Điều tra nghiên cứu bệnh virus khảm lá cà chua (tomato mosaic virus ToMV) và bệnh virus khảm lá khoai tây (potato virus x PVX) trên cà chua vụ đông xuân 2005 2006 tại huyện an lão, hải phòng

Điều tra nghiên cứu bệnh virus khảm lá cà chua (tomato mosaic virus ToMV) và bệnh virus khảm lá khoai tây (potato virus x PVX) trên cà chua vụ đông xuân 2005 2006 tại huyện an lão, hải phòng

Bộ giáo dục và đào tạo trường đại học nông nghiệp I

-

bùi cảnh đức

Điều tra nghiên cứu bệnh virus khảm lá cà chua

(Tomato Mosaic virus – ToMV) và bệnh virus khảm lá

khoai tây (Potato virus X – PVX) trên cà chua

vụ đông xuân 2005 - 2006 tại huyện An L∙o, Hải Phòng

Luận văn thạc sĩ nông nghiệp

Chuyên ngành: Bảo vệ thực vật Mã số: 60.62.10

Người hướng dẫn khoa học: Gs.tS vũ triệu mân

Hà Nội - 2006

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và ch−a từng đ−ợc ai công bố trong bất cứ công trình nào khác

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ trong việc thực hiện luận văn này đã đ−ợc cám ơn và thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã d−ợc chỉ rõ nguồn gốc

Tác giả

Bùi Cảnh Đức

Lời cảm ơn Để hoàn thành đề tài này, ngoài sự cố gắng của bản thân Tác giả luôn nhận được quan tâm sâu sắc, tận tình tỉ mỉ và chu đáo của Thầy giáo, Giáo sư – Tiến sĩ: Vũ Triệu Mân Xin gửi Thầy lời biết ơn sâu sắc và kính trọng

Xin chân thành cám ơn tới tập thể các Thầy giáo, Cô giáo, các cán bộ nhân viên Khoa Sau Đại học và Khoa Nông học đã quan tâm chỉ bảo và luôn tạo mọi điều kiện tốt nhất để chúng tôi có nhiều cơ hội nâng cao kiến thức mọi mặt

Xin chân thành cám ơn tập thể cán bộ nghiên cứu của Trung tâm Bệnh cây nhiệt đới đã sự nhiệt tình cộng tác và giúp đỡ trong thời gian tác giả thực tập và hoàn thiện luận văn

Xin bày tỏ lòng cám ơn chân thành tới Ban Lãnh Đạo và tập thể cán bộ nhân viên của Trung tâm Phát triển Nông Lâm nghiệp công nghệ cao Thành phố Hải Phòng đã quan tâm mọi mặt và tạo mọi điều kiện tốt nhất để tác giả hoàn thành được quá trình học tập Xin chân thành cám ơn, Lãnh đạo và cán bộ Phòng Trồng trọt và PTNT, Ban Lãnh đạo và tập thể cán bộ Chi cục Bảo vệ thực vật Hải Phòng đã khích lệ, cổ vũ tinh thần cho tác giả trong những năm qua

Cuối cùng, xin chân thành cám ơn tới gia đình, bè bạn người thân, đã động viên tinh thần và giúp đỡ vật chất trong thời gian tác giả theo học, đặc biệt là người vợ đảm đang và hai con trai ngoan, chăm học là nguồn an ủi lớn đối với tác giả

Tác giả luận văn

Bùi Cảnh Đức

Mục lục

2 Tổng quan tài liệu và cơ sở khoa học của đề tài 6

2.2 Những nghiên cứu trong nước 22

3 Đối tượng, địa điểm, vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu 29

4.1 Điều tra đánh giá bệnh virus và khảm lá virus trên cà chua vụ đông

xuân 2005 - 2006 tại An Lão Hải Phòng 37

4.1.1 Tình hình sản xuất cây rau màu và cây cà chua của huyện An Lão

4.1.2 Mức độ gây hại virus trên cà chua vụ đông xuân 2005 - 2006 tại An

4.1.3 Diễn biến triệu chứng bệnh khảm virus trên cà chua vụ đông xuân

4.1.4 Đánh giá ảnh hưởng của bệnh virus ToMV và PVX đến năng suất hai

4.1.5 Kết quả áp dụng phương pháp Indirect - ELISA để kiểm tra nguyên

4.1.6 Triệu chứng cà chua bị nhiễm ToMV và PVX 63 4.1.7 Kết quả lây nhiễm virus trên cây chỉ thị và cây ký chủ phụ trong

Danh mục các chữ viết tắt và ký hiệu

Số thứ tự Ký hiệu viết tắt Tên các chữ viết tắt

11 ELISA Enzyme linked immunosorbent assay

12 DAS -ELISA Double Antibody Sandwich- ELISA

13 Indirect-ELISA Indirect-ELISA

15 LIV Longevity In vitro

16 TIV Thermal Inactivation Point

20 TYLCV Tomato yellow leaf curl virus

24 PLRV Potato leaf roll virus

25 CV (%) Hệ số biến động

26 (LSD 05) Sai khác nhỏ nhất có ý nghĩa 5%

27 IPM Intergated pest management

28 PCR Polymerase Chain Reaction

Danh mục các bảng

Bảng 4.1 Diện tích, thành phần cây rau màu ở huyện An Lão qua một số

năm 38 Bảng 4.2 Kết quả điều tra nông dân về thành phần và mức độ gây hại của

một số bệnh hại chủ yếu trên cà chua tại huyện An Lão Hải Phòng 39 Bảng 4.3 Tỷ lệ bệnh virus trung bình (%) thời vụ sớm trên một số giống cà

chua vụ đông xuân 2005 - 2006 tại An Lão - Hải Phòng 41 Bảng 4.4 Tỷ lệ bệnh virus trung bình (%) thời vụ chính vụ trên một số

giống cà chua vụ đông xuân 2005 - 2006 tại An Lão - Hải Phòng 43 Bảng 4.5 Tỷ lệ bệnh virus trung bình (%) thời vụ muộn trên một số giống

cà chua vụ đông xuân 2005 - 2006 tại An Lão - Hải Phòng 44 Bảng 4.6 Diễn biến triệu chứng bệnh virus trên giống cà chua VL2000 và

giống VL2200 (Mỹ) vụ sớm cà chua vụ đông xuân 2005 - 2006 tại

Bảng 4.7 Diễn biến triệu chứng bệnh virus trên giống cà chua VL2000 và

giống VL2200 thời vụ chính vụ vụ đông xuân 2005 - 2006 tại An

Bảng 4.8 Diễn biến triệu chứng bệnh virus trên giống cà chuaVL2000 và

giống VL2200 (Mỹ) vụ muộn cà chua vụ đông xuân 2005 - 2006

Bảng 4.9 ảnh hưởng của bệnh khảm lá cà chua do virus ToMV đến năng

suất hai giống cà chua VL 2000 và VL 2200 vụ đông xuân 2005 -

Bảng 4.10 ảnh hưởng của bệnh khảm lá cà chua do virus PVX đến năng

suất hai giống cà chua VL 2000 và VL 2200 vụ đông xuân 2005 -

Bảng 4.11 Kết quả kiểm tra ToMV trên một số hạt giống cà chua vụ đông

xuân 2005 - 2006 tại An Lão - Hải Phòng 56 Bảng 4.12 Kết quả kiểm tra ToMV và PVX trên mẫu lá thời vụ sớm một số

giống cà chua vụ đông xuân 2005 - 2006 tại An Lão - Hải Phòng 58 Bảng 4.13 Kết quả kiểm tra virus ToMV và PVX trên mẫu lá thời vụ chính

vụ một số giống cà chua vụ đông xuân 2005 - 2006 tại An Lão Hải Phòng 60 Bảng 4.14 Kết quả kiểm tra virus ToMV và PVX trên mẫu lá thời vụ muộn

một số giống cà chua vụ đông xuân 2005 - 2006 tại An Lão -Hải Phòng 62 Bảng 4.15 Kết quả lây bệnh nhân tạo PVX (potato virus X) bằng phương

Bảng 4.16 Kết quả xác định ký chủ phụ của PVX trên một số cây trồng và

cỏ dại bằng phương pháp lây nhiễm nhân tạo 71 Bảng 4.17 Kết quả lây bệnh nhân tạo ToMV bằng phương pháp cây chỉ

thị 72 Bảng 4.18 Kết quả xác định ký chủ phụ của ToMv trên một số cây trồng và

cỏ dại bằng phương pháp lây nhiễm nhân tạo 75

Danh mục các đồ thị

Đồ thị 4.1: Thành phần, cơ cấu diện tích rau màu năm 2002 - 2005

Đồ thị 4.2 So sánh tỷ lệ bệnh virus giữa các thời vụ khác nhau trên hai

Đồ thị 4.3 Diễn biến các dạng triệu chứng bệnh virus trên cà chua thời

Đồ thị 4.4 ảnh hưởng của bệnh khảm lá cà chua (ToMV) đến năng suất

cà chua vụ đông xuân 2005- 2006 tại An Lão - Hải Phòng 53

Đồ thị 4.4 ảnh hưởng của bệnh khảm lá khoai tây (PVX) đến năng suất

cà chua vụ đông xuân 2005 -2006 tại An Lão - Hải Phòng 55

1 Mở đầu

1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Cây cà chua (Lycopersicon esculentum Mill), thuộc họ cà (Solanaceae)

có nguồn gốc ở Trung Mỹ và Nam Châu Mỹ Cây cà chua được phát hiện vào thế kỷ XVI [33] Cà chua là loại rau ăn quả được trồng và sử dụng phổ biến trên thế giới Về sản lượng, cà chua chiếm 1/6 sản lượng rau hàng năm trên thế giới [32] Diện tích trồng cà chua hàng năm trên thế giới trung bình 2,5 triệu ha/năm, ở vị trí thứ hai sau khoai tây [33] Châu á đứng đầu về sản lượng

cà chua, sau đó là Châu Âu, riêng ở Mỹ đứng đầu về cả năng suất và sản lượng Hy Lạp là nước đứng thứ hai về năng suất, Italia đứng ở vị trí thứ ba [5] ở Việt Nam cà chua được trồng cách đây trên một trăm năm, diện tích trồng cà chua hàng năm biến động từ 12 đến 13 ngàn ha ở miền Bắc, cà chua

được trồng phổ biến ở các tỉnh thành phố thuộc vùng đồng bằng sông Hồng [5] các tỉnh đồng bằng Bắc bộ hình thành ba vụ trồng cà chua, bao gồm các vụ: vụ Hè thu, vụ Đông xuân, vụ Xuân hè [5] Trong đó vụ Đông xuân thường

được trồng với diện tích cao hơn Vụ Đông xuân được chia làm các thời vụ khác nhau Thời vụ sớm (trà sớm), thời vụ chính vụ (trà chính vụ), thời vụ muộn (trà muộn) Trong vụ Đông xuân, thời tiết, khí hậu thuận lợi cho cây cà chua sinh trưởng và phát triển tốt

Quả cà chua là loại rau có giá trị dinh dưỡng cao Trong quả chín chứa nhiều chất dinh dưỡng như: đường, vitamin A, vitamin C và nhiều chất khoáng quan trọng khác Theo E.D War D.C., Tigche LAAR (1989), thành phần hoá học trong quả cà chua chín sau:

- Nước: 94 - 95%, vật chất còn lại: 5 – 6% gồm các chất sau

- Đường: 55% (Fructoza, Glucoza, Succoza)

- Chất không hoà tan trong rượu: 21% (protein, xenluloza, pectin, polysacarit)

- Axit hữu cơ: 12% (xitric, malic, galacturonic, pyrolidon, cacboxylic)

Cà chua có giá trị kinh tế và giá trị sử dụng cao so với nhiều loại rau như: cải bắp, su hào, các loại rau họ thập tự khác Bình quân thu nhập ở Mỹ Latinh trên một ha trồng trọt là 4610 USD riêng đối với cà chua, với cây rau khác là 2537 USD, lúa nước 1027 USD, lúa mỳ 174 USD Khu vực đồng bằng sông Hồng ở Việt Nam sản xuất cà chua cho thu nhập bình quân 42,0 đến 68,4 triệu đồng / vụ Lãi thuần đạt 15 đến 26 triệu đồng /ha, cao hơn nhiều so với trồng lúa Trồng cà chua giải quyết được khoảng 1100 đến 1200 công lao

động, trong khi đó trồng lúa chỉ giải quyết được 230 đến 250 công lao động [18] Đặc biệt, trong mấy năm gần đây, nhu cầu rau quả cho tiêu dùng và xuất khẩu là một trong những loại rau quả quan trọng cho tiêu dùng Bình quân một người dân Việt Nam tiêu thụ 71kg/người/năm Các vùng thành thị như Hà Nội, Thành phố Hồ Chí Minh, Hải Phòng mức tiêu thụ lên tới 159 kg/người/năm Nhu cầu xuất khẩu các loại rau quả cũng ngày một gia tăng, chỉ tính từ năm 1996 đến năm 2001 Việt Nam đạt tốc độ tăng trưởng tới 30% Năm 2001 đạt 330 triệu USD (đô la Mỹ) gấp 3,6 lần so với năm 1996 Mục

tiêu kim ngạch xuất khẩu rau quả của Việt Nam đạt một tỷ USD (Đô la Mỹ)

vào năm 2010 một trong các trọng tâm xuất khẩu về rau quả, trong đó có cà chua [ 6 ]

Cà chua được sử dụng phổ biến trong sinh hoạt hàng ngày thông qua hàng loạt các phương thức chế biến khác nhau Có thể sử dụng cà chua ăn tươi, chế biến các món nấu, xào, làm dấm, salat Cà chua là nguồn nguyên liệu cho ngành công nghiệp chế biến đóng hộp, làm mứt, làm cà chua cô đặc và nước ép cà chua…

Trong điều kiện hiện nay, các sản phẩm nông nghiệp cần phải đáp ứng

được các yêu cầu và thị hiếu của thị trường, đáp ứng được các đòi hỏi của nền sản xuất hàng hoá thì phát triển sản xuất cà chua càng được coi như một nhân

tố thúc đẩy thị trường rau quả nội tiêu và xuất khẩu [6]

Thành phố Hải Phòng là đô thị loại một cấp quốc gia, có cảng sông, cảng biển, đường giao thông thuận lợi cho việc giao lưu thương mại trong và ngoài nước Đặc biệt trong tương lai gần, Việt Nam sẽ xây dựng các tuyến

đường cao tốc phục vụ phát triển và hội nhập kinh tế quốc tế và gia nhập Tổ

chức Thương mại thế giới WTO (World Trade Organisation), các tuyến đường này đều có tuyến qua Hải Phòng [1]

Bên cạnh những vấn đề nêu trên là vấn đề về quỹ đất sản xuất nông nghiệp của địa phương Hiện nay, diện tích đất trồng cây hàng năm, đất lúa màu ở Hải Phòng có xu hướng giảm do ảnh hưởng của tốc độ đô thị hóa Tính riêng đất lúa chỉ trong ba năm (1997 - 2000) Hải Phòng giảm 199 ha (năm

1997 có 52.513 ha, năm 2000 còn 52.314 ha) Bình quân quỹ đất canh tác / hộ nông nghiệp chỉ đạt 1008,9 m2/ hộ điều tra [4] Như vậy, vấn đề đặt ra cho sản xuất nông nghiệp của Hải Phòng là cần phải đẩy mạnh chuyển dịch cơ cấu kinh tế nông nghiệp, trong đó có chuyển dịch cơ cấu cây trồng và vật nuôi Sản xuất cà chua ở Hải Phòng hiện nay đang được người dân địa phương chú trọng phát triển

Thực hiện chủ trương chuyển dịch cơ cấu cây trồng, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đã quyết định cho phép Hải Phòng xây dựng nhà máy chế biến cà chua cô đặc với công suất thiết kế từ 7 đến 10 tấn nguyên liệu /giờ, tương

đương với 200 tấn/ ngày Tại huyện An Lão - Hải Phòng, dự án xây dựng Trung tâm Phát triển Nông Lâm nghiệp công nghệ cao đã được triển khai thực hiện để sản xuất các loại nông sản có giá trị kinh tế cao Một trong những cây trồng chủ yếu được sản xuất trong nhà kính là cà chua Hiện nay, tổng diện tích nhà kính khoảng 8000 m2 năng suất dự kiến phấn đấu đạt 250 - 300 tấn/ha Đây là những yếu tố thuận lợi cho việc phát triển sản xuất cà chua tại Hải Phòng

Mặc dù có những điều kiện thuận lợi nhưng vấn đề sản xuất cà chua ở Hải Phòng vẫn chưa phát triển mạnh, thậm chí còn chậm Một trong những nhân tố gây ảnh hưởng là sự phát sinh phát triển và gây hại của các loài dịch hại Thành phần sâu bệnh hại trên cà chua ở Hải Phòng tương đối đa dạng

như: sâu xanh (Helicoverpa armigera Hubner), sâu khoang (Spodoptera litura

Fabr), bọ phấn (Bemisia tabaci), bọ trĩ (Thrips palmi Karny)… Về bệnh hại:

bệnh do các virus, bệnh héo xanh (Ralstonia solanacearum Smith.), bệnh mốc sương (Phytophthora infestans (Mont.) de Bary) Trong các loại sâu bệnh kể

trên, bệnh virus hại cà chua rất nguy hiểm Bệnh do virus gây ra làm giảm năng suất, chất lượng cà chua, đặc biệt là gây thoái hoá giống Thành phần virus hại cà chua bao gồm nhiều virus khác nhau, thể hiện nhiều dạng triệu chứng khác nhau trên cây cà chua đang sản xuất ngoài đồng ruộng

Mặc dù vậy, cho đến nay ở Hải Phòng vẫn chưa có nghiên cứu nào về virus hại cà chua hoặc các nghiên cứu còn quá ít Công tác chỉ đạo sản xuất để phòng trừ bệnh virus hại cà chua ở Hải Phòng mới chỉ dừng ở mức độ điều tra phát hiện triệu chứng bệnh virus hại cà chua Chưa có biện pháp thực sự hữu hiệu để phòng trừ bệnh virus hại cà chua trong sản xuất

Vì vậy, nghiên cứu bệnh virus hại cà chua tại Hải Phòng là vấn đề cấp thiết và quan trọng Để từng bước góp phần bổ xung thông tin và dữ liệu

nghiên cứu về virus hại cà chua, để góp phần bổ xung cơ sở cho việc chỉ đạo sản xuất và định hướng phòng trừ bệnh virus hại cà chua ở Hải Phòng phục vụ phát triển sản xuất Chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:

“Điều tra nghiên cứu bệnh virus khảm lá cà chua (Tomato Mosaic virus - ToMV) và bệnh virus khảm lá khoai tây (Potato virus X - PVX) trên

cà chua vụ đông xuân 2005 - 2006 tại huyện An L∙o - Hải Phòng”

1.2 Mục đích, yêu cầu của đề tài

1.2.1 Mục đích

Nghiên cứu đánh giá thực trạng bệnh virus khảm lá cà chua (Tomato mosaic virus - ToMV) và bệnh virus khảm lá khoai tây (Potato virus X - PVX) trên cà chua vụ đông xuân 2005 - 2006 tại huyện An Lão - Hải Phòng

áp dụng phương pháp ELISA để xác định nguyên nhân gây bệnh do virus khảm lá cà chua ToMV và bệnh virus khảm lá khoai tây PVX hại trên cây cà chua

1.2.2 Yêu cầu

- Điều tra, nghiên cứu diễn biến triệu chứng bệnh virus hại cà chua vụ

đông xuân tại huyện An Lão - Hải Phòng

- Xác định bệnh virus khảm lá cà chua ToMV và bệnh virus khảm lá khoai tây PVX trên cà chua trong thời gian thực tập

- Tìm hiểu phương thức truyền của bệnh virus khảm lá cà chua ToMV và bệnh virus khảm lá khoai tây PVX

- Đánh giá ảnh hưởng của bệnh đến năng suất trên một số giống cà chua được trồng phổ biến tại An Lão

- Kiểm tra virus khảm lá cà chua ToMV, bệnh virus khảm lá khoai tây PVX trên cà chua bằng phương pháp ELISA, phương pháp cây chỉ thị

2 Tổng quan tài liệu

và cơ sở khoa học của đề tài

2.1 Những nghiên cứu ở nước ngoài

2.1.1 Bệnh virus hại cây trồng trên thế giới

Hiện nay, trên thế giới người ta đã phát hiện ra trên 650 bệnh hại thực vật do virus gây ra (L Bos.,1983), con số này đã tăng lên không ngừng [36, 68] Theo ủy ban Quốc tế về định loại virus (ICTV) thông qua tháng 5 năm

2000 Virus hại thực vật được định loại có khoảng 14 họ trong đó: 13 họ virus

đã, được xác định, 1 họ chưa được xác định Hầu hết các virus thuộc 70 giống khác nhau Virus gây triệu chứng bệnh khảm lá chiếm khoảng 27% Trên cây

cà chua có tới 40 loại virus phát sinh phát triển và gây hại bao gồm nhiều chủng khác nhau như: CMV, TLCV, ToMV, TYLCV, TRCV, virus X, virus

Y, virus S…Các loại virus biểu hiện các triệu chứng khác nhau và chủ yếu trên lá và làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất [22, 36] Theo Thẩm Phúc Lân (1986) có khoảng 170 virus truyền từ vùng này sang vùng khác theo con đường nhập từ nước ngoài các loại cây con, cành ghép, gốc ghép, cây cấy mô Khoảng 17 virus tồn tại trên hạt giống và từ đó truyền từ vùng này sang vùng khác (David G.A Walkey, 1985) [dẫn qua 11] Với thành phần virus hại thực vật phong phú đa dạng và nhiều virus có phổ ký chủ rộng như vậy thì việc tiến hành các nghiên cứu về virus nói chung và virus hại cà chua nói riêng đã trở thành những đối tượng nghiên cứu cơ bản, nghiên cứu ứng dụng cần được tiến hành thường xuyên Đặc biệt, cần chú trọng ở những vùng sinh thái nhất định Những kết quả nghiên cứu này có ý góp phần đưa ra những chủ trương hợp lý trong sản xuất, trong chỉ đạo phòng trừ dịch hại [36] Theo EPPO (Tổ chức Bảo vệ thực vật châu Âu), có nhiều virus mới xuất hiện gây thiệt hại nghiêm trọng trên cây cà chua và một cây trồng khác và là đối tượng

kiểm dịch của nhiều nước trên thế giới Một số virus như : Tomato apical stunt pospivirade (TASP) (EPPO, 2003); Tomato infectious chlorosis virus (TICV) (EPPO, 2005); Pepino mosaic virus (PeMV) (EPPO, 2006).[41, 42, 43] Chỉ tính riêng thiệt hại kinh tế do TICV gây hại trên cà chua ở bang Califonia (Mỹ) lên đến 2 triệu đô la Mỹ trong một mùa vụ [42] TICV đã được thông báo phát hiện thấy ở Nhật, Đài Loan và Inđônesia, một số nước châu Âu [40,

64, 66]

2.1.2 Những nghiên cứu về triệu chứng của virus hại cà chua

Các tác giả trong và ngoài nước đã mô tả và phân loại triệu chứng virus hại thực vật thường được chia làm các nhóm khác nhau Hầu hết triệu chứng bệnh đều thể hiện ở các nhóm dạng sau:

- Nhóm triệu chứng đốm hoại

- Nhóm triệu chứng hoa lá

- Nhóm triệu chứng xoăn lá

- Nhóm triệu chứng biến màu vàng, đỏ, [36]

Các triệu chứng cơ bản của bệnh virus gây ra trên cà chua được các tác giả quan sát và mô tả như sau

+ Triệu chứng xoăn vàng

Bệnh xuất hiện và gây hại ngay từ giai đoạn cây còn non cho đến khi kết thúc quá trình sinh trưởng và phát triển Cây bệnh sinh trưởng phát triển kém, đỉnh sinh trưởng ngọn bị nhăn nheo ngọn thường chùn lại, các lá thường

bị xoăn lại cong lõm hình thìa úp, hai mép là biến vàng từ ngoài vào trong phiến lá, làm cho lá có màu vàng Mùa đông khi thời tiết lạnh lá có màu tím

Đặc biệt, triệu chứng rất điển hình trên lá non và lá gần ngọn Các lá non xoăn mạnh có màu vàng, kích thước nhỏ hơn so với lá cây khoẻ do đó làm ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của cà chua Cây chậm ra hoa, quả bị nhỏ, tuỳ thuộc vào giai đoạn cây bị nhiễm bệnh Những cây nhiễm vào giai đoạn ra

hoa đậu quả thì ra hoa rất ít, quả nhỏ, múi khô năng suất và phẩm chất kém Cây bị bệnh vào giai đoạn đã kết quả hoặc muộn thì phẩm chất kém và quả thường bị dị dạng [31]

+ Triệu chứng cuốn lá

Phiến lá của cây bị bệnh nhỏ hơn bình thường hoặc không đổi, có thể kèm theo khảm, mép lá có xu hướng cuốn lại thành hình ống, thuỳ lá mất đi Cây bị bệnh thường thấp hơn cây bình thường

+ Triệu chứng lá dương xỉ

Cây còi cọc lá cây thường mọc thành búi rậm Lá chét bị biến dạng mất thùy, phiến lá co lại gần gân chính Màu sắc lá xanh xỉn kéo dài dạng cây dương xỉ Cây bệnh ra hoa đậu quả kém

+ Triệu chứng khảm biến vàng

Trên lá cây bị bệnh có những vết khảm xanh vàng xen kẽ khi mới bị bệnh, bệnh nhẹ vết bệnh mờ Khi cây bị bệnh nặng lá thường nhỏ và bị biến dạng và biến vàng, cây còi cọc ra cây hoa nhưng không đậu quả hoặc ít quả Quả nhỏ và xuất hiện gân mạng lưới

+ Triệu chứng khảm lồi lõm

Lá của cây bị bệnh có những vết đốm lồi lõm Khi cây bị bệnh nhẹ sinh trưởng và phát triển của cây không bị ảnh hưởng nhiều Cây bị bệnh làm cho lá biến dạng

Theo R.S Mehrotra (1989), triệu chứng dạng khảm do virus X hay Solanum I, bao gồm nhiều chủng gây ra trên khoai tây Trong điều kiện khoai tây sinh trưởng thích hợp, triệu chứng không xuất hiện khiến cho khó nhận ra bệnh Triệu chứng hoa lá hầu như biến mất ở nhiệt độ cao trên 210C Nhận

định này rất quan trọng cho các nghiên cứu về sau Nếu cần nghiên cứu một virus hại cà chua nào đó thì việc tiến hành đầu tiên là phải nghiên cứu những vấn đề chung trên tất cả các dạng triệu chứng bệnh virus hại cây trồng xuất

hiện trên đồng ruộng Triệu chứng khảm xoăn lá làm cây bệnh khi bị nặng không có những vết đốm nhưng bị nhăn nhúm nhỏ bé rõ rệt, lá ngọn cuốn cong xuống, toàn thân thấp lùn, các lá phía dưới thường thì gân lá có biểu hiện biến đen Các vết đốm không xuất hiện ở nhiệt độ cao, bệnh do phối hợp của hai loại virus X và virus Y [dẫn qua 34, 45 ] Bệnh xoăn lá cà chua có quan hệ

mật thiết với bệnh đốm xoăn, bệnh do virus X và virus A gây ra [53] Có

khoảng 40 loại virus gây hại trên cây cà chua trên các vùng trồng cà chua trên thế giới, làm giảm năng suất từ 15 đến 25% [36, 69]

2.1.3 Những nghiên cứu về ToMV

Tên thường gọi: Tomato mosaic virus tên viết tắt là ToMV

Các tên gọi khác: Lycopersicum virus 1 (Rev.appl Mycol 36:303) Ngoài ra, còn có nhiều tên gọi đồng nghĩa khác dựa vào các chủng của ToMV

Virus khảm lá cà chua Tomato mosaic virus (ToMV) được phát hiện và mô tả lần đầu bởi Clinton (1909) ở trên cây cà chua trồng ở bang Connecticut

(Mỹ) [47, 49, 62], Wetrdijk (1910), Allard (1916) (bang Connecticut, Mỹ)

Vị trí phân loại: [47]: ToMV thuộc nhóm Tobamovirus Nhóm này có một số đặc điểm chính như sau:

Hầu hết các loài virus thuộc nhóm này có hình gậy thẳng, kích thước

300 x 18 nm (chiều dài x đường kính chiều rộng), hệ số lắng đọng khoảng 190s, mỗi sợi virus được cấu tạo bởi 2000 tiểu đơn vị sắp xếp theo hình xoắn

ốc bao quanh genome có chứa phân tử đơn của sợi đơn RNA, chiếm 5% trọng lượng virus RNA có trọng lượng phân tử là 2 x 106 Da Các virus thuộc nhóm này có ngưỡng nhiệt độ mất hoạt tính (TIP) 900C, trong nhựa cây virus

có thể tồn tại nhiều năm liền, mật độ tập trung cao nhất lên tới 10g/l

Nhóm virus này thường gây ra triệu chứng đốm chết và khảm lá, con

đường truyền lan chủ yếu qua tiếp xúc giọt dịch, tiếp xúc cơ giới giữa cây khỏe với cây bệnh, qua đất, đôi khi truyền qua hạt giống Sợi virus được tìm

thấy trong tế bào chất, trong lục lạp và không bào

ToMV còn được phát hiện ở Đài Loan, có ba chủng virus gây hại trên

cà chua gồm: ToMV1, ToMV2, ToMV3, (S.K Green, L.H Wang, 1980, 1982),

ba chủng này mang gen khác nhau, ToMV gây hại hầu hết trên các giống cà chua thương mại [45] Theo Smith (1957) ToMV có hai chủng quan trọng là

Tomato aucuba mosaic và Tomato enation mottle [62]

2.1.3.1 Triệu chứng do virus ToMV gây ra trên cà chua

Tomato mosaic virus có thể gây hại hầu hết trên các cây họ cà Triệu

chứng do ToMV gây ra trên cà chua chịu ảnh hưởng lớn về nhiệt độ, độ dài ngày, tuổi cây, độ độc của virus và phương thức trồng (Hollings M.,

Huttingga, 1976) [49] Triệu chứng xuất hiện phổ biến trên cà chua vào vụ hè

khi cây cà chua được trồng trong nhà kính, cây cà chua bị nhiễm bệnh xuất hiện những đốm trên lá và trên quả, cũng có thể ra các vết sọc chết hoại trên thân, lá và quả Vào mùa đông, quả thường bị thối, mùa hè quả thường bị khô

ở giai đoạn quả đang phát triển, [35, 49] Mùa đông ngày ngắn, cường độ ánh sáng yếu, nhiệt độ thấp khoảng 200C, cây thường còi cọc, lá dương xỉ hoặc dạng sợi chỉ, trên lá có các vết đốm sáng Thiệt hại về năng suất có thể từ 3 - 23%, (Broadbent, 1964; Rast, 1975) Theo Smith (1957) [62] khi cây cà chua

bị nhiễm đồng thời ToMV và PVX gây lên khảm sọc đôi ToMV gây hại trên thân cây, làm cây còi cọc, lá dương xỉ hoặc hình sợi chỉ có kèm theo các vết

đốm sáng [40] cuống quả khi bệnh phát triển gây ra các vết lõm sâu và khảm

dạng sọc đơn (Jarset, 1930) Điểm chung là các cây non trở lên cằn cỗi và

kèm theo sự vặn vẹo méo mó dạng dương xỉ biểu hiện ra ngoài các lá cây, các lá yếu ớt Virus là nguyên nhân gây đốm vằn, đốm sọc và hoại tử trên cà chua Bệnh không làm chết cây nhưng chúng có thể làm kém chất lượng và sản

lượng quả Cây ớt (Capsicum annuum) có sức đề kháng với ToMV Tuy

nhiên, trong những điều kiện canh tác chật hẹp, trồng ớt sau khi trồng cây cà

chua bị nhiễm thì cây ớt vẫn bị nhiễm Trên cây thuốc lá (Nicotiana tabacum) cây khoai tây (Solanum tuberosum) ToMV gây đốm lá, rụng lá thối thân và còi cọc, trên cây rau muối (Chenopodium murale) ToMV là nguyên nhân của

sự rụng lá, còi cọc và chết hoại (Bald and Paulus, 1963) [dẫn qua 49]

Các tác giả cũng phân nhóm triệu chứng như sau: [49]

- Nhóm 1: Lá cây cà chua bị khảm đốm tạo thành các vùng xanh nhạt, xanh đậm, đôi khi gây biến dạng lá non Đây là dạng triệu chứng chung của cây cà chua trong nhà kính phản ứng lại trong điều kiện nhiệt độ thấp

- Nhóm 2: Triệu chứng đốm vàng trên lá và quả (Bewley,1923; Smith,1957)

- Nhóm 3: Triệu chứng đốm chết hoại trên thân, lá, cuống lá hoặc trên quả Một số chủng của virus gây ra triệu chứng sọc đơn hay sọc nhà kính (Glasshouse strẹak) trên thân cây, cuống lá, đôi khi gây chết cây Quả nhiễm bệnh tạo ra các vùng chết hoại cục bộ lõm lại trên bề mặt quả Một vài chủng của virus gây ra triệu chứng đốm sọc ở nhiệt độ 260C hoặc thấp hơn (Komuro

et al, 1996) Một số chủng của ToMV kết hợp với PVX cùng lây nhiễm tạo ra triệu chứng dạng sọc đôi Quả bị bệnh bị chết hoại cục bộ, sau đó lõm lại (Vallean and Jonhon,1930; Wharton, 1957) một số chủng khác gây chết hoại trên quả và làm vỏ quả cứng ròn (Rast, 1957) [dẫn qua 49]

- Theo một số nghiên cứu gần đây đã được công bố thì ToMV còn gây hại trên một số loài hoa và cây cảnh Đã có báo cáo đầu tiên về ToMV gây

hại trên hoa Râm bụt (Hibiscus rosa sinensis): gây khảm lá hệ thống ở lá non

gây nhăn và biến dạng ở lá già hơn và gây lùn cây [48] Theo kết quả nghiên cứu của Kamenova I Adkins S và Achors S (2004) thì ToMV còn gây hại

trên cây hoa nhài (Jasmine sp.) ở bang Florida (Mỹ) [52]

Triệu chứng xuất hiện hay không xuất hiện, rõ ràng hay chưa rõ còn phụ thuộc vào điều kiện ngoại cảnh như: mùa vụ, ánh sáng, nhiệt độ, sinh trưởng

và phát triển của cây cà chua

Từ các nhận xét trên, chúng tôi thấy: phải có những phương pháp hỗ trợ khi cần xác định chính xác nguyên nhân gây bệnh của một loại virus hại cà chua như phương pháp ELISA, phương pháp dùng cây chỉ thị, phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)

2.1.3.2 Phân bố địa lý và phạm vi ký chủ của ToMV

+ Phân bố địa lý: ToMV phân bố trên toàn thế giới, đặc biệt ở các vùng trồng cây họ cà

+ Phạm vi ký chủ:

ToMV có phạm vi ký chủ rộng, có tới 127 loài thuộc 23 họ thực vật nhiễm ToMV (Edwards and Christie, 1997) [36] Theo Maitlin (1984) có trên

9 họ thực vật mẫn cảm với ToMV [dẫn qua 38]

Năm 1909, Clinton đã tiến hành lây nhiễm thực nghiệm ToMV trên nhiều loại cây và xác định nhiều cây mẫn cảm với ToMV:

-Capsicum annuum, Capsicum frutescens, Chenopodium amaranticolor, Chenopodium murale, Lycopersicon pimpinelfifolicum, Nicotiana benthamiana

Cây ký chủ mẫn cảm của ToMV:

- Cây cà độc dược (Solanum giganteum): gây khảm lá hệ thống

- Cây thuốc lá (Nicotiana tabacum cv White Burley): gây vết chết cục bộ

- Cây rau muối (Chenopodium murale): gây ra sự rụng lá, cây còi cọc

và chết hoại (Bald and Paulus, 1963) [dẫn qua 49]

Cây ký chủ duy trì và nhân số lượng:

- Cà chua (Lycopersicon esculentum)

- Thuốc lá (Nicotiana tabacum cv Samsun)

Cây ký chủ kiểm tra:

Nicotiana tabacum cv Samsun, Nicotiana benthamiana, Nicotiana tabacum cv Xan thi, Nicotiana tabacum cv White Burley, Nicotiana glutinosa

Nhiều tác giả cho rằng: ToMV có thể tấn công nhiều loại ký chủ khác nhau kể cả cà chua, hồ tiêu, thuốc lá, cây rau bina, cây thuốc lá cảnh và cúc vạn thọ Trên cây cà chua, virus lây nhiễm và gây ra những vết đốm sáng xanh

tối xen kẽ trên bề mặt lá [35, 49]

2.1.3.3 Đặc tính của virus ToMV

+ Đặc tính vật lý và hoá học:

- Điểm đẳng điện (Isoelectric point): pH từ 4,50 đến 4,64

- Nhiệt độ giới hạn mất hoạt tính - TIP (Thermal Inactivation Point):

Q10 = 850C - 900C

- Ngưỡng pha loãng (Dilution End Point): DEP 10- 5 - 10- 7

- Thời gian sống và gây hại trong dịch cây bệnh (Longevity In vitro): LIV: 500 ngày Trong tàn dư cây cà chua, ToMV có thể tồn tại 24 năm, ở nhiệt độ 200C trong phòng ToMV có khả năng sống và gây bệnh sau vài tháng ngay cả khi nhiệt độ xuống thấp 0 - 20C ToMV vẫn có khả năng sống (Rast, 1975) [38, 49]

+ Hình thái và cấu trúc ToMV:

Hình thái: ToMV có hình gậy, chiều dài 300 nm, đường kính chiều

rộng 18 nm Bộ genome là RNA, sợi đơn, dạng hình xoắn ốc

1957), (Wiltmann and Liebold 1967)

- Lipit: 0%

2.1.3.4 Sự truyền bệnh của virus ToMV

+ Truyền lan qua hạt giống:

Theo David G.A Walkey (1985) có 1 chủng 17 loại virus truyền qua hạt giống ToMV là một trong những loại virus truyền lan qua hạt giống Hạt của các loại giống khác nhau thì mức độ xâm nhiễm khác nhau và có sự biến

đổi lớn, khoảng 50% số hạt thường xuyên bị nhiễm có khi lên tới 94% (Van Winkel, 1965) Nguồn virus tồn tại trên hạt giống chính là nguồn lây nhiễm quan trọng cho vụ sau ToMV chủ yếu tồn tại trên vỏ hạt, theo Taylor Wind Colaborater (1996), Broadbent (1965) đôi khi cũng có trong nội nhũ, ToMV không nằm trong phôi của những mầm hạt bị nhiễm, ToMV có thể nhiễm nhẹ trong nhiều tháng trên các mẫu hạt thu từ cây mẹ bị nhiễm và lan truyền cơ học sang cây con [35, 38, 49]

+ Sự lan truyền qua vector:

ToMV không lan truyền qua con đường côn trùng môi giới mà chủ yếu qua con đường tiếp xúc cơ học từ cây, đất, gốc ghép, cành ghép Dụng cụ gieo trồng bị nhiễm ToMV (Boradley, 1972) Virus tồn tại trong dịch cây, trên tàn dư thực vật Cây trồng khoẻ có thể bị nhiễm qua các vết thương cơ giới [40] Nguồn nước tưới bị nhiễm ToMV cũng mở rộng phạm vi lan truyền Các chủng ToMV có thể truyền nhờ cây tơ hồng Vào mùa đông chủng “yellow” và

“green” dễ bị lây nhiễm còn mùa hè thì ít hơn (Schmelzer, 1956) [49]

2.1.3.5 Thiệt hại kinh tế

Trên thế giới thiệt hại do ToMV gây ra cho cà chua khoảng 20%, khi sản xuất cà chua trong nhà kính là khoảng 25 % sản lượng [39, 49]

2.1.4 Những nghiên cứu về Potato virus X (PVX)

Potato virus X được xác định bởi Smith (1931) Họ Flexividae, giống Potex virus, loài Potato virus X, viết tắt PVX tên gọi virus khảm lá khoai tây - Potato virus X [33, 58, 59]

PVX có nhiều tên gọi khác nhau:

- Potato latent virus (Rev Appl Mycol 11: 595)

- Potato mild mosaic virus (Rev Appl Mycol 12: 367)

- Solanum virus I (Rev Appl Mycol 17: 52)

- Tobacco ringspot virus (Johnson, 1972)

- Potato X potex virus (Smith, 1931) [33, 37, 58, 59]

Nhóm Potex virus có một số đặc điểm chính như sau [58]:

Hình thái cấu trúc các virus thuộc nhóm này có dạng hình sợi xoắn cong queo, kích thước trung bình từ 470 – 580 nm x 13nm (chiều dài x đường kính chiều rộng) hệ số lắng đọng từ 114 đến 130s Mỗi một sợi virus được cấu tạo

từ 1000 đến 1500 tiểu đơn vị sắp xếp thành hình xoắn ốc bao quanh bộ genome có chứa các phân tử đơn của RNA (Riboxom Nucleic Acid) chiếm 5

đến 7% trọng lượng phân tử Vỏ Protein của nhiều loài virus thuộc nhóm này

có thể bị phá hủy từng phần trong điều kiện insitu Nhiệt độ mất hoạt tính (TIP) từ 600C đến 800C, ngưỡng pha loãng giới hạn (DEP) từ 10-5 đến 10-6., thời gian tồn tại trong giọt dịch (LIV) từ vài tuần cho đến vài tháng Nhóm này thường gây triệu chứng khảm và đốm hình nhẫn trên các cây một hoặc hai lá mầm Phổ ký chủ tự nhiên tuỳ thuộc vào từng loại virus khác nhau Sợi virus thường kết tụ trong lục lạp Virus lan truyền theo con đường giọt dịch là chính thường không lan truyền qua côn trùng môi giới và qua hạt giống

2.1.4.1 Triệu chứng và thiệt hại do PVX gây ra trên cà chua

Theo Bercks (1970), PVX gây hoa lá đốm sáng và còi cọc ở cây cà

chua Theo R S Mehrotra mô tả, bệnh do virus X hay Solanum virus I bao gồm nhiều chủng [26, 33] Triệu chứng hoa lá hầu như biến mất ở nhiệt độ trên 210C Bệnh lan truyền trên ruộng qua dịch cây, sự tiếp xúc giữa các cây khoẻ và cây bệnh Các tác giả khác cũng mô tả, bệnh trên cây cà chua PVX gây những đốm sáng khảm trên lá, đôi khi có những vết đốm chết hoại hoặc

đốm chết hình nhẫn Trong tự nhiên, khi chỉ nhiễm riêng PVX cây cà chua sinh trưởng và phát triển hơi chậm, gần như không ảnh hưởng đến sinh trưởng, khi nhiễm hỗn hợp PVX cùng với các loại virus khác, cây cà chua bị ảnh hưởng nghiêm trọng đến sinh trưởng và năng suất Đặc biệt, khi nhiễm đồng thời với TMV (Tobaco mosaic virus) sẽ gây bệnh Tomato double virus streak gây chết hoại nghiêm trọng đồng thời bị mất giá do các quả bị bệnh bị biến dạng, thối [37, 53, 59, 67] Dạng triệu chứng này xảy ra ở các vùng trồng cà chua và khoai tây liền nhau, điều này giải thích PVX được truyền qua nước khá mạnh ở Ba Lan, cà chua bị nhiễm cả PVX và PVY sau khi hình thành quả và thiệt hại có khi lên tới 50% Theo R Bercks (1970) cho rằng PVX gây hiện tượng hoa lá đốm sáng trên cây cà chua, hoa lá nhẹ trên cây khoai tây, gây đốm chết trên cây thuốc lá và coi đó là triệu chứng tổng quát của PVX trên cây trồng [33]

Trên cây cà chua PVX gây khảm lá và đốm sáng Trên cây ớt PVX gây

đốm sáng trên lá và thân [33, 59] Khi PVX gây hại cùng với một số virus khác như PVX + PVY + PVS hoặc PVX + PVM + PVS thì năng suất khoai tây, cà chua có thể giảm tới 50% trở lên (A.L Ambroshov, 1978) A.J.Reetman (1970) cho biết PVX có thể làm giảm năng suất khoai tây tới 25% khi bệnh nặng Trên cây khoai tây khi PVX kết hợp với PVY thì gây ra hiện tượng khảm đỏ thì thiệt hại về năng suất nghiêm trọng nhất [dẫn qua 20 ]

2.1.4.2 Phân bố địa lý và phạm vi ký chủ [33, 36, 59]

+ Phân bố địa lý:

Virus PVX/O phân bố ở các vùng trồng khoai tây trên thế giới và lan truyền mạnh ở ấn Độ

+ Phạm vi ký chủ:

PVX có phổ ký chủ rộng, trong tự nhiên PVX nhiễm ít nhất trên 62 loài cây trồng và truyền qua 348 loài thuộc 33 họ cây trồng khác nhau (Edwardson and Christie, 1997) [36]

Theo Purcifull and Edwardson (1981) PVX nhiễm trên 240 loài thuộc

16 họ cây ký chủ, phần lớn là các cây họ cà (Solanaceae) [59 ]

Cây ký chủ có triệu chứng ổn định đặc tr−ng của virus là cây khoai tây

(Solanum tuberosum), khi cây bệnh nghiêm trọng làm hoại tử dạng vết đốm sọc Trên cây cải (Brassica campestris ssp) các vết khảm xuất hiện kèm với sự

cong queo của lá và cây cằn cỗi

Chẩn đoán xác định loài bằng các cây chỉ thị:

- Cây thuốc lá: Nicotiana tabacum, Nicotiana sp

- Cây cà độc d−ợc: Datura stramonium

- Cây ớt: Capsicum annuum, Capsicum frutescens

2.1.4.3 Đặc tính của virus PVX

+ Đặc tính vật lý và hoá học: [33, 37]

- Điểm đẳng điện (Isoelectric point): pH 4, 4

- Nhiệt độ giới hạn mất hoạt tính - TIP: Q10 = 680C - 760C

- Ng−ỡng pha loãng - DEP: 10- 5 - 10- 6

Thời gian sống và gây hại trong dịch cây bệnh (LIV): 40 đến 60 ngày Theo Bercks, Peter, Wildy: Q10 của PVX từ 65 đến 76 0C

+ Hình thái và cấu trúc:

- Hình thái: Virus PVX có cấu tạo hình sợi dài xoắn và cong queo

(Berck R 1970)

Hạt Virus có màng bao bọc dạng sợi dài, chiều dài 515 nm đường kính

chiều rộng 13 nm (Brandes, 1964) [31] khoảng cách giữa các vòng xoắn 3, 4

nm, các vòng xoắn cơ bản rõ ràng (Varma et al., 1968)

- Cấu trúc:

Trọng lượng phân tử: 35 x 106 Da (Reimann, 1959) Hệ số lắng đọng 117,7 s Thể tích phân tử 0,73 cm3/g (Lauffer and Carturight)

- Nucleic acid chiếm 6%, dạng sợi đơn độc thể RNA (Knight, 1963 Huiseman et al, 1988; Tollin and Wilson, 1988) [dẫn qua 35] Kích thước tổng genome cũng là kích thước của một genome bằng 6.435kb, thành phần cơ bản gồm 32%A, 22%G, 22%U, 24%C

- Protein: 94%, cấu trúc vỏ Protein (CP) có cỡ 30.000 Da được tạo

thành từ các aminoacid (Shaw and Larson, 1962; Shaw et al, 1962; Miki and

2.1.4.4 Truyền bệnh của virus PVX [37, 59, 33]

- Sự truyền bệnh qua tiếp xúc cơ giới: Theo R.S Mehrotra (1989), virus PVX truyền qua dịch cây, có sự tiếp xúc với cây khỏe, bệnh xuất hiện thường cùng với sự xuất hiện của hai loại virus X và Y ở 200C PVX giữ được khả năng lây nhiễm trong nhiều tuần (Bode, 1968) PVX truyền bệnh chủ yếu qua con đường tiếp xúc cơ giới Sự truyền lan qua các vector đã được thông báo

qua nấm Synchytrium endobio ticum (Nienhaus and Stille, 1965), qua châu chấu (Melanoplus differentialis) (Walters, 1952), qua bọ muỗm (Tettrigonia

viridissima) (Schmutteres, 1961) Theo Schemelzer (1956) PVX truyền qua cây tơ hồng (Cuscuta sp.) [ dẫn qua 35] PVX không lan truyền qua hạt giống,

phấn hoa [33, 37]

2.1.5 Những nghiên cứu về chẩn đoán bệnh bằng phương pháp ELISA

Việc áp dụng các thành tựu khoa học kỹ thuật hiện đại đã trở lên cần thiết và hữu hiệu trong việc chẩn đoán các bệnh nguy hiểm trên cây trồng Một trong những phương pháp hiệu quả, chính xác được áp dụng phổ biến trên thế giới là phương pháp Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Ngày nay, nhiều dạng khác nhau của ELISA đang được sử dụng thường xuyên [44, 51, 57] Trong điều kiện Việt Nam hiện nay, phương pháp ELISA đặc biệt có ý nghĩa trong chẩn đoán bệnh hại cây trồng do vi sinh vật gây ra

Năm 1969, khi Arrameas liên kết một kháng thể IgG với một Enzyme

và chứng minh rằng, kháng thể liên kết Enzyme này vừa duy trì tính đặc hiệu miễn dịch của kháng thể vừa duy trì tính hoạt động của Enzyme

Năm 1977, Clarck và Adams lần đầu tiên ứng dụng phương pháp ELISA để chẩn đoán các cây nhiễm bệnh virus thực vật

Hiện nay, có hai phương pháp ELISA đang được ứng dụng rộng rãi là phương pháp Double Antibody Sandwich (DAS - ELISA), phương pháp này

gọi là phương pháp ELISA trực tiếp Phương pháp thứ hai là Indirect ELISA

gọi là phương pháp ELISA gián tiếp

+ Phươngpháp ELISA trực tiếp (DAS - ELISA):

Phương pháp DAS - ELISA được sử dụng dưới dạng kỹ thuật ELISA kẹp kép kháng thể DAS - ELISA được Clarck và Adam mô tả vào năm

1977, DAS - ELISA trực tiếp sử dụng kháng thể đặc hiệu virus để vừa bẫy virus vừa phát hiện virus đã bẫy được (kháng thể liên kết men sẽ tập hợp

đặc hiệu với virus được bẫy) Kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi nhưng có hai nhược điểm:

- Rất đặc hiệu chủng, do vậy khó phát hiện được các chủng của cùng một virus nếu chủng này có quan hệ huyết thanh kém Tính đặc hiệu cao này

là do Enzyme khi liên kết với kháng thể đã làm giảm khả năng kết hợp của kháng thể này với các chủng virus có quan hệ huyết thanh không chặt

- Đòi hỏi phải có từng loại kháng thể liên kết Enzyme khác nhau cho mỗi loại virus [50]

+ Phương pháp ELISA gián tiếp (Indirect ELISA):

Theo Koenig R (1981) ưu điểm của phương pháp này là một kháng thể

đặc hiệu kháng thể (káng thể liên kết với Enzyme) có thể phát hiện rất nhiều chủng của virus cần kiểm tra đó Độ nhạy của kháng nguyên cao hơn và có giá trị Optical density (OD) ở các giếng đối chứng (mẫu cây khỏe) thấp hơn

Có được ưu điểm này là nhờ kháng thể đặc hiệu virus và kháng thể đặc hiệu kháng thể tạo ra từ động vật máu nóng khác loài (Rowhani and Falk, 1995) [60] Theo L.F Salazar (1990) phương pháp ELISA nói chung nhạy cảm rất nhiều và cũng cần ít huyết thanh hơn các phương pháp huyết thanh khác [10] Chúng tôi lựa chọn phương pháp ELISA gián tiếp để xác định nguyên nhân gây bệnh virus ToMV và PVX trên cây cà chua

1.1.6 Nghiên cứu phương pháp truyền lan và xác định bệnh virus bằng cây chỉ thị

Cây chỉ thị là cây báo hiệu hoặc giúp con người phát hiện ra một hiện tượng, một sự vật mà họ quan tâm Trong công tác bảo vệ thực vật, một số loài cây rất mẫn cảm đối với một số chủng hoặc loài vi sinh vật gây bệnh được dùng làm cây chỉ thị Trồng hỗn hợp các loại cây này lẫn với các cây khác, khi

thấy xuất hiện triệu chứng bệnh là biết ở nơi đó có bệnh

Phương pháp sử dụng cây chỉ thị được áp dụng từ sau những năm 20 của thế kỷ thứ 20, các phòng thí nghiệm bệnh lý thực vật trên thế giới không chỉ sử dụng cây chỉ thị để chẩn đoán bệnh virus thực vật mà còn sử dụng trong

việc chẩn đoán các chủng virus, nòi nấm, vi khuẩn và các nguyên nhân gây bệnh khác trên thực vật [22]

Với bệnh virus hại thực vật, phương pháp sử dụng cây chỉ thị không thể thiếu được Ngoài tác dụng chẩn đoán trong phòng thí nghiệm phương pháp dùng cây chỉ thị còn có tác dụng nhân virus, tạo số lượng virus lớn để phục vụ nghiên cứu cơ bản trong phòng thí nghiệm [22, 46]

Chỉ riêng đối với virus khảm lá cà chua ToMV gây trên thực vật đã có nghiên cứu thực nghiệm trên 20 loại cây ký chủ khác nhau gồm:

Capsicum annuum, Capsicum frutescens, Chenopodium amaranticolor, Chenopodium murale, Chenopodium quinoa, Datura metel, Lycopersicon esculentum, Nicotiana benthamiana, Nicotiana clevelandii, Nicotiana glutinosa, Nicotiana meyalosiphon, Nicotiana rustica, Nicotiana tabacum, Petunia hybrida, Physalis floridana, Physalis peruviana, Solanum giganteum, Solanum melongena, Solanum nigrum

Nghiên cứu đã xác định và phân loại ký chủ theo mức độ nhiễm bệnh khác nhau: [7,15, 16, 39, 49]

+ Cây ký chủ chính:

- Cây khoai tây (Solanum tuberosum)

- Cây cà chua (Lycopercicon esculentum)

- Cây thuốc lá (Nicotiana tabacum)

- Cây ớt (Capsicum annuum, Capsicum frutescens)

+ Cây ký chủ phụ:

- Cây Artichoke (Scolymus sp)

- Cây Củ cải (Brasicarapa)

- Cây nho (Vitis viniera)…

+ Cây ký chủ hoang dại:

- Cây Rau dền dại (Amaranthus retroflexus)

- Cây Rau muối trắng (Chenopodium album L.)

Biểu hiện triệu chứng bệnh trên các cây ký chủ khác nhau được các tác

giả xác định: Trên cây Solanum giganteum gây khảm lá hệ thống Trên cây Nicotiana tabacum gây vết chết cục bộ, Các cây mẫn cảm hay được dùng làm cây chỉ thị thuộc họ cà (Solanaceae) (17/18), họ cây Rau muối (Chenopodiaceae) (3/3)

Thực nghiệm nghiên cứu về Potato virus X cũng xác định được dạng

triệu chứng bệnh Trên cây Cà độc dược (Datura stramonium) gây nhiễm hệ

thống đốm vàng hình nhẫn, gây khảm và các đường vằn lốm đốm Trên cây thuốc lá cũng gây triệu chứng tương tự Một số cây thường dùng để lây nhiễm nhân tạo đối với PVX là: [7,15, 16, 39, 49]

- Cây cải củ (Brassica campestris L.)

- Cây cà độc dược (Datura stramonium)

- Cây cúc bách nhật (Gomphrena globosa)

- Cây thuốc lá (Nicotiana tabacum)

- Cây khoai tây (Solanum tuberosum)

2.2 Những nghiên cứu trong nước

Bệnh virus đầu tiên được ghi nhận ở Việt Nam là bệnh lúa vàng lụi ở Tây Bắc hại trên lúa nếp vào năm 1910 và Lạng Sơn năm 1920 [dẫn qua 21, 23] Đến nay, bệnh virus thực vật đã được chú trọng nghiên cứu từ nhiều tác giả Nguyễn Thơ, Nguyễn Hữu Thụy, Vũ Triệu Mân, Hà Minh Trung, Ngô Bích Hảo

- Năm 1967: Nguyễn Hữu Thụy đã xác định sự có mặt của Virus X

khoai tây

- Nguyễn Thơ và Bùi Văn ích (1968) đã xác định được bệnh xoăn vàng lá cà chua (TYLCV) ở Việt Nam là khá phổ biến và gây thiệt hại lớn nhất trên

cây cà chua Bệnh lan truyền qua bọ phấn (Bemisia tabaci) từ 3 đến 4 bọ phấn

tiếp xúc cây bệnh và lây truyền trên cây khỏe đã có khả năng lây bệnh tốt [dẫn qua 21]

- Năm 1971: Hà Minh Trung, Nguyễn Phương Đại đã điều tra bệnh virus khoai tây trên giống khoai tây Thường Tín và kiểm tra virus bằng phương pháp huyết thanh và phương pháp so màu đã xác định được các virus

X, Y, S, M và xác định virus gây triệu chứng cuốn lá có tỉ lệ nhiễm cao từ 76% tới 100% số mẫu ở một số vùng khoai tây

- Năm 1969 - 1972: Lần đầu tiên Nguyễn Thơ đã sản xuất huyết thanh TMV

- Năm 1972: Nguyễn Thơ xác định virus X và một số virus khác xuất hiện trên khoai tây ở Gia Lâm - Hà Nội

- Năm 1973: Vũ Triệu Mân bằng cách sử dụng ba phương pháp nghiên cứu, phương pháp cây chỉ thị, phương pháp ELISA, phương pháp hiển vi điện

tử đã xác định được 7 virus chính gây hại trên khoai tây ở miền Bắc Việt Nam Trong số này có virus khảm lá khoai tây (PVX)

- Năm 1976: Hà Minh Trung, Nguyễn Phương Đại kiểm tra virus trên khoai tây bằng phương pháp huyết thanh đã có kết luận Các virus X, Y, S, M

đã nhiễm trên khoai tây với tỷ lệ nhiễm từ 10, 3% đến 66, 1%

- Vũ Triệu Mân (1981) thì virus khoai tây hại trên cây cà chua với tỷ lệ 20% trong vụ đông và trong vụ xuân hè gần 25% tổng số cây bệnh Các chủng virus PVX1, PVX2 đều có mặt trên cây cà chua [dẫn qua 19]

- Ngô Bích Hảo (2001) khi nghiên cứu bệnh virus truyền qua hạt giống

của một số cây rau và cây họ đậu (Fabaceae) đã tìm thấy có 14 loại virus trên

hạt giống Trong đó virus khảm lá cà chua ToMV là một trong những virus truyền qua hạt giống đã được xác định ở miền Bắc Việt Nam [12] Theo nghiên cứu của Ngô Bích Hảo và ALbrechtsen (2002) thì trong 41 mẫu hạt giống đã được xác định cơ bản của cây cà chua, cà tím, cà pháo, ớt cay và ớt ngọt thì có tới 24% mẫu hạt nhiễm virus ToMV [13]

Bằng các phương pháp sử dụng cây chỉ thị, phương pháp ELISA, phương pháp kính hiển vi điện tử tác giả đã xác định được chủng của ToMV gây hại trên cà chua cà pháo ở một số tỉnh ở miền Bắc Việt Nam Là chủng 0

và chủng 1 Hạt giống nhiễm ToMV chính là nguồn nhiễm cho vụ sau Là nguyên nhân gây thoái hoá giống và làm giảm năng suất cà chua [13, 14]

- Theo Nguyễn Thơ (1984): Khi mật độ bọ phấn (Bemisisa tabaci) từ

56 đến 58 con /cây cà chua thì tỷ lệ bệnh xoăn vàng lên tới 99,44% Khi ghép cây mang mầm bệnh với gốc cây khỏe thì tỷ lệ bệnh là 100% [27]

- Để phòng trừ bệnh xoăn vàng cà lá chua, từ những năm 1968 - 1970, Nguyễn Thơ và cộng tác viên đã sử dụng thuốc trừ sâu Bi58 để diệt bọ phấn [8] Theo Nguyễn Thơ (1984) tỷ lệ cây cà chua nhiễm bệnh TMV ở vùng Hà Nội từ 50 - 100% [27]

- Vũ Triệu Mân (1984) khi nghiên cứu bệnh virus hại khoai tây giống Ackersegen trồng ở miền bắc Việt Nam đã xác định được hai chủng PVX1, PVX2 Theo tác giả, khi PVX kết hợp với PVY làm cho cây khoai tây xoăn lùn, củ nhỏ hoặc không có củ PVX còn gây hại trên các cây trồng họ cà khác như cà chua, ớt, thuốc lá Tác giả phân 5 loại triệu chứng cơ bản của virus khoai tây trên cà chua là: Xoăn xanh ngọn, xoăn vàng ngọn, xoăn lùn, xoăn cuốn lá và khảm lá [19]

- Theo Vũ Triệu Mân (1984): Trên cà chua ngoài bệnh xoăn vàng lá cà chua (Tomato yellow leaf curl) còn có các bệnh virus khác thường gặp là virus

Y, virus X, TMV, CMV Trên ruộng cà chua thường xuất hiện với những triệu

chứng hỗn hợp do nhiều virus gây ra Thường một cây có thể có tới hai virus trở lên, có trường hợp tới 4 đến 5 virus [dẫn qua 21] Bệnh xoăn vàng lá thường gặp ở cà chua Các bệnh virus khác cũng thường gặp là virus Y, virus

X, virus TMV Việt Nam thường thấy triệu chứng hỗn hợp do nhiều virus gây

ra nên rất khó tìm thấy ở một cây nhiễm riêng một virus

Theo kết quả nghiên cứu của Vũ Triệu Mân (1984), các virus gây hại trên khoai tây giống Ackersegen trồng ở miền Bắc Việt Nam là (Potato virus

X ( PVX ), Potato virus Y, ( PVY ), Potato virus M, ( PVM ), Potato virus A, (PVA) Potato virus V (PVV), Potato leaf roll virus ( PLRV ) và ( Potato aucuba mosaic virus, (PAMV) Bằng các phương pháp huyết thanh, phương pháp hiển vi điện tử và phương pháp cây chỉ thị tác giả đã xác định được các

virus khoai tây hại trên một số giống cây trồng họ cà (Solanaceae) trồng ở

một số tỉnh miền Bắc Việt Nam là PVX, PVY, PMV, PVS và Tobaco mosaic virus (TMV) [19]

- Năm 1989, Vũ Triệu Mân nghiên cứu về PVX trên giống khoai tây Ackersegen đã xác định tác nhân gây bệnh PVX gồm hai chủng XV1 và XV2 Hai chủng này có kích thước chiều dài từ 510nm đến 515nm, đường kính chiều rộng là 11nm, ngưỡng pha loãng của huyết thanh là 1/100.000, thời gian

tồn tại trong Invitro ở 20 0C là 30 ngày, Q10 = 70 - 750 C Tác giả kết luận, bệnh virus hại khoai tây xuất hiện ở khắp các vùng trồng khoai tây của đồng bằng Bắc bộ Tỷ lệ bệnh quan sát được bằng mắt thường chiếm 40%, nếu tính cả bệnh ẩn sẽ tới 90% [20]

- Các virus Tobacco mosaic virus (TMV), Cucumber mosaic ( CMV),

X, Y, Papaya ring spot virus (PRSV), PMV được nghiên cứu và sản xuất thử huyết thanh tại trường Đại học Nông nghiệp I, kỹ thuật ELISA được sử dụng

để xác định các virus trên

- Năm 1991 - 1992: Vũ Triệu Mân và H Lecoq (INRA - Pháp) và các

cộng tác viên đã áp dụng phương pháp ELISA để xác định một số virus có mặt trên 24 loài cây trồng Trong đó có cây cà chua

- Năm 1993 - 1997: James L Dales, Vũ Triệu Mân, Ngô Bích Hảo, Trường Đại học Nông nghiệp I sử dụng phương pháp ELISA để chẩn đoán bệnh cây để chẩn đoán bệnh virus hại chuối và đu đủ

- Năm 1996: Lê Sơn Hà, Hoàng Hải Vũ, Trung tâm kiểm dịch thực vật sau nhập I đã sử dụng phương pháp DAS - ELISA để chẩn đoán bệnh ẩn trên các giống cây trồng nhập nội ở miền Bắc Việt Nam Kết quả kiểm tra trên 9 giống khoai tây và cà chua đã xác định được 7 giống bị nhiễm virus ở các mẫu kiểm tra Virus PLRV: 12,5% đến 15,0% mẫu khoai tây giống, trên các giống IHD 130 (úc), 8% - 10% trên giống IHD (úc), 14% trên giống Lệ Hoa (Trung Quốc), 6% trên giống Diamant và 4% trên giống Nicolas Virus PVA: 18% trên giống Lệ Hoa, 14% trên giống Nicolas Đặc biệt, giống khoai tây Xuyên Vụ cũng xuất hiện PVX với tỷ lệ 4% số mẫu kiểm tra, các mẫu cà chua chưa thấy xuất hiện bệnh virus trong mẫu [11] Các tác giả kết luận, có thể ứng dụng phương pháp ELISA vào phục vụ công tác kiểm dịch thực vật để chẩn

đoán bệnh virus Củ khoai tây Trung Quốc nhập vào Việt Nam trên giống Lệ Hoa bị nhiễm cả hai virus PVX và PVY [11]

- Theo Nguyễn Văn Tuất (Viện Bảo vệ thực vật, 2002), virus sau khi đã xâm nhiễm vào cây trồng và gây ra nhiều triệu chứng khác nhau mà chúng ta

có thể quan sát được bằng mắt thường Tuy nhiên, cũng có trường hợp không ghi nhận được bất cứ một biểu hiện nào khác bằng mắt thường người ta gọi là

- Theo Hà Minh Trung (1996), nhiều loài virus khoai tây và các cây thuộc họ cà đã được phát hiện vào giai đoạn 1970- 1975 như virus X, Y, M, S,

L, TMV, CMV… giai đoạn này đã sử dụng các phương pháp lây bệnh bằng côn trùng môi giới, cây chỉ thị, phản ứng kháng huyết thanh [30] Những kết quả nghiên cứu đã công bố đặc biệt có ý nghĩa cho việc định hướng cho các nghiên cứu về sau

- Theo Ngô Bích Hảo (2002) ngoài các bệnh virus trên cây cà chua còn

bị các virus khác gây hại là CMV, ToMV, PVV [13]

- Ngô Bích Hảo và cộng tác viên (2003) đã điều tra nghiên cứu bệnh khảm vàng lá ở vùng Hà Nội và phụ cận đã xác định ToMV gây hại khá phổ biến, bệnh xuất hiện từ giai đoạn phân cành, gây hại mạnh vào giai đoạn ra hoa, hình thành quả, và có xu hướng giảm vào giai đoạn thu hoạch Theo tác giả thì triệu chứng do ToMV gây ra chủ yếu là loại hình khảm vàng, dạng dương xỉ có xuất hiện nhưng ít và thường xuất hiện vào giai đoạn phân cành,

đến khi thu hoạch Cây cà chua bị nhiễm triệu chứng khảm, khảm, vàng, xoăn vàng lá dương xỉ, thì phát triển kém, nếu bị nhiễm vào giai đoạn trước ra hoa thì thường không cho thu hoạch Trong ruộng sản xuất vào vụ xuân hè thì có tới 4/5 giống nhiễm ToMV, bị nhiễm nặng nhất là giống Xanhpie (Pháp) Giống số 609 không thấy nhiễm ToMV Bằng phương pháp cây chỉ thị, ELISA Ngô Bích Hảo đã xác định được một số cây ký chủ của ToMV là cà chua, cà pháo, cà độc dược, cà bát, cà dại [14]

- Ngô Bích Hảo (2003) khi kiểm tra 10/ 15 mẫu hạt giống cà chua thu thập ở một số tỉnh phía bắc nhiễm ToMV, trong đó giống Xanhpie (Pháp), Tidi) Nhật, Đài Loan Nguồn hạt ở Hà Nội và phụ cận bị nhiễm ToMV với tỷ

lệ 66,6% [14]

- Đoàn Thị ái Thuyền, Lưu Việt Dũng, Vũ Triệu Mân (2003) đã phát hiện tới 30,23% số mẫu nhiễm virus ToMV, PVX, PVY trong tổng số 140

mẫu thử của một số cây trồng thuộc họ cà (Solanaceae) trong đó có tới

23,25% số cây trồng thuộc cây họ cà bị nhiễm ToMV, 36% mẫu bị nhiễm

đồng thời cả ba virus ToMV, PVX, PVY Tỷ lệ mẫu nhiễm cả hai virus ToMV

và PVY chiếm 18,20% [28] Từ đây các tác giả khẳng định cần phải sản xuất thành công một số Kit ELISA ở Việt Nam để chẩn đoán bệnh virus điều này góp phần giảm giá thành nhập khẩu, nâng cao chất l−ợng nghiên cứu chẩn

đoán bệnh và bảo vệ sản xuất Nông nghiệp ở Việt Nam

3 Đối tượng, địa điểm, vật liệu, nội dung

và phương pháp nghiên cứu

3.1 Đối tượng nghiên cứu

- Bệnh virus khảm lá cà chua (Tomato mosaic virus - ToMV) trên cà chua

- Bệnh virus khảm lá khoai tây (Potato virus X - PVX) trên cà chua

3.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

+ Thời gian thực hiện đề tài: Từ tháng 10 / 2005 đến tháng 10 / 2006 + Địa điểm thực hiện đề tài:

- Vùng trồng cà chua ở huyện An Lão - Thành phố Hải Phòng

- Trung tâm Bệnh cây nhiệt đới - Trường Đại học Nông nghiệp I – Hà Nội

3.3 Vật liệu nghiên cứu

3.3.1 Thu thập mẫu

Mẫu lá cà chua bị bệnh được thu thập trên những cây có triệu chứng bị virus điển hình, ngay trên ruộng sản xuất cà chua tại điểm điều tra Mỗi mẫu lá khi thu thập được bảo quản trong điều kiện khô, mẫu được cho vào túi polyethylen có đánh số thứ tự và ký hiệu Sau đó, toàn bộ mẫu được cho vào trong hộp xốp có lót những chai nước đá lạnh Đảm bảo sao cho mẫu lá luôn tươi và đạt yêu cầu trước khi kiểm tra virus bằng phương pháp Indirect - ELISA Trọng lượng mỗi mẫu thu thập từ 15 đến 20 gam Trọng lượng mỗi mẫu đưa vào kiểm tra ELISA là 2 gam Các mẫu đã xác định được virus cần kiểm tra được thu lại 10 gam lá bảo quản trong lạnh - 20oC để lây bệnh nhân tạo trên cây chỉ thị

Các mẫu hạt giống được thu thập từ các đại lý bán hạt giống, từ hạt giống khảo nghiệm và nông dân đang sử dụng ở địa điểm nghiên cứu

3.3.2 Thiết bị, dụng cụ, hoá chất nghiên cứu [22]

+ Thiết bị nghiên cứu :

- Máy đọc bản ELISA, tủ lạnh bảo quản mẫu, tủ định ôn, cân điện tử

+ Dụng cụ nghiên cứu :

- Bình thuỷ tinh loại 50 - 1000 ml

- Phễu lọc, vải lọc, giấy thấm

- Hộp nhựa có nắp để đựng bản ELISA

+ Hoá chất:

Các hoá chất thông dụng và hoá chất để pha dung dịch đệm, chất nền, các kháng huyết thanh của ToMV và PVX

3.3.3 Nội dung nghiên cứu

3.3.3.1 Điều tra diễn biến triệu chứng bệnh virus trên đồng ruộng vụ đông xuân 2005 - 2006 tại Hải Phòng

3.3.3.2 Xác định bệnh hại cà chua, bệnh virus ToMV và PVX trong thời gian thực tập

3.3.3.3 Mô tả triệu chứng bệnh khảm lá virus ToMV và PVX hại cà chua 3.3.3.4 Tìm hiểu phương thức truyền của bệnh khảm lá virus hại cà chua ToMV và PVX

3.3.3.5 Đánh giá ảnh hưởng của bệnh khảm lá virus hại cà chua đến năng suất một số giống cà chua trồng phổ biến ở điểm điều tra

3.3.3.6 Kiểm tra nguyên nhân gây bệnh virus bằng phương pháp Indirect ELISA

3.3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.3.4.1 Phương pháp nghiên cứu ngoài đồng

- Lựa chọn những khu ruộng chuyên canh rau màu thuộc địa điểm nghiên cứu, chọn ngẫu nhiên một ruộng cà chua đại diện cho cho giống, đại diện cho giai đoạn sinh trưởng và phát triển của cà chua và tiến hành điều tra theo dõi các chỉ tiêu

- Điều tra theo phương pháp 5 điểm đường chéo góc Mỗi điểm điều tra

từ 50 đến 100 cây đối với ruộng có diện tích lớn Điều tra 100% số cây đối với

đối với ruộng có diện tích nhỏ

- Theo dõi diễn biến của tập hợp các dạng triệu chứng bệnh virus gây ra trên cà chua

- Theo dõi diễn biến các dạng triệu chứng bệnh virus gây ra trên cà chua

- Thu thập mẫu bệnh để kiểm tra ToMV và PVX trên thực tiễn sản xuất ngoài đồng ruộng

- Các cây cà chua đã xác định được virus ToMV hoặc PVX được đánh dấu cố định cây để tiến hành tiếp tục theo dõi một số chỉ tiêu sinh trưởng,

- Tiến hành gieo trồng các cây chỉ thị bao gồm một số cây thuộc họ