vùng trồng khoai tây phổ biến ở Venezuela nhận thấy rằng, vi khuẩn héo xanh gây hại và phát triển mạnh ở những vùng có ựộ cao từ 1167 Ờ 3000m so với mực nước biển, hầu như không gây hại ở những vùng có ựộ cao trên 3000m so với mực nước biển Tỷ lệ gây hại của bệnh cũng tăng theo thời gian, năm 1992 tỷ lệ bệnh là 22% ựến năm 1996 tỷ lệ gây hại của bệnh ựã lên tới 37%, với phần trăm diện tắch bị nhiễm bệnh biến ựổi từ 5 Ờ 75% diện tắch

Tại Ấn độ, trong những năm 1994 Ờ 1995, bệnh héo xanh vi khuẩn ựã gây hại trên 80% diện tắch trong 310 cánh ựồng trồng gừng ở Himachal Pradesh [37]

Ở Trung Quốc, từ thập niên 70 của thế kỷ 20, bệnh héo xanh vi khuẩn ựã ựươc phát hiện thấy gây hại trên các cây trồng như khoai lang (Quang đông và Quảng Tây) và trên dâu tằm [25]

2.1.4 Các nghiên cứu về phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn Ralstonia solanacearum

Từ trước cho ñến nay, có nhiều chiến lược phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn ở các nước trên thế giới ñã ñược phát triển, nhưng trên thực tế bệnh héo xanh vi khuẩn vẫn không nằm trong tầm kiểm soát của con người bởi nhiều yếu

tố như cây trồng, ñiều kiện kinh tế xã hội, ñiều kiện tự nhiên, ngoài ra, vi

khuẩn R solanacearum là loài vi khuẩn ña thực có phổ ký chủ rộng, phân bố

rộng khắp ở các vùng trên thế giới, vi khuẩn có khả năng tồn tại lâu dài trong ñất, trong tàn dư thực vật, hơn thế nữa vi khuẩn lại có sự phân hoá thành nhiều race, biovar có tính chuyên hoá khác nhau và có khả năng biến thể tuỳ theo ñiều kiện tự nhiên môi trường Chính vì vậy, việc áp dụng biện pháp phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn riêng rẽ sẽ không ñem lại hiệu quả như mong muốn

Theo Hayward (1994), Boucher và ctv (1987) (dẫn theo [1]), cho biết ñể phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn có hiệu quả thì phải áp dụng các biện pháp phòng trừ tổng hợp, kết hợp hài hoà các biện pháp như chọn và dùng giống kháng bệnh, sử dụng các biện pháp sinh học, biện pháp canh tác, biện pháp hoá học, cần thiết phải biết trạng thái của cây (giai ñoạn và hiện trạng sinh trưởng), các race và biovar của vi khuẩn có mặt tại khu vực, các biovar biến thể của vi khuẩn và phương thức lan truyền

*Biện pháp sử dụng giống kháng

Là một trong những biện pháp ñược coi là mang lại hiệu quả kinh tế nhất trong phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn Trên thế giới, việc chọn lọc và phát triển các giống kháng trong việc kiểm soát bệnh héo xanh vi khuẩn ñã thu ñược nhiều thành công Tuy nhiên, sự biểu hiện tính kháng chịu ảnh hưởng rất nhiều của các nhân tố môi trường như nhiệt ñộ, ẩm ñộ ñất, lượng mưa, chu kỳ sáng,

Nhiều giống kháng trên khoai tây, cà chua, cà tím, thuốc lá, lạc cũng như các cây trồng khác ñã ñem lại hiệu quả trong việc phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn [17]

Trên khoai tây, dòng Solanum phureja có nguồn gốc Colombia ñã ñược

Rowe và ctv (1972) (dẫn theo [22]), sử dụng làm vật liệu trong việc lai tạo khoai tây kháng bệnh héo xanh nhưng không khả thi vì không áp dụng ñược cho tất cả các ñiều kiện môi trường Sau ñó, Schmiediche (1986) (dẫn theo [22]), ñã phát hiện ñược bộ gen kháng héo xanh vi khuẩn từ giống khoai tây lưỡng bội và ñược ứng dụng vào lai tạo giống Tung và ctv (1990) (dẫn theo [22]), ñã tìm ra bộ gen kháng héo xanh quan trọng, chúng có thể thích nghi ñược trong ñiều kiện môi trường phức tạp Một số dòng khoai tây mang gen kháng bệnh héo xanh ñã ñược chọn tạo và ñưa vào sản xuất ở Brazil như BP88068-3, BP881665, BP88074-1 (dẫn theo [3])

Trên cà chua, nhiều dòng/giống cà chua mang gen kháng bệnh héo xanh vi khuẩn ñã ñược chọn lọc Tuy nhiên, rất khó ñể ñạt ñược tính kháng một cách bền vững trong ñiều kiện nhiệt ñộ cao, ẩm ướt ở vùng nhiệt ñới gió mùa ðể khắc phục ñiều này, phương pháp ghép cà chua trên cây cà kháng bệnh hoặc trên

Solanum torvum ñã ñược áp dụng Wang và ctv (2000) (dẫn theo [1]) ñã sử dụng

3 giống cà tím kháng bệnh héo xanh vi khuẩn là EG 190, EG 203, EG 219 làm gốc ghép và dùng cành ghép là giống cà chua quả nhỏ: santana, ASVEG#6 Sau

ñó cây ghép ñược lây nhiễm nhân tạo và trồng trong nhà lưới Kết quả là trong

vụ hè, giống ASVEG#6 có từ 20 – 31,8% số cây bị chết xanh so với 100% số cây không ñược ghép bị chết do bệnh héo xanh vi khuẩn

Ở Indonesia, giống lạc kháng bệnh héo xanh ñã ñược áp dụng từ rất sớm, giống lạc Schwart 21 có khả năng kháng bệnh héo xanh ñã ñược ñưa vào sản

xuất từ năm 1927 (dẫn theo [3]) Ở Trung Quốc, những giống lạc mang gen kháng ựã ựược ựưa vào sản xuất như E Hua 5, Gui You 28, Lu Hua 3, Yue You

92, Yeu You 256 và Zhonghua 2 [16]

* Biện pháp canh tác

Vi khuẩn R solanacearum gây bệnh héo xanh là loài ký sinh ựa thực, là

loài vi khuẩn ựất có khả năng tồn tại lâu dài trong ựất, lan truyền nhờ nước tưới, nước mưa, gió bụi, qua hạt giống, côn trùng môi giới, tuyến trùng và qua dụng

cụ chăm sóc, vì vậy, việc áp dụng các biện pháp luân canh cây trồng không

phải là cây ký chủ của vi khuẩn R solanacearum, ựặc biệt là với cây trồng nước

ựược coi là biện pháp hữu hiệu trong việc giảm mật ựộ vi khuẩn trong ựất cũng như giúp hạn chế tối ựa nguồn bệnh từ vụ trước Ở Indonesia, biện pháp luân canh giữa lạc với lúa nước ựã ựem lại hiệu quả trong việc phòng chống bệnh héo xanh trên lạc [30] Tại Trung Quốc cũng ứng dụng thành công biện pháp luân canh giữa lạc với lúa nước, trong 3 năm luân canh, tỷ lệ bệnh giảm từ 83,4% xuống còn 1,5% [25] Trong 5 năm luân canh khoai tây Ờ lúa mì - ựậu lupin Ờ ngô - khoai tây và khoai tây Ờ lúa mì - khoai tây Ờ ngô - khoai tây ở Ấn độ ựã ựem lại hiệu quả là làm giảm tỷ lệ nhiễm bệnh héo xanh trên khoai tây từ 80,1% xuống còn 6,3 và 7,5% ở năm thứ 5 [16]

Biện pháp xen canh cũng ựem lại hiệu quả trong phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn Xen canh giữa khoai tây với ngô hoặc ựậu cô ve ựã làm giảm tỷ

lệ nhiễm bệnh héo xanh trên khoai tây [16]

Ở đài Loan, Trong kết quả nghiên cứu của Michel và ctv (1997), ựã kết luận rằng việc xử lý ựất trước khi trồng với công thức ure (200kg/ha) kết hợp với CaO (5000kg/ha) ựã có hiệu quả trong việc làm giảm tỷ lệ nhiễm bệnh héo xanh trên cà chua [32]

* Biện pháp sinh học

Theo CABI (2004) [16], kẻ thù tự nhiên của loài vi khuẩn R solanacearum là: Bacillus cereus, Bacillus polymixa, Bacillus lichneformis, Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens, Burkholderia glumae, Chainia flava

Việc sử dụng vi khuẩn ñối kháng trong phòng chống bệnh héo xanh vi

khuẩn ñã ñược tiến hành từ những năm 1952 Vi khuẩn B polymixa B3A ñược sử

dụng trong phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn, trong công thức xử lý B polymixa tỷ lệ cây héo chỉ ở mức 33%, trong khi ñó ở công thức ñối chứng tỷ lệ

bệnh là 70% (dẫn theo [14]) Theo kết quả nghiên cứu của Aspiras và ctv (1985) [14], ở công thức chỉ lây nhiễm nhân tạo vi khuẩn héo xanh trên giống mẫm cảm Yellow Plum không ñược xử lý tỷ lệ cây sống sót sau 10 ngày lây nhiễm là 0%,

trong khi ở công thức có xử lý B polymixa FU6 và P fluorescens có tỷ lệ cây

sống sót là 60% và 90%

* Biện pháp hoá học

Trong phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn, biện pháp hoá học ñược xem

là ít hiệu quả, do vi khuẩn tồn tại trong ñất, xâm nhiễm và sinh sản trong mạch dẫn của cây Dùng các chế phẩm kháng sinh ñược coi là biện pháp triển vọng thay thế thuốc hoá học Tuy nhiên, dùng các kháng sinh dễ tạo ra các dạng, chủng vi khuẩn mới kháng thuốc Hơn nữa, giá thành thuốc kháng sinh cao là một trở ngại lớn cho việc ứng dụng rộng rãi (dẫn theo [1])

Ngoài ra, còn một số biện pháp khác nhằm hạn chế sự phát sinh phát triển

của vi khuẩn R solanacearum như vệ sinh ñồng ruộng, thu hạt giống khoẻ, sạch

bệnh trên những cây trồng không bị nhiễm bệnh ñể giống, xử lý hạt giống trước khi gieo trồng ðộ ẩm của hạt cũng là một trong những yếu tố ảnh hưởng ñến sự phát sinh phát triển của vi khuẩn, ñộ ẩm của hạt < 8,9% hầu như vi khuẩn gây

hại không phát sinh, phát triển ñược Tsang và Shintaku (1998), cho rằng xử lý

rễ gừng bằng không khí nóng 500 C, khoảng 30 phút cũng thành công trong việc phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn trên gừng [16]

2.2 Những nghiên cứu trong nước

Bệnh héo xanh vi khuẩn hại trên cà chua, khoai tây, thuốc lá, lạc, ở Việt Nam ñã ñược nhắc ñến từ những năm 1960 của thế kỷ 20 qua các báo cáo của Viện Bảo vệ thực vật

Theo Tạ Thu Cúc và ctv (1983) [2] vi khuẩn gây bệnh héo xanh là loài gây hại nghiêm trọng trên cà chua Bệnh phát sinh, gây hại nặng ở các vùng ñất trũng, không thoát nước, ñất thịt nặng hoặc những chân ñất bón nhiều ñạm, không cân ñối với lân và kali

Vũ Triệu Mân (1985) [6], khi ñiều tra bệnh và hại trên thuốc lá ở vùng ñồng bằng và trung du miền Bắc Việt Nam ñã cho rằng bệnh héo xanh vi khuẩn hại thuốc lá ở Ba Vì là dịch hại nguy hiểm nhất do thuốc lá ñược trồng nhiều năm và không luân canh với lúa nước

ðỗ Tấn Dũng (1998) [3] ñã tiến hành nghiên cứu khá ñầy ñủ về tình hình bệnh héo xanh vi khuẩn hại trên một số cây trồng ở ngoại thành Hà Nội và vùng phụ cận Tác giả ñã nghiên cứu những ảnh hưởng của một số yếu tố sinh thái ñến

sự phát sinh, phát triển của bệnh như thời vụ gieo trồng, chế ñộ luân canh, ảnh hưởng của ñịa thế ñất ñai ñến bệnh héo xanh vi khuẩn, Trong thí nghiệm phòng trừ bệnh héo xanh vi khuẩn hại cà chua ngoài ñồng ruộng bằng thuốc hoá học và chất kháng sinh tác giả ñã ñưa ra kết luận: " trong một số trường hợp cần thiết có thể sử dụng thuốc Streptomycine 200ppm, Validacin 0,3% ñể phun phòng trừ nhằm hạn chế sự phát sinh và gây hại của bệnh héo xanh vi khuẩn trên

cà chua” Tác giả cũng khuyến cáo nên dùng vi khuẩn ñối kháng như Bacillus

subtilis và Pseudomonas fluorescens ñể xử lý bằng cách nhúng rễ cây cà chua

trước khi trồng sẽ có tác dụng hạn chế khả năng xâm nhiễm, phát sinh phát triển của bệnh héo xanh vi khuẩn

Lê Lương Tề và ctv (1999) [7] cho rằng bệnh héo xanh vi khuẩn phát sinh

ở các giai ñoạn sinh trưởng của cây, cao ñiểm của bệnh là thời ñiểm cây ra hoa, cho quả non, sau ñó bệnh giảm dần ở giai ñoạn quả già Ảnh hưởng của phân bón, vôi và ka li có tác dụng hạn chế tác hại của bệnh

Nguyễn Thị Yến và ctv (2002) [12] trong khi nghiên cứu thành phần nòi biovar vi khuẩn gây bệnh héo xanh trên cây trồng cạn ñã thu ñược kết quả: các isolate vi khuẩn héo xanh thu thập ñược từ các vùng trồng cà chua, khoai tây ở miền Bắc Việt Nam chủ yếu thuộc biovar 3 Các isolate thu thập trên lạc chủ yếu thuộc biovar 3 và 4, các biovar 3 và 4 ñều gây bệnh trên cà chua, khoai tây, thuốc lá và cà

Trong nghiên cứu và thử nghiệm chế phẩm vi sinh vật ñối kháng vi khuẩn

R solanacearum gây bệnh héo xanh trên cà chua của Lê Như Kiểu và ctv (2002)

[5], các tác giả ñã có kết quả thử nghiệm trên ñồng ruộng phạm vi hẹp, tỷ lệ sống sót của cà chua là 75% ñối với công thức xử lý chế phẩm vi khuẩn ñối kháng V58, trong khi ñó ở công thức ñối chứng tỷ lệ sống sót của cà chua chỉ còn 20%

Lê Lương Tề và ctv (2002) [8], bằng kỹ thuật PCR và ñánh giá tính kháng bệnh héo xanh của một số giống cà chua, các tác giả ñã phát hiện ñược vi khuẩn

R solanacearum phân lập từ cây cà chua có triệu chứng héo xanh ñiển hình thu

thập từ 6 tỉnh miềm Bắc và xác ñịnh ñược các dòng/ giống cà chua có nguồn gen CRA66, CRA-84-26-3, UPCA1169, PT127805A và nhóm Hawaii 7997 là những giống có tính kháng cao - trung bình, có nhiều triển vọng trong công tác chọn tạo giống cà chua kháng bệnh héo xanh vi khuẩn

Theo kết quả khảo sát bệnh héo rũ do vi khuẩn và nấm trên một số giống lạc kháng bệnh tại huyện Bố Trạch (Quảng Bình) của tác giả Lê Hồng Viễn (2003) [11]: các giống lạc ñưa vào thí nghiệm ở vùng gò ñồi huyện Bố Trạch ñều

có mức ñộ nhiễm bệnh héo rũ thấp, các giống lạc như MD7, 11505 và L02 có năng suất cao có thể ñưa vào sản xuất thay thế cho giống lạc Sen ở ñịa phương

Theo kết quả nghiên cứu của Chu Văn Chuông (2005) [1], tỷ lệ bệnh héo xanh vi khuẩn trên cà chua ở ñồng bằng Sông Hồng vụ ñông sớm và vụ xuân hè dao ñộng từ 13 – 28%, vụ ñông dao ñộng từ 10 – 18% Sử dụng các giống cà chua mang gen kháng và ghép cà chua trên gốc cà tím kháng héo xanh sẽ mang lại hiệu quả tốt trong phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn Ngoài ra, tác giả cũng ñề xuất một quy trình phòng trừ tổng hợp bệnh héo xanh vi khuẩn hại cà chua

3.1 ðối tượng, ñịa ñiểm nghiên cứu

3.1.1 ðối tượng nghiên cứu

Loài vi khuẩn héo xanh R solanacearum gây hại trên một số cây

trồng như cà chua, lạc, thuốc lá, ớt, cà pháo, khoai tây tại vùng Hà Nội và phụ cận

3.1.2 ðịa ñiểm nghiên cứu

Các vùng trồng cà chua, lạc, thuốc lá, ớt, cà pháo, khoai tây tại vùng Hà Nội và phụ cận

Phòng thí nghiệm và nhà lưới Trung tâm nghiên cứu Bệnh cây nhiệt ñới - ðại học Nông nghiệp Hà Nội

3.2 Vật liệu nghiên cứu

Các mẫu vi khuẩn phân lập từ các cây trồng cà chua, lạc, thuốc lá, ớt, cà

pháo, khoai tây, mướp ñắng tại vùng Hà Nội và phụ cận

Dụng cụ, trang thiết bị nghiên cứu: tủ ñịnh ôn, các dụng cụ thí nghiệm: ñĩa petri, ống nghiệm, bình tam giác, que cấy vi khuẩn và một số hoá chất, trang thiết bị cần thiết cho công tác nghiên cứu

Một số môi trường nuôi cấy vi khuẩn:

* Môi trường PDA (Potato Dextrose Agar)

Thành phần:

Khoai tây: 250g

ðường glucose: 20g

Agar : 20g Nước cất : 1000ml

* Môi trường TZC (Triphenyl Tetrazolium Chloride) (Kelman A., 1954) (dẫn

* Môi trường SPA (Sucrose Pepton Agar) [28]

* Môi trường kiểm tra Biovar [28]

Thành phần:

NH4H2PO4 :1g KCL : 0,2g

MgSO4.7H2O : 0,2g

Bromothymol blue 1%: 0,3ml Agar : 0,5g Nước cất : 1 lắt

Chuẩn ựộ pH 7,1 Sau ựó phân vào mỗi ống nghiệm 4,5 ml Hấp

vô trùng ở nhiệt ựộ 1210C; 1,5 atm khoảng 15 phút để nhiệt ựộ môi trường xuống còn 550C, bổ sung vào môi trường 0,5 ml dung dịch vô trùng nguồn Carbonhydrates 10%

Nguồn vi khuẩn gây bệnh ựược phân lập trên một số cây trồng cạn tại vùng Hà Nội và phụ cận

3.3 Nội dung nghiên cứu

- điều tra tnh hình bệnh héo xanh vi khuẩn (R solanac arum) trên một số c y trồng cạn tại vùng Hà Nội và phụ cận vụ hè thu 2007 và vụ xuân hè 2008

- Nghiên cứu loài vi khuẩn héo xanh R solanacearum trên một số cây trồng cạn bằng c c phản ứng sinh hoá và kĩ thuật sinh học phân tử

- đánh giá ựộc tnh của cá dòng vi khuẩn héo xanh R solanac arum phân lập ựược trên cá c y ký chủ khá nhau

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Phương pháp ựiều tra bệnh héo xanh vi khuẩn trên ựồng ruộng

điều tra bệnh héo xanh vi khuẩn dựa theo tài l ệu của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (2001) và Tiêu chuẩn ngành 10 TCN T

224-2003 (2003) [9], [10]

ðiều tra t nh hình bệnh héo xanh vi khuẩn hại trên một số c y trồng cạn tại vùng Hà Nội và phụ cận Chọn vùng ñại diện về ñiều kiện sinh thái ðiều tra theo phương pháp 5 ñiểm chéo góc, mỗi ñiểm 50 c y ðiều tra diễn biến của bệnh héo xanh vi khuẩn ñịnh kỳ 7 ngày một lần.

A : Tổng số cây bị nhiễm bệnh héo xanh vi khuẩn

B : Tổng số cây ñiều tra

3.4.2 Những nghiên cứu trong phòng thí nghiệm

3.4.2.1 Phương pháp phân lập [28], [40]

Mẫu bệnh có triệu chứng bệnh héo xanh vi khuẩn ñiển hình trên ñồng ruộng Rửa sạch mẫu bệnh dưới vòi nước Từ mẫu c y bệnh cắt những ñoạn gốc thân nhiễm bệnh, khử trùng ñoạn thân bằng cồn 700 Sau ñó,ngâm ñoạn thân vào trong cốc nước vô trùng, quan sát thấy dòng dịch vi khuẩn màu trắng sữa thôi ra

từ mẫu bệnh, sau 20 phút loại bỏ ñoạn thân bị nhiễm bệnh ra khỏi dịch vi khuẩn

Sử dụng que cấy vi khuẩn lấy một vòng que cấy dịch vi khuẩn cấy vào môi trường SPA Nuôi cấy ở nhiệt ñộ 280C ± 2 Khi vi khuẩn phát triển thành c c khuẩn lạc ñơn, cấy chuyển sang môi trường nuôi cấy khác

Hoặc từ mẫu bệnh có triệu chứng héo xanh vi khuẩn ñiển hình, lựa chọn

mô bệnh ñặc trưng Khử trùng bề mặt mô bệnh bằng cồn 700 (hoặc dung dịch NaClO2 1%) từ 2-3 phút Rửa lại mô bệnh bằng nước vô trùng Sử dụng dao mổ

vô trùng cắt mô bệnh thành những mẫu nhỏ có kích thước từ 5 x 6 mm Sau ñó

dùng panh vô trùng cấy những mẫu nhỏ vào môi trường SPA Nuôi cấy ở nhiệt

ñộ 280C ± 2.Khi vi khuẩn phát triển cấy chuyển sang môi trường nuôi cấy khá

3.4.2.2 Phương pháp nuôi cấy

Nuôi cấy vi khuẩn trên cá môi trường SPA,TZC trong ñiều kiện nhiệt ñộ

280C ± 2, theo dõi sự phát triển của khuẩn lạc sau 24,48 giờ và 72 giờ.Bảo quản

vi khuẩn thuần trong tube nước vô trùng 1,5 ml ñể ở nhiệt ñộ phòng sử dụng cho

ñộ phát triển của vi khuẩn sau 24, 48 và 72 giờ nuôi cấy

3.4.2.4 Ảnh hưởng của các ngưỡng nhiệt ñộ ñến sự phát triển của khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập

Các dòng vi khuẩn phân lập ñược trên các cây trồng (cà chua, thuốc lá, khoai tây, lạc, cà, ớt, mướp ñắng) ñược nuôi cấy trên môi trường SPA ðặt ở các ngưỡng nhiệt ñộ 20, 25, 30, 350C Mỗi công thức nhắc lại 5 lần Theo dõi sự phát triển của khuẩn lạc vi khuẩn sau 24, 48 và 72 giờ nuôi cấy

3.4.2.5 Nghiên cứu các ñặc tính sinh hoá của các dòng vi khuẩn gây bệnh héo

xanh

Khả năng phân giải các hợp chất cacbon: Các loại ñường như Maltose, Cellobiose, Lactose; các loại rượu mạch vòng như Mannitol, Sorbitol, Dulcitol

ðiều chế các loại môi trường ñể khảo sát các phản ứng sinh hoá Dựa theo tài liệu của Lelliott và cộng tác viên (1987) và Denny và Hayward (2005) [28], [19]

Các isolate vi khuẩn thuần, ñược cấy trên môi trường SPA Sau ñó, dùng que cấy lấy một vòng vi khuẩn cấy vào các ống nghiệm ñã chuẩn bị sẵn các nguồn cacbon Mỗi phản ứng ñược nhắc lại 3 lần Theo dõi sự phát triển của vi khuẩn trên môi trường lỏng và sự chuyển màu của môi trường của từng phản ứng sau 5 – 7 ngày

3.4.2.6 Phương pháp kiểm tra vi khuẩn héo xanh bằng kỹ thuật PCR

* Phương pháp chiết DNA tổng số của vi khuẩn

Nuôi các isolate vi khuẩn trên môi trường SPA trong ống nghiệm 48 giờ Thêm vào mỗi ống nghiệm 3 ml nước cất vô trùng lắc nhẹ ống nghiệm ñể vi khuẩn tan ñều vào trong nước, thu ñược dung dịch vi khuẩn Ly tâm nhẹ 3 phút, thu cặn vi khuẩn Rửa cặn vi khuẩn 2 lần bằng ñệm TNE, hoà cặn vi khuẩn bằng 1ml ñệm TNE, thu ñược dung dịch vi khuẩn Chia lượng dung dịch vi khuẩn thu ñược vào mỗi tube là 500 µl dung dịch vi khuẩn sử dụng cho việc chiết DNA tổng số

- Phương pháp 1: ðun sôi:

Bước 1 Lấy 500 µl dung dịch vi khuẩn hoà trong ñệm TNE

Bước 2 ðun sôi 5 phút ở nhiệt ñộ 1000C

Bước 3 Cho thêm vào trong tube 500 µl Chloroform/isoamyl alcohol, lắc ñều

Bước 4 Ly tâm bằng máy ly tâm ñể bàn 5 phút, thu 450 µl dịch phía trên chuyển sang tube mới

Bước 5 Chiết lại lần 2 bằng Chloroform/isoamyl alcohol lượng tương ñương như bước 3 và bước 4, thu 250 µl dịch phía trên chuyển sang tube mới

Bước 6 Cho thêm vào tube 250 µl isopropanol lạnh, ñảo ñều, sau ñó ñể lạnh 00C trong khoảng 15- 30 phút

Bước 7 Ly tâm bằng máy ly tâm ñể bàn 10 phút, thu cặn DNA tổng số Bước 8 Rửa cặn 2 lần bằng cồn 700

Bước 9 ðể cặn DNA khô tự nhiên ở nhiệt ñộ phòng trong vòng 30 phút Bước 10 Hoà tan cặn DNA bằng 25 µl nước cất vô trùng, bảo quản ở nhiệt ñộ -200C

- Phương pháp 2: Chiết bằng CTAB 2%:

Bước 1 Lấy 500 µl dung dịch vi khuẩn hoà trong ñệm TNE

Bước 2 Ly tâm bằng máy ly tâm ñể bàn 2 phút, thu cặn vi khuẩn

Bước 3 Cho vào tube 200 µl CTAB 2%, sử dụng chày nhựa nghiền 3-5 phút, sau ñó thêm vào tube 300 µl CTAB 2%

Bước 4 ðun ở nhiệt ñộ 650C, trong vòng 5 phút

Bước 5 Cho thêm vào trong tube 500 µl Chloroform/isoamyl alcohol, lắc ñều

Bước 6 Ly tâm bằng máy ly tâm ñể bàn 5 phút, thu 450 µl dịch phía trên chuyển sang tube mới

Bước 7 Chiết lại lần 2 bằng Chloroform/isoamyl alcohol lượng tương ñương như bước 5 và bước 6, thu 250 µl dịch phía trên chuyển sang tube mới

Bước 8 Cho thêm vào tube 250 µl isopropanol lạnh, ñảo ñều, sau ñó ñể lạnh 00C trong khoảng 15- 30 phút

Bước 9 Ly tâm bằng máy ly tâm ñể bàn 10 phút, thu cặn DNA tổng số Bước 10 Rửa cặn 2 lần bằng cồn 700

Bước 11 ðể cặn DNA khô tự nhiên ở nhiệt ñộ phòng trong vòng 30 phút Bước 12 Hoà tan cặn DNA bằng 25 µl nước cất vô trùng, bảo quản ở nhiệt ñộ -200C

3.4.3 Những nghiên cứu trong nhà lưới

3.4.3.1 Phương pháp lây bệnh nhân tạo

Lây bệnh nhân tạo bệnh héo xanh vi khuẩn dựa theo phương pháp sát thương rễ.

Cây con ñược trồng trong chậu nhựa kích thước 20 x 20cm, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần 5 c y.Cây con sau khi trồng ñược 3 tuần tuổi (4-5 lá thật),dùng dao vô trùng sát thương rễ phụ 2/3 xung quanh gốc sâu 2cm Sau ñó tưới 30ml dịch vi khuẩn có nồng ñộ 108 CFU/ml ðặt cây vào trong nhà lưới c ch ly chăm sóc, ñảm bảo ñiều kiện râm mát nhiệt ñộ từ 25 – 300C, ẩm ñộ của ñất vừa phải Theo dõi sự nhiễm bệnh héo xanh từ 4 – 6 tuần

3.4.3.2 Phương pháp thử phản ứng siêu nhạy trên cây thuốc lá của các dòng vi khuẩn gây bệnh

Thí nghiệm ñược tiến hành trên thuốc lá với 10 dòng vi khuẩn ñược phân lập từ 6 loài cây ký chủ

Tiêm dịch vi khuẩn R solanacearum với liều lượng 0,1 ml/lá thuốc lá

Quan sát, theo dõi kích thước các ñốm hoại tử có màu nâu xám sau 24, 48,

72 giờ

3.4.4 Xử lý số liệu

Số liệu ñược xử lý thống kê sinh học theo phần mềm IRRI start

4.1 Tình hình bệnh héo xanh vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith trên

một số cây trồng cạn vùng Hà nội và phụ cận vụ hè thu 2007 và vụ xuân hè

2008

Bệnh héo xanh vi khuẩn là bệnh có phạm vi ký chủ rộng, phân bố rộng rãi

trên thế giới Vi sinh vật gây bệnh tồn tại trong tàn dư cây bệnh, trong ñất và trong vật liệu giống bị nhiễm bệnh Những yếu tố sinh thái như nhiệt ñộ, ẩm ñộ

và kỹ thuật canh tác, ảnh hưởng rất lớn ñến sự phát sinh, phát triển của bệnh

ngoài ñồng ruộng Bệnh héo xanh vi khuẩn thường phát triển mạnh trên những giống mẫn cảm, ñặc biệt là khi gặp ñiều kiện thuận lợi như nhiệt ñộ không khí cao (lớn hơn 250C) kết hợp với ẩm ñộ cao

Qua ñiều tra tình hình gây hại và mức ñộ phổ biến của bệnh héo xanh vi khuẩn trên một số cây trồng cạn tại vùng Hà Nội và phụ cận vụ hè thu 2007 (bảng 4.1) và vụ xuân hè 2008 (bảng 4.2)

Bảng 4.1 Tỷ lệ bệnh héo xanh vi khuẩn gây hại trên một số cây trồng vùng

ðâm tia, hình thành

Lạc

Thuốc lá

Lạng Giang, Bắc Giang Sinh trưởng 2,19

B¶ng 4.2 Tû lÖ bÖnh hÐo xanh vi khuÈn g©y h¹i trªn mét sè c©y trång vïng

Hµ Néi vµ phô cËn vô xu©n hÌ 2008

Cây trồng Địa điểm điều tra Giai đoạn sinh

trưởng

Tỷ lệ bệnh (%)

Cà pháo

Gia Lâm, Hà Nội Đâm tia, quả non 0,48 Lạc

Tiên Lữ, Hưng Yên Đâm tia, quả non 2,26

Từ kết quả điều tra tình hình bệnh héo xanh vi khuẩn gây hại trên một số cây trồng vụ hè thu 2007 và vụ xuân hè 2008 tại vùng Hà Nội và phụ cận Chúng tôi nhận thấy, bệnh héo xanh vi khuẩn là bệnh hại phổ biến, phát sinh gây hại ở hầu hết các vùng trồng cà chua, lạc, thuốc lá, cà pháo, ớt, Tùy theo từng loài cây trồng, đặc điểm của giống, cơ cấu luân canh, chân đất, mà mức độ gây hại của bệnh là khác nhau Vụ hè thu năm 2007, tại các vùng chúng tôi điều tra đều thấy xuất hiện bệnh héo xanh trên các cây trồng như cà chua, cà pháo, thuốc lá, lạc, ớt với tỷ lệ gây hại khác nhau trên từng loài cây trồng Trên cà pháo, cùng ở giai đoạn cho quả vùng Đông Anh (Hà Nội) tỷ lệ nhiễm bệnh héo xanh là 6,70% còn vùng Gia Lâm (Hà Nội) có tỷ lệ nhiễm bệnh là 5,23% Trên lạc, ở giai đoạn

đâm tia, hình thành quả non tỷ lệ nhiễm bệnh héo xanh ở vùng Thuận Thành (Bắc Ninh) là 0,18%; ở giai đoạn quả chắc tỷ lệ nhiễm bệnh ở vùng Đông Anh (Hà Nội) là 0,40% Trên thuốc lá, cùng ở giai đoạn sinh trưởng tỷ lệ nhiễm bệnh héo xanh ở Ba Vì (Hà Tây) là 0,97%; ở Lạng Giang (Bắc Giang) là 2,19% Trên

ớt, tại Đông Anh (Hà Nội) tỷ lệ nhiễm bệnh héo xanh là 4,76% ở giai đoạn cho quả Qua điều tra tình hình bệnh héo xanh gây hại trên một số cây trồng tại một

số vùng thuộc Hà Nội, Bắc Ninh, Bắc Giang, Hà Tây vụ hè thu 2007, chúng tôi nhận thấy rằng bệnh héo xanh vi khuẩn gây hại trên các cây trồng ở vùng Đông Anh (Hà Nội) có tỷ lệ gây hại cao hơn so với các vùng khác, do vùng Đông Anh

là vùng chuyên canh rau, quanh năm có cây ký chủ của bệnh héo xanh vi khuẩn trên đồng ruộng

Vụ xuân hè 2008, tỷ lệ gây hại của bệnh héo xanh cụ thể: trên cà pháo, ở giai đoạn cho quả tỷ lệ bệnh héo xanh vi khuẩn là 7,50% ở vùng Gia Lâm (Hà Nội); 8,40% ở vùng Đông Anh (Hà Nội); 5,70% ở vùng Văn Đức (Hưng Yên); 7,20% ở vùng Văn Giang (Hưng Yên); 7,25% ở vùng Tiên Lữ (Hưng Yên) Trên lạc, cùng ở giai đoạn đâm tia, hình thành quả non tỷ lệ bệnh héo xanh vi khuẩn là 0,48% ở Gia Lâm (Hà Nội); 2,26% ở Tiên Lữ (Hưng Yên)

Qua kết quả điều tra tình hình gây hại của bệnh héo xanh vi khuẩn trên một số cây trồng ở một số vùng thuộc Hà Nội và phụ cận chúng tôi nhận thấy rằng tùy theo từng loài cây trồng, đặc điểm của giống, cơ cấu luân canh, chân

đất, mà mức độ gây hại của bệnh cũng khác nhau

Như vậy, ở các giai đoạn sinh trưởng khác nhau của cây trồng sự gây hại của bệnh héo xanh vi khuẩn là có sự biến động? Chúng tôi tiến hành điều tra sự gây hại của bệnh héo xanh vi khuẩn ở các giai đoạn sinh trưởng khác nhau của cây cà pháo tại một số vùng thuộc Hà Nội và phụ cận (bảng 4.3 và đồ thị 4.1)

B¶ng 4.3 Tû lÖ bÖnh hÐo xanh vi khuÈn g©y h¹i c¸c giai ®o¹n sinh tr−ëng

trªn cµ ph¸o, t¹i c¸c vïng ®iÒu tra vô xu©n hÌ 2008

§Þa ®iÓm

®iÒu tra

Tû lÖ bÖnh ë c¸c giai ®o¹n sinh tr−ëng (%)

C©y con B¾t ®Çu ra

Tû lÖ bÖnh

ð a Tốn - Gia Lâm

Văn ðức - Gia Lâm

Văn Giang Hưng Yên

Tiên Lữ Hưng Yên

-§ Þa ®iÓm ®iÒu tra

Tû lÖ bÖnh hÐo xanh ë c¸c giai ®o¹n trªn cµ ph¸o

Cây con Bắt ñầu ra hoa Quả non Thu quả lứa 1

§å thÞ 4.1 Tû lÖ bÖnh hÐo xanh vi khuÈn g©y h¹i c¸c giai ®o¹n sinh tr−ëng cña

c©y cµ ph¸o t¹i c¸c vïng ®iÒu tra vô xu©n hÌ 2008

Qua điều tra tỷ lệ bệnh héo xanh gây hại ở các giai đoạn sinh trưởng của

cà pháo chúng tôi nhận thấy: ở giai đoạn cây con hầu như không bị nhiễm bệnh ở tất cả các vùng chúng tôi điều tra, bệnh héo xanh bắt đầu xuất hiện, gây hại khi cây bắt đầu ra hoa và gây hại mạnh nhất vào giai đoạn cho quả tại các vùng điều tra với tỷ lệ 9,60% ở Đa Tốn, Gia Lâm (Hà Nội); 3,60% ở Văn Đức (Hưng Yên); 4,80% ở Văn Giang (Hưng Yên); 6,80% ở Tiên Lữ (Hưng Yên) Bệnh héo xanh

có xu hướng giảm dần khi cây bước vào giai đoạn già Như vậy, giai đoạn sinh trưởng của cây cũng ảnh hưởng đến tình hình phát sinh, phát triển của bệnh héo xanh vi khuẩn Tại các vùng điều tra, hầu hết các cây trồng bị nhiễm bệnh héo xanh vi khuẩn đều từ giai đoạn ra hoa trở đi, trong đó, bệnh gây hại mạnh và tập trung là giai đoạn quả non Kết quả điều tra diễn biến bệnh héo xanh vi khuẩn gây hại trên cà pháo ở các giai đoạn sinh trưởng tại một số vùng thuộc Hà Nội và phụ cận cho kết quả phù hợp với kết quả công bố của Đỗ Tấn Dũng (1998)

Qua điều tra tình hình bệnh héo xanh vi khuẩn gây hại trên một số cây trồng cạn vùng Hà Nội và phụ cận chúng tôi nhận thấy bệnh gây hại rất nghiêm trọng trên tất cả các giống cà chua đang trồng ngoài sản xuất

Cà chua là cây trồng có giá trị kinh tế cao, được trồng khắp nơi trong cả nước Diện tích trồng cà chua ngày càng được mở rộng, đặc biệt là các vùng chuyên canh rau màu khu vực ven đô Nhiều giống cà chua có năng suất cao, phẩm chất tốt đp được đưa vào sản xuất như các giống cà chua nhập khẩu của Ba

Lan, Pháp, Mỹ, tuy nhiên, bệnh héo xanh vi khuẩn do Ralstonia solanacearum

gây ra là một trong những trở ngại đối với các vùng sản xuất hiện nay

B¶ng 4.4 T×nh h×nh bÖnh hÐo xanh vi khuÈn g©y h¹i trªn c¸c gièng cµ chua trång t¹i mét sè vïng thuéc Hµ Néi vµ phô cËn vô hÌ thu n¨m 2007

§Þa ®iÓm ®iÒu tra Gièng Giai ®o¹n ®iÒu tra Tû lÖ

bÖnh (%)

Cµ chua nhãt Ra hoa -qu¶ non 0,76 V©n Néi, §«ng Anh, Hµ Néi

§a Tèn, Gia L©m, Hµ Néi Cµ chua nhãt Qu¶ non 0.70

Cµ chua Ph¸p Qu¶ non 2,76

Cæ Bi, Gia L©m, Hµ Néi

B¶ng 4.5 T×nh h×nh bÖnh hÐo xanh vi khuÈn g©y h¹i trªn mét sè gièng

cµ chua trång t¹i mét sè vïng thuéc Hµ Néi vµ phô cËn vô xu©n hÌ 2008

§Þa ®iÓm ®iÒu tra Gièng Giai ®o¹n ®iÒu tra Tû lÖ

bÖnh (%)

3500 Ra hoa- qu¶ non 17,86 Xanh- pie Ra hoa- qu¶ non 23,21

Cæ Bi, Gia L©m, Hµ Néi

§µi Loan Ra hoa- qu¶ non 44,64

Xanh- pie Ra hoa- qu¶ non 19,64

§a Tèn, Gia L©m, Hµ Néi

VL2000 Ra hoa- qu¶ non 19,64

§«ng Anh, Hµ Néi

Cµ chua nhãt Qu¶ non 19,64

§Æng X¸, Gia L©m, Hµ Néi Xanh- pie Qu¶ non 16,07

Kết quả bảng 4.4 và 4.5 cho thấy bệnh héo xanh vi khuẩn gây hại rất phổ biến các vùng trồng cà chua Tùy theo các chân đất, phương thức canh tác mà có

tỷ lệ gây hại khác nhau Năm 2007, cùng trên giống cà chua Mỹ ở Đông Anh (Hà Nội) có tỷ lệ nhiễm bệnh héo xanh là 0,97%, ở Văn Giang (Hưng Yên) là 1,36%,

ở Mê Linh (Vĩnh Phúc) là 4,63%, ở Gia Lâm có tỷ lệ là 69,57% Vụ xuân hè

2008, tỷ lệ nhiễm bệnh héo xanh vi khuẩn trên các giống cà chua tại các vùng

điều tra từ 16,07 % - 44,64% Trên giống cà chua của 3500 tại vùng Cổ Bi, Gia Lâm (Hà Nội) có tỷ lệ nhiễm bệnh héo xanh là 17,86%, tại Đa Tốn, Gia Lâm (Hà Nội) là 26,79 % và 39,29%

Qua kết quả điều tra tình hình bệnh héo xanh vi khuẩn gây hại trên cà chua tại một số vùng thuộc Hà Nội và phụ cận vụ hè thu 2007 và vụ xuân hè 2008 chúng tôi nhân thấy, bệnh héo xanh vi khuẩn xuất hiện ở tất cả các vùng điều tra

và gây hại trên tất cả các giống cà chua đang trồng ngoài sản xuất, do các vùng trên đây đều là các vùng có truyền thống trong sản xuất rau màu, cà chua và nhiều cây họ cà khác được trồng quanh năm trên đồng ruộng, vì vậy, nguồn bệnh luôn sẵn có trên đồng ruộng Vụ xuân hè, là vụ có điều kiện thời tiết thuận lợi cho sự phát triển của bệnh Năm 2008, đầu vụ xuân hè thời tiết khô và lạnh, nhưng càng về sau nhiệt độ và ẩm độ tăng dần, đặc biệt vào khoảng cuối tháng 3

đầu tháng tư nhiệt độ tăng, trời nắng kèm theo các cơn mưa đầu mùa xen kẽ Thời điểm này cũng trùng với giai đoạn cà chua ra hoa và cho quả lứa đầu, đây cũng là giai đoạn mẫm cảm nhất của cây cà chua với bệnh héo xanh vi khuẩn Ngoài ra, tập quán canh tác của bà con nông dân ở các vùng trồng rau này đều sử dụng phương pháp tưới rpnh, đây là nguyên nhân giúp cho vi khuẩn héo xanh lan truyền và gây hại mạnh trên đồng ruộng

Trên các giống cà chua chúng tôi điều tra, chúng tôi thấy rằng mức độ nhiễm bệnh héo xanh trên các giống là khác nhau giữa các vùng chúng tôi điều