12 PT 48 Phòng trồng trọt sở NN& PTNT Hải Phòng 0,07 1 13 VF10 HTX NN An Thọ An Lão 0,107
4.1.7.Kết quả lây nhiễm virus trên cây chỉ thị và cây ký chủ phụ trong phòng thí nghiệm
phòng thí nghiệm
Các tài liệu nghiên cứu tr−ớc đây ghi nhận sự tấn công gây hại của nhiều virus trên cùng một cây cà chua, việc cà chua có biểu hiện triệu chứng đặc tr−ng hay không cũng phụ thuộc vào nhiều yếu tố nh− : Điều kiện nhiệt độ, ánh sáng, độ dài ngày, sinh tr−ởng và phát triển của cà chua. Bên cạnh đó để tìm hiểu virus ToMV và PVX và những ảnh h−ởng đến cà chua trong vụ sản xuất. Chúng tôi tiến hành lây nhiễm virus trên cây chỉ thị nhằm xác định nhanh, rõ và chính xác nguyên nhân gây bệnh.
Để chẩn đoán nghiên cứu bệnh virus thực vật thì ng−ời ta sử dụng các ph−ơng pháp khác nhau nh− ph−ơng pháp kháng huyết thanh, ph−ơng pháp cây chỉ thị , ph−ơng pháp sinh học phân tử, ph−ơng pháp hiển vi điện tử .Từ lâu ph−ơng pháp cây chỉ thị đã đ−ợc dùng để chẩn đoán bệnh virus thực vật. Cây chỉ thị bệnh virus là những cây khi nhiễm, một virus sẽ xuất hiện những triệu chứng đặc tr−ng [21,22,24]
Đặc điểm lớn của cây chỉ thị là chúng rất mẫn cảm với nguyên nhân gây bệnh, Triệu chứng bệnh xuất hiện rất đặc tr−ng, rõ, thời gian phát bệnh ngắn. Có nhiều tác giả coi triệu chứng gây hại của một virus nào đó xuất hiện trên cây chỉ thị đ−ợc coi là triệu chứng đặc tr−ng của virus đó. Khi lây nhiễm virus trên cây chỉ thị , ng−ời ta thấy virus có thể nhiễm bộ phận (necrosis), nhiễm hệ thống (systemic) hay vừa nhiễm hệ thống, vừa biểu hiện vết bệnh bộ phận (hay cục bộ) [dẫn qua 22]. Sử dụng ph−ơng pháp cây chỉ thị là nhằm xác định một bệnh do virus gây nên, ngoài ra ng−ời ta còn sử dụng cây chỉ thị để nhân virus,
tách lọc virus trong một số tr−ờng hợp. Trong phần nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng ph−ơng pháp cây chỉ thị trong điều kiện nhiệt độ của mùa đông và điều kiện nhiệt độ của mùa hè nhằm mục đích chẩn đoán bệnh, xác định phổ ký chủ và tìm hiểu sự tác động của điều kiện nhiệt độ đến cây chỉ thị bị lây nhiễm virus. Kết quả lây nhiễm đ−ợc trình bày ở bảng 4.15, 4.16, 4.17, 4.18.
Qua bảng 4.15, chúng tôi thấy rằng, các cây chỉ thị đ−ợc lây bệnh nhân tạo virus PVX bằng ph−ơng pháp tiếp xúc cơ học đều cho biểu hiện triệu chứng điển hình của virus PVX. Tỷ lệ cây phát bệnh (TLPB) 100%. Số cây phát bệnh / số cây thí nghiệm của các cây họ cà (Solanaceae) là 5/5, họ rau muối (Chenopodiaceae) là 2/2 và họ rau dền (Amaranthaceae) là 1/1.
Trong 8 cây thí nghiệm thì cây Cúc bách nhật (Gomphrena globosa) có thời kỳ tiềm dục (TKTD) ngắn nhất là 5 ngày với TLPB là 100% , khi kiểm tra lại bằng ph−ơng pháp ELISA thì phần trăm cây nhiễm bệnh (CNB) cũng là 100% nh−ng giá trị mật độ quang học OD của các phản ứng d−ơng (+) thấp nhất đạt 0,257, tiếp theo là cây rau muối Chenopodium quinoa có giá trị OD chỉ đạt 0,290, TKTD là 8 ngày. Trong khi đó các cây thuốc lá có giá trị OD rất cao. Cao nhất Nicotiana tabacum cv. Xanthi - nc có giá trị OD là 1,395, TLPB là 100% và TKTD là 6 ngày. Các cây chỉ thị đ−ợc nhiễm PVX trong điều kiện mùa đông nhiệt đọ thấp, thời tiết mát mẻ thì biểu hiện rõ triệu chứng của virus PVX, TKTD ngắn, TLPB cao, đạt 100%. Điều này có thể giải thích hiện t−ợng mất triệu chứng trên đồng ruộng của các cây cà chua khi bị nhiễm PVX, khi ở điều kiện nhiệt độ cao, triệu chứng PVX ít biểu hiện triệu chứng. Các cây họ thuốc lá đều có giá trị OD cao, TKTD cũng chỉ từ 6 - 8 ngày cho nên dùng những cây chỉ thị này để chẩn đoán và nhân nguồn bệnh virus PVX đều rất tốt. Cây Cúc bách nhật (Gomphrena globosa) cho triệu chứng đặc tr−ng của PVX là các đốm chết hoại cục bộ hình nhẫn viền xung quanh vết bệnh có màu đỏ. Đây là cây chẩn đoán PVX rất tốt.
Bảng 4.15. Kết quả lây bệnh nhân tạo PVX (potato virus X) bằng ph−ơng pháp cây chỉ thị.
STT Cây thí
nghiệm Tên khoa học
SCPB/ SCTN SCTN (cây) TLPB (%) TKT D (ngày ) Trịsố ELISA (ODt405n m) Kết luận 1 Thuốc lá N. benthamiana 5/5 100 6 0.702 + 2 Thuốc lá N. glutinosa 5/5 100 7-8 0.709 + 3 Thuốc lá N.tabacum cv Samsun 5/5 100 6 - 7 0.996 + 4 Thuốc lá N.tabacum cv White Burley 5/5 100 6 0.871 + 5 Thuốc lá N..tabacum cv Xanthi – nc. 5/5 100 6 1.395 +
6 Rau muối Chenopodium quinoa
5/5 100 8 0.290 +
7 Rau muối C. amarnticolor. 5/5 100 6 0.305 + 8 Cúc Bách nhật Gomphrena globosa L. 5/5 100 5 0.257 + 9 Đối chứng âm (-): 0.086 10 Đối chứng d−ơng (+): 1.588
Ghi chú: SCPB: Số Cây phát bệnh; SCTN: Số cây thí nghiệm
• Cây đối chứng không bị nhiễm bệnh .
• ODtb: Giá trị mật độ quang trung bình của các phản ứng d−ơng (+).
+ Theo dõi, quan sát và mô tả triệu chứng bệnh các cây chỉ thị và cây ký chủ phụ khi lây nhiễm PVX:
- Trên cây thuốc lá (N. benthamiana): Cây bị nhiễm bệnh hệ thống. Lá bị khảm th−ờng tạo thành từng mảng (xanh nhạt, xanh đậm, xen kẽ nhau) các
lại. Trên lá cây xuất hiện các vết chết hoại màu trắng. Cây sinh tr−ởng phát triển chậm lại. Triệu chứng chung: Lá bị khảm mảng, biến dạng, vết chết hoại màu trắng.
- Trên cây thuốc lá (N. glutinosa): Cây bị nhiễm lá hệ thống. Lá bị khảm th−ờng (xanh nhạt, xanh đậm, xen kẽ nhau. Lá non khảm mạnh bị biến dạng quăn queo. Một số cây xuất hiện các vết chết hoại hình nhẫn. Viền quanh vết bệnh có màu nâu nhạt. Cây bệnh cọc sinh tr−ởng chậm lại.
Trên cây thuốc lá (N.tabacum cv Samsun) Cây bị nhiễm bệnh hệ thống. Lá bánh tẻ, lá non bị khảm mạnh (xanh nhạt, xanh đậm, xen kẽ nhau), các lá bệnh còn thấy xuất hiện các đốm chết hoại. Gân lá sáng màu trắng, lá cây bệnh nhanh bị tàn
- Trên cây thuốc lá (N. tabacum cv White Burley): Cây bị nhiễm bệnh hệ thống. Lá bị khảm, đầu là các mẫng xanh nhạt, xanh đậm xen kẽ nhau. Sau đó, trên lá xuất hiện các vết đốm hoại màu trắng nhạt. Lá cây bệnh nhanh tàn lụi, cây còi cọc chậm phát triển.
- Trên cây thuốc lá (N. tabacum cv Xanthi - nc): Cây bị nhiễm bệnh hệ thống. Lá bị khảm th−ờng màu xanh nhạt, xanh đậm, xen kẽ nhau, sau đó xuất hiện các đốm chết màu trắng sáng nằm dọc theo gân chính và gân phụ của lá. Lá cây tàn lụi nhanh, cây bị chết rải rác sau 1 đến 2 tuần.
- Trên cây rau muối (Chenopodium quinoa): Triệu chứng bệnh ban đầu là các vết đốm chết hoại nhỏ li ti nh− kim châm. Chỉ thấy xuất hiện ở các lá giữa khi cây từ 7 đến 10 lá thật. Số l−ợng vết hoại trên lá nhiều. Xung quanh vết bệnh có màu đỏ nhạt, hình t−ơng đối tròn. Lá cây bệnh bị tàn lụi và rụng.
- Trên cây rau muối(Chenopodium amarnticolor): Triệu chứng ban đầu là các vết đốm chết hoại nhỏ li ti nằm rải rác trên lá. Sau đó từ 3 đến 4 ngày
vết bệnh to dần ra và làm chết nhu mô lá. Xung quanh vết các vết bệnh có màu đỏ nhạt, đa số có hình t−ơng đối tròn. Lá cây bệnh bị tàn lụi và rụng.
- Trên cây Cúc bách nhật (Gomphrena globosa L.): Cây bị nhiễm cục bộ. Lá cây bị đốm chết hoại, khi mới xuất hiện là các chấm nhỏ nằm rải rác trên bề mặt lá cây bệnh. Sau đó vết đốm chết hoại to dần ra, có hình nhẫn. Xung quanh vết bệnh có màu đỏ nhạt. Cây sinh tr−ởng phát triển chậm lại.
Kết quả thu đ−ợc từ bảng 4.15 có 4/8 loại cây thí nghiệm không thấy xuất hiện triêu chứng bệnh mặc dù đã đ−ợc lây nhiễm nhân tạo cùng ở điều kiện nhiệt độ thấp. Cây không xuất hiện triệu chứng là cây đậu đen, cây đậu cove, cây bí ngô và cây dền xanh thuộc các họ thực vật, Họ đậu (Fabaceae), họ bầu bí (Curcubitaceae), họ dền (Amaranthaceae)
Các cây xuất hiện triệu chứng bệnh là cây cà độc d−ợc (Datura strammonium L.), cây ớt (Capsicum annuum L.), cây rau muối (Chenopodium album L.) thuộc họ rau muối (Chenopodiaceae). TLPB của cây cà độc d−ợc (D. strammonium L.) là 100%, TKTD từ 6 - 7 ngày, giá trị OD là 0, 264. Cây ớt (C. annuum L.) có TKTD dài hơn 11 -12 ngày nh−ng TLPB đạt 100% và có giá trị OD cao nhất (0,437). TLPB của cây tầm bóp (P. angulata L.) và cây rau muối dại (C. album L.) đều đạt 60% và đạt giá trị OD lần l−ợt là 0,314 và 0,261. Kiểm tra lại bằng ph−ơng pháp ELISA thì % cây nhiễm bệnh của hai loại cây này vẫn chỉ đạt 60%.
Nh− vậy, các cây nhiễm bệnh đều có thể là nơi l−u trữ nguồn bệnh virus PVX và lan truyền trên ruộng cà chua ngoài đồng ruộng.
Bảng 4.16. Kết quả xác định ký chủ phụ của PVX trên một số cây trồng và cỏ dại bằng ph−ơng pháp lây nhiễm nhân tạo
STT Cây thí
nghiệm Tên khoa học
SCPB/ SCTN SCTN (cây) TLPB (%) TKTD (ngày) Trịsố ELISA (OD405nm) Kết luận 1 Cà độc d−ợc Datura stramonium L. 5/5 100,00 6 – 7 0.264 + 2 Cây ớt Capsicum annuum L. 5/5 100,00 11 – 12 0.437 + 3 Cây Đậu đen Vigna unguiculata L. 0/5 - - - - 4 Cây Đậu côve Phaseolus vulgaris L. 0/5 - - - - 5 Cây Tầm bóp Physalis angulata L. 3/5 60,00 7 0.314 +
6 Cây Bí ngô Cucurbita pepo L. 0/5 - - 7 Cây Rau muối dại Chenopodium album L. 3/5 60,00 12 0.261 + 8 Cây Dền xanh Amaranthus viridis L. 0/5 - - - - 9 Đối chứng d−ơng (+):0.493 10 Đối chứng âm (-); 0.081
Ghi chú: Cây đối chứng bị nhiễm bệnh . Đối chứng d−ơng: (+): cây nhiễm bệnh. Đối chứng âm: (-),: Cây không nhiễm bệnh. Giá trị mật độ quang trung bình của các phản ứng d−ơng (+): OD.
Kết hợp bảng 15, 16 chúng tôi cho rằng :
Các cây thí nghiệm bị nhiễm bệnh trong điều kiện lây bệnh nhân tạo đều có thể là nguồn lây lan bệnh do virus PVX gây nên. Do đó, không nên trồng xen canh, luân canh cây cà chua với các cây trồng thuộc họ cà.
Cần nhổ bỏ loại trừ các cây cỏ dại, đặc biệt, virus PVX lan truyền mạnh qua vết th−ơng cơ giới do đó khi tiến hành trồng, chăm sóc các cây cà chua cần hạn chế gây tổn th−ơng xây sát cây cà chua nhằm tránh sự lây lan của bệnh theo con đ−ờng này.
Bảng 4.17. Kết quả lây bệnh nhân tạo ToMV bằng ph−ơng pháp cây chỉ thị.
STT T
Cây thí
nghiệm Tên khoa học
SCPB/SCTN SCTN (cây) TLPB (%) TKTD (ngày) Trị số ELISA (OD,40 5nm) Kết luận 1 Thuốc lá Nicotiana benthamiana 4/5 80,00 12 -13 0,812 + 2 Thuốc lá N. glutinosa 5/5 100,00 7 -8 1,015 + 3 Thuốc lá N.tabacumcv Samsun 5/5 100,00 9 - 12 1,121 + 4 Thuốc lá N. tabacum cv White Burley 5/5 100,00 18 - 20 0,968 + 5 Thuốc lá N.tabacumcv Xanthi-nc 4/5 80,00 16 -18 1,006 + 6 Rau muối Chenopodium amarnticolor . 5/5 100,00 13 -14 0,850 +
7 Rau muối C. quinoa 3/5 60,00 7 -8 1,038 + 8 Bách nhật Gomphrena
globosa L. 4/5 80,00 14 -16 0,684 + 9 Đối chứng (-): 0,143
10 Đối chứng (+): 1,151
Ghi chú:
- Cây đối chứng không bị nhiễm bệnh; Đối chứng d−ơng: (+): Nhiễm bệnh. - Đối chứng âm: (-): Không nhiễm bệnh.
Số liệu kết quả lây nhiễm nhân tạo ToMV (bảng 4.17) trên các cây chỉ thị có một số vấn đề nổi lên nh− sau:
Các loài cây tham gia thí nghiệm đều xuất hiện triệu chứng bệnh, trong đó các cây họ cà ( Solanaceae) 5/5, họ rau muối (Chenopodiuaceae) 2/2 và họ dền (Amaranthaceae) 1/1.
Cây thuốc lá Nicotiana tabacum cv . Samsun có giá trị OD cao nhất đạt 1,121, TKTD từ 9 - 12 ngày, TLPB 100%. Cây Cúc bách nhật (Gomphrena globosa
L. ) có giá trị OD thấp nhất0,684, TKTD là 14 - 16 ngày, TLPB 100%. Cây rau Muối có tỷ lệ phát bệnh thấp nhất, chỉ đạt 60%, giá trị OD là 0,850.
Kiểm tra bằng ph−ơng pháp ELISA thì thấy tỷ lệ cây nhiễm bệnh vẫn chỉ đạt 60 %. Kết quả thu đ−ợc thể hiện rõ ràng về độ mẫn cảm của cây chỉ thị khác nhau tuỳ thuộc vào mỗi loài cây khác nhau.
Qua theo dõi thí nghiệm, chúng tôi còn thấy. Các cây thí nghiệm đ−ợc lây nhiễm trong điều kiện nhiệt độ của mùa hè vẫn xuất hiện triệu chứng bệnh do ToMV điển hình mà không thấy xuất hiện hiện t−ợng “bệnh ẩn”.
+ Theo dõi, quan sát và mô tả triệu chứng bệnh các cây chỉ thị và cây ký chủ phụ khi lây nhiễm ToMV:
- Cây thuốc lá (Nicotiana benthamiana): Triệu chứng ban đầu xuất hiện trên lá cây bệnh là cá đốm chết hoại nhỏ. Các vết bệnh to dần ra làm chết nhu mô lá . Vết bệnh có dạng hình tròn. Viền vết bệnh có màu vàng nhạt, tâm vết bệnh màu xám trắng. Trên lá, vết bệnh có màu vàng úa kèm theo các vết đốm chết hoại nằm rải rác trên bề mặt lá. Lá cây dần bị lụi.
- Cây thuốc lá (N. glutinosa): Ban đầu triệu chứng xuất hiện là các vết chấm. Nhỏ, không rõ màu sắc, ở lá cây bệnh. Vết bệnh to dần ra làm chết nhu mô lá. Vết bệnh cómàu sắc hơi tròn hoặc tròn. Quan sát kỹ thấy vị trí mô bệnh chỉ là lớp màng rất mỏng. Lá cây bị bệnh tàn lụi. Cây chết sau 1 đến 2 tuần.
- Cây thuốc lá (N.tabacum cv Samsun): Cây bị nhiễm hệ thống. Lá bị khảm vết khảm có màu xanh đậm nằm dọc theo gân chính và gân phụ. Gân
phụ vết khảm nổi gờ rất rõ. Vết khảm nổi gờ rõ ở lá bánh tẻ và lá ngọn. Lá bệnh hơi cong xuống phía d−ới.
- Cây thuốc lá (N. tabacum cv santhi nc): Cây bị nhiễm hệ thống. Lá bị khảm vết khảm có màu xanh nhạt xanh đậm riêng biệt. Lá ngọn.lá bánh tẻ bị khảm rõ hơn các lá ở phía gốc. Lá non vết khảm tạo nên các u lồilõm làm cho lá biến dạng. ở các lá bánh tẻ vết khảm là các vùng xanh đậm và nổi gờ lên. cây sinh tr−ởng và phát triển chậm lại.
- Cây rau muối (Chenopodium amarnticolor): Triệu chứng bệnh ban đầu là các vết đốm chết hoại nhỏ li ti nh− kim châm. Về sau to lên và nằm sít vaò nhau.. vết bệnh có màu úa vàng, không rõ viền vết bệnh. Lá cây bệnh bị tàn lụi và rụng.
- Cây cúc bách nhật (Gomphrena globosa L):Cây bị nhiễm cục bộ. khi mới xuất hiện là các chấm nhỏ nằm rải rác trên bề mặt lá cây bệnh. Sau đó vết đốm chết hoại to dần ra, có hình hơi tròn hoặc hình nhẫn. Xung quanh vết bệnh có màu vàng úa Cây sinh tr−ởng phát triển chậm lại.
Kết quả lây nhiễm nhân tạo trên một số cây ký chủ phụ của ToMV (bảng 4.18) có sự thay đổi về sự xuất hiện triệu chứng bệnh ở các loài cây tham gia thí nghiệm so với các cây chỉ thị (bảng 4.17). Chỉ có 5/8 loài cây thấy xuất hiện triệu chứng bệnh. Các cây không xuất hiện triệu chứng bệnh là các cây cỏ hoang dại gồm, cây dền xanh, cây diếc không cuống, cây màn rìa. Các cây này th−ờng mọc nhiều ở các bờ ruộng cao, cùng với nhiều loài cỏ dại khác. Còn lại, có tới 4/5 loài cây xuất hiện triệu chứng bệnh thuộc các cây họ cà. Cây cà pháo (Solanuum meongena L. ) và cây Mịn thảo lá nhỏ (Lindernia L. F. Muell) có tỷ lệ phát bệnh thấp nhất (60%). Tuy nhiên giá trị OD của hai loài cây này lại khác nhau. Cây cà pháo có giá trị OD cao nhất (1,076), cây Mịn thảo lá nhỏ (0,692). Từ số liệu thu đ−ợc và quan sát thí nghiệm, chúng tôi cho rằng, cây cà pháo khó nhiễm virus ToMV hơn cây Mịn thảo lá nhỏ nh−ng khi virus đã nhiễm vào thì virus ToMV phát triển trong dịch cây cà pháo mạnh hơn
Bảng 4.18. Kết quả xác định ký chủ phụ của ToMv trên một số cây trồng và cỏ dại bằng ph−ơng pháp lây nhiễm nhân tạo.
TT Cây thí nghiệm Tên khoa học
SCPB/SCTN SCTN (cây) TLPB (%) TKTD (Ngày) Trị số ELISA (OD,405 nm) Kết luận 1 Diếc không cuống Alternathea sessilis L. 0/5 - - 0 - 2 Dền xanh Amaranthus viridis L. 0/5 - - 0 - 3 ớt Capsicum L. 0/5 100.00 16 -17 0,711 - 4 Cà độc d−ợc Datura strammonium L. 5/5 80,00 19 - 22 0,905 -