M L1 L2 L3 L4 L
4.4.1.Thử phản ứng siờu nhạy của cỏc dũng vi khuẩn gõy bệnh hộo xanh phõn lập trờn cõy thuốc lỏ (Nicotiana tabacum)
phõn lập trờn cõy thuốc lỏ (Nicotiana tabacum)
Thử phản ứng siờu nhạy là một trong những phương phỏp giỳp xỏc ủịnh nhanh ủộc tớnh của cỏc vi khuẩn gõy bệnh hộo xanh. Sau khi phõn lập ủược vi khuẩn R. solanacearum thuần, chỳng tụi tiến hành kiểm tra tớnh ủộc của cỏc dũng vi khuẩn trờn cõy thuốc lỏ Nicotiana tabacum bằng phản ứng siờu nhạỵ Sau 24, 48 và 72 giờ tiờm chủng nếu thấy cú xuất hiện ủỏm mụ hoại tử màu nõu xỏm, thỡ chứng tỏ vi khuẩn phõn lập ủược là loài ký sinh gõy bệnh vẫn cũn ủộc tớnh.
Cỏc dũng vi khuẩn thuần ủược phõn lập từ cỏc mẫu vi khuẩn gõy hộo xanh trờn cà chua, thuốc lỏ, lạc, mướp ủắng, khoai tõy, cà, ớt ủược nuụi cấy trờn mụi trường bề mặt nghiờng SPA trong 48 giờ. Pha dịch vi khuẩn trong nước cất vụ trựng với nồng ủồ 108 CFU/1ml. Sử dụng 0,1 ml tiờm vào lớp trong của tế bào biểu bỡ (khoảng gian bào) của mặt dưới phiến lỏ của cõy thuốc lỏ. Theo dừi và quan sỏt sự biểu hiện của phản ứng sau 24, 48 và 72 giờ
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………68 a b
Ảnh 4.5. Kết quả kiểm tra biovar - khả năng oxy hoỏ 3 loại ủường và 3 loại rượu
ạ biovar 3 b. chưa xỏc ủịnh ủược biovar
Ảnh 4.6. Vi khuẩn Ralstonia solanacearumủược nuụi cấy trờn mụi trường TZC
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………69
.Bảng 4.18. Kết quả kiểm tra phản ứng siờu nhạy của cỏc dũng vi khuẩn phõn lập trờn cõy thuốc lỏ Nicotiana tabacum
TT Dũng vi khuẩn Biểu hiện phản ứng siờu nhạy 1 CC3 + 2 TL + 3 KT1 + 4 Mð + 5 CC2 + 6 CC4 + 7 KT2 + 8 CP + 9 KT3 + 10 L + 11 ðối chứng - Ghi chỳ: +: cú tạo phản ứng siờu nhạy -: khụng tạo phản ứng siờu nhạy
Trong 10 dũng vi khuẩn phõn lập ủem kiểm tra phản ứng siờu nhạy, ủều cho biểu hiện triệu chứng ủú là cỏc dũng vi khuẩn ủược phõn lập từ cà chua (Gia Viễn, Ninh Bỡnh), cà chua (Trõu Quỳ, Gia Lõm, Hà Nội), cà chua (Kỳ Sơn, Hũa Bỡnh), khoai tõy (Tõn Lạc, Hũa Bỡnh), khoai tõy (Thành phố Lạng Sơn), khoai tõy (Lộc Bỡnh, Lạng Sơn), lạc (Ba Vỡ, Hà Tõy), thuốc lỏ (Ba Vỡ, Hà Tõy), cà phỏo (Hưng Hà, Thỏi Bỡnh) và mướp ủắng (Kim Bụi, Hoà Bỡnh). Sau khi tiờm chủng lờn cõy thuốc lỏ cỏc dũng vi khuẩn gõy bệnh hộo xanh ủều biểu hiện: sau
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………70
24 – 48 giờ, cỏc dũng vi khuẩn cú ủộc tớnh sẽ thấy xuất hiện cỏc vết hoại tử, sau 3 – 4 ngày vết mụ hoại tử này sẽ khụ và chuyển thành màu trắng xỏm. Cỏc dũng vi khuẩn ủó mất ủộc tớnh sẽ khụng tạo vết hoại tử khi tiến hành tiờm chủng kiểm tra phản ứng siờu nhạỵ
Vi khuẩn hộo xanh R. solanacearum là loài vi khuẩn xõm nhiễm mang tớnh chất thụ ủộng, khụng cú khả năng xõm nhập trực tiếp qua biểu bỡ và bề mặt mụ thực vật cũn nguyờn vẹn, chỳng xõm nhập chủ yếu vào cõy trồng qua cỏc lỗ hở tự nhiờn của cõy như khớ khổng, thủy khổng, bỡ khổng của củ và qua cỏc vết thương xõy sỏt trong quỏ trỡnh chăm súc, tỉa tỏn và một phần do tuyến trựng, cụn trựng.
Trờn thế giới, người ta sử dụng nhiều phương phỏp khỏc nhau ủể ủỏng giỏ tớnh nhiễm, tớnh khỏng của bệnh hộo xanh vi khuẩn của một số cõy trồng. Qua cỏc phương phỏp lõy nhiễm ủược cỏc tỏc giả ủề cập ủến như phương phỏp tiờm nỏch lỏ, phương phỏp sỏt thương rễ, phương phỏp nhỳng rễ và phương phỏp nhiễm hạt ở mật ủộ vi khuẩn 108 – 109 CFU/ml. Theo kết quả nghiờn cứu của tỏc giả ðỗ Tấn Dũng (1998) trong 4 phương phỏp lõy nhiễm nhõn tạo thỡ phương phỏp tiờm nỏch lỏ và phương phỏp sỏt thương rễ là hai phương phỏp lõy nhiễm cú tỷ lệ cõy hộo cao nhất, cũn phương phỏp nhiễm hạt cú tỷ lệ cõy hộo là thấp nhất. Trong thớ nghiệm của ủề tài, ủể khảo sỏt tớnh gõy bệnh của cỏc dũng vi khuẩn phõn lập ủược chỳng tụi ủó sử dụng phương phỏp sỏt thương rễ.