3. Đối t−ợng, địa điểm, vật liệu, nội dung và ph−ơng pháp nghiên cứu
3.3.4.2.Ph−ơngpháp xác định bệnh trong phòng [22, 24, 46]
+ Lây bệnh trên cây chỉ thị :
- Sử dụng các mẫu cà chua đã đ−ợc xác định nhiễm virus ToMV và PVX thu từ điểm điều tra. Bảo quản các mẫu bệnh này ở điều kiện nhiệt độ lạnh sâu - 200C để làm nguồn bệnh lây nhiễm khi tiến hành thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo.
thuốc lá, và cây ký chủ hoang dại. Các cây ký chủ làm cây lây nhiễm đ−ợc kiểm tra đảm bảo sạch bệnh virus, đất trồng đ−ợc xử lý nhiệt và nguồn n−ớc đ−ợc sử dụng riêng biệt. Nhà l−ới trồng cây đ−ợc cách ly côn trùng, để khống chế các nguồn virus khác xâm nhiễm bệnh vào cây ký chủ tham gia thí nghiệm. Các cây sau khi lây nhiễm đ−ợc đ−a vào trong lồng l−ới và chăm sóc ở điều kiện bình th−ờng
- Giá thể để gieo cây chỉ thị, cây ký chủ phụ :
Đất phù sa đ−ợc hấp khử trùng trong nồi hấp chuyên dụng ở nhiệt độ từ 115 đến 1200C, 45 phút để tiêu diệt các nguồn bệnh vi sinh vật và côn trùng gây bệnh nh− nấm, vi khuẩn , tuyến trùng và các sinh vật khác có trong đất thí nghiệm. Đất sau khi đã đ−ợc hấp khử trùng đ−ợc bổ xung phân bón vi sinh và trấu hun tạo đ−ợc giá thể dùng để gieo trồng cây chỉ thị. Cây chỉ thị đ−ợc gieo trồng chăm sóc cẩn thận. Khi cây lớn, đạt số lá thật nhất định thì tiến hành lây nhiễm nhân tạo. Với cây thuốc lá đạt 4 - 6 lá thật, cây rau muối và các cây khác có từ 8 - 10 lá thật [22].
+ Cây chỉ thị và cây ký chủ phụ :
Hạt cây chỉ thị dùng trong lây nhiễm nhân tạo do Trung tâm Bệnh cây nhiệt đới cung cấp. Một số cây cỏ dại đ−ợc thu thập từ đồng ruộng. Khi tiến hành làm thí nghiệm phải đeo găng tay cao su, sử dụng các biện pháp khử trùng dụng cụ thí nghiệm bằng hoá chất. Thực hiện lây nhiễm vào các buổi chiều mát. Sau khi lây nhiễm xong tiến hành theo dõi các chỉ tiêu gồm tỷ lệ phát bệnh, triệu chứng nhiễm bệnh.
- Thành phần cây lây nhiễm : + Các cây ký chủ thuộc họ Cà :
- Nicotiana benthamiana, N. glutinosa, N. tabacum cv Samsun, N. tabacum cv. White Burley, N. tabacum cv. Xanthi - nc.
+ Các cây ký chủ hoang dại :
- Cây Rau muối (Chenopodium quinoa), cây Rau muối (Chenopodium amaranticolor), cây Cúc bách nhật (Gomphrena globosa L), cây Tầm bóp
(Physalis angulata L), cây Cà độc d−ợc (Datura strammonium L), cây ớt
(Capsicum annuum L), Rau muối dại (Chenopodium album L), cây rau dền xanh (Amaranthus viridis L).
Cây ký chủ là cây trồng khác: Cây Đậu đen (Vigna unguiculata L.), cây Đậu côve (Phaseolus vulgaris), cây Bí ngô (Cucurbita pepo L).
- Khi cây lây nhiễm có số lá thật đạt yêu cầu thí nghiệm thì tiến hành làm thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo cho cây lây nhiễm bằng ph−ơng pháp tiếp xúc cơ học. Lây bệnh bằng ph−ơng pháp tiếp xúc giọt dịch [22, 24]
- Nghiền mẫu lá bệnh trong dung dịch đệm phosphatase (Na2HPO4 + K2HPO4) 0.1 M, pH = 7, với tỷ lệ 1 gam lá/ 2 - 4 ml dung dịch đệm bằng chày cối sứ để duy trì hoạt tính của virus. Sau đó thêm vào một chút bột Cacborandum 600 Mesh (lấy một ít bằng khoảng 1/2 hạt đậu xanh) vào hỗn hợp dịch trên. Cối sứ chứa hỗn hợp dung dịch trên đ−ợc đặt vào trong hộp đá lạnh nhằm tránh mất hoạt tính của virus [22, 24].
- Đeo găng tay cao su và dùng ngón trỏ nhúng vào dịch hỗn hợp có chứa virus rồi sát nhẹ lên lá cây theo chiều từ cuống lá đến chóp lá. Sau khi đã lây bệnh xong một loại virus thì tháo bỏ toàn bộ găng tay, chày cối sứ đã dùng và thay mới hoàn toàn để chuyển sang lây một lợi virus khác. Sau thời gian lây nhiễm từ 30 - 45 phút thì rửa dịch chiết và bột Cacborandum 600 Mesh bám trên bề mặt lá để thuận lợi cho việc quan sát triệu chứng bệnh sau này đ−ợc rõ ràng. Đ−a cây vào buồng cách ly chăm sóc và theo dõi triệu chứng biểu hiện bệnh của cây lây nhiễm. Ghi chép, quan sát mô tả và đánh giá kết quả các chỉ tiêu theo dõi. Tiến hành theo dõi triệu chứng bệnh bằng việc quan sát các biến đổi trên cây, đặc điểm hình dạng và kích th−ớc vết bệnh, đặc
biệt là thời gian sau lây nhiễm 4 - 5 ngày [22, 24].
+ Kiểm tra virus bằng ph−ơng pháp ELISA:
- Sử dụng ph−ơng pháp: indirect - ELISA để xác định nguyên nhân gây bệnh Các b−ớc cơ bản trong ph−ơng pháp Indirect - ELISA
B−ớc 1: Cố định virus vào bản
Cố định dịch cây bệnh cần kiểm tra vào bản ELISA. Sử dụng mỗi mẫu lá cần kiểm tra cho vào túi nilon sau đó nghiền mẫu trong dung dịch đệm PBS (tỷ lệ 1/10) tỷ lệ mẫu lá/ dung dịch đệm PBS là 1/20 (gam). Nhỏ 100 ml/giếng của bản (bản ELISA loại 96 giếng). Để qua đêm ở 4oC hoặc 37oC trong 2 giờ.
B−ớc 2: Rửa bản bằng dung dịch đệm PBS - T ba lần và n−ớc cất hai lần, mỗi lần cách nhau 3 phút
B−ớc 3: Chuẩn bị mẫu cây khỏe (cây đã đ−ợc kiểm tra ELISA không bị nhiễm virus) nghiền trong dung dịch đệm pha huyết thanh (PBS - T 1000ml + 2% Ovabumin) theo tỷ lệ 1/20. Lọc qua vải ta thu đ−ợc dịch cây khỏe theo nồng độ pha loãng của từng loại kháng huyết thanh, khuấy đều và để 45 phút trong điều kiện 370C.
B−ớc 4: Cố định kháng huyết thanh vào bản ELISA. Nhỏ vào mỗi giếng 100ml kháng huyết thanh đã pha loãng trong dịch cây khỏe sau đó cho bản ELISA vào trong hộp ẩm và để ở điều kiện nhiệt độ 370C trong 90 phút.
B−ớc 5: Rửa bản bằng dung dịch đệm PBS - T ba lần và n−ớc cất hai lần, mỗi lần cách nhau 3 phút
B−ớc 6: Cố định kháng huyết thanh của kháng nguyên với độ hòa loãng 1/100 àm /giếng. Đặt bản ELISA vào hộp bảo quản để ở nhiệt độ 370C trong 90 phút.
B−ớc 7: Rửa bản bằng dung dịch đệm PBS - T ba lần và n−ớc cất hai lần, mỗi lần cách nhau 3 phút.
B−ớc 8: Cố định chất nền và đánh giá kết quả. Pha 0,25 mg NNP/1ml đệm Subtra rồi hoà tan bằng máy khuấy từ sau đó nhỏ 100 àm / giếng của bản ELISA. Đ−a bản ELISA vào hộp ẩm ở điều kiện nhiệt độ trong phòng thí nghiệm trong thời gian 60 phút.
B−ớc 9: Đọc kết quả. Các giếng có màu vàng là giếng có phản ứng nhiễm bệnh cần kiểm tra. Các giếng không có màu là mẫu không bị nhiễm. Đọc kết quả bằng cách đ−a bản ELISA vào máy đọc ở b−ớc sóng 405nm. Kết quả thu đ−ợc là bản đọc trị số ELISA .
3.3.4.3. Ph−ơng pháp xử lý số liệu [2, 9, 17, 25]- Tỷ lệ bệnh : TLB (%) = .100 - Tỷ lệ bệnh : TLB (%) = .100 B A Trong đó: TLPB (%): Tỷ lệ bệnh đ−ợc tính bằng %. A: Số cây có triệu chứng nhiễm bệnh virus. B: Tổng số cây đ−ợc điều tra
- Tỷ lệ phát bệnh: TLPB (%): TLPB (%) = .100 D C
Trong đó: TLPB (%): Tỉ lệ cây phát bệnh sau lây nhiễm đ−ợc tính bằng %. C: Số cây biểu hiện triệu chứng nhiễm bệnh sau lây nhiễm virus. D: Số cây đ−ợc đ−ợc đem lây nhiễm của công thức thí nghiệm.
- Tỷ lệ bệnh : TLNB (%) = .100 G
E
Trong đó:
TLNB (%): Tỉ lệ nhiễm bệnh đ−ợc tính bằng %.
E: Số cây đem thử phản ứng ELISA sau lây nhiễm cho phản ứng d−ơng (+) G: Tổng số cây đã đem lây nhiễm đ−ợc thử ELISA
(OD > X + 3*SD) SD là độ lệch chuẩn của các mẫu đối chứng âm kết quả kiểm tra mẫu khỏe không có triệu chứng nhiễm bệnh (Rowhani A. and Falb.W.1995) [60]
+ Các số liệu đ−ợc xử lý bằng ph−ơng pháp thống kê sinh học thích hợp. Sử dụng phần mềm IRRISTAT 4.0 dùng cho khối Nông học. So sánh tính sai số thí nghiệm, hệ số biến động CV(%) và sai khác nhỏ nhất có ý nghĩa (LSD 0.5 ). Sử dụng EXCEL trong Microsoft office excel trên máy tính và sử dụng các công thức tính toán cơ bản trong ngành bảo vệ thực vật.