Sản xuất và đánh giá chất lượng khối tiểu cầu lọc bạch cầu

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Tiểu cầu là một trong những thành phần máu đóng vai trò quan trọng trong quá trình đông cầm máu.Truyền khối tiểu cầu trong trường hợp xuất huyết do giảm số lượng hoặc giảm

KHỐI TIỂU CẦU LỌC BẠCH CẦU

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2015

KHỐI TIỂU CẦU LỌC BẠCH CẦU

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT

iii

LỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn:

- PSG.TS Nguyễn Thị Kiều Anh, người thầy đã tận tình dạy dỗ tôi, đã cho tôi những kinh nghiệm và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện

đề tài

- GS.TS Nguyễn Anh Trí, Viện trưởng Viện Huyết học - Truyền máu trung ương, người thầy tận tâm dạy tôi, tạo mọi điều kiện thuận lợi, cho tôi những kinh nghiệm quý báu và hướng dẫn tôi phương pháp thực hiện đề tài

- BSCKII Phạm Tuấn Dương, người thầy tận tâm dạy tôi, tạo mọi điều kiện thuận lợi và cho tôi những kinh nghiệm thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn sâu sắc:

- Ban giám hiệu và phòng sau Đại học, Trường Đại học Dược Hà Nội

- Bộ môn Phân tích, chuyên ngành kiểm nghiệm thuốc và độc chất, Trường Đại học Dược Hà Nội

- Khoa điều chế các thành phần máu, Viện Huyết học - Truyền máu trung ương

- CN Đỗ Thị Hiền, Phó trưởng khoa điều chế các thành phần máu, Viện Huyết học - Truyền máu trung ương

- CN Trần Thị Thủy, khoa điều chế các thành phần máu, Viện Huyết học - Truyền máu trung ương

- Thạc sỹ Phan Hữu Quang, Ban quản lý chất lượng, Viện Huyết học - Truyền máu trung ương

Tôi xin chân thành cảm ơn:

- Khoa miễn dịch di truyền, Khoa sinh hóa, Khoa tế bào và tổ chức học, Khoa

vi sinh, Viện Huyết học - Truyền máu trung ương

- Các kỹ thuật viên y, dược sỹ, điều dưỡng Khoa điều chế các thành phần máu, Viện Huyết học - Truyền máu trung ương

Cuối cùng tôi xin chân thành biết ơn:

Gia đình nội, ngoại, cha mẹ, chồng và hai con thân yêu đã động viên và

hy sinh cho tôi những gì tốt đẹp nhất để tôi học tập và hoàn thành luận văn Các bạn thân, các đồng nghiệp đã cùng chia sẻ khó khăn, nhiệt tình, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn

HÀ NỘI, THÁNG 8 NĂM 2015

DS Võ Thị Diễm Hà

iv

BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG KHOÁ LUẬN

Các chữ viết tắt Viết đầy đủ

AABB American Association of Blood Banks ADP Adenosin Diphosphate

ATP Adenosin Triphosphate CPD Citrate-phosphate-Dextrose DEHP Di-2 ethlhexl-phthalate HBV Hepatitis B virus HCV Hepatitis C virus HLA Human Leukocyte Antigen HPA Human Platelet Antigen HIV Human Immunodeficienal virus

IL Interleukin KTC-BC Khối tiểu cầu pool lọc bạch cầu

LDH Lactate de hydrogenase SLTC Số lƣợng tiểu cầu SLBC Số lƣợng bạch cầu SLHC Số lƣợng hồng cầu

v

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Cấu trúc và chức năng tiểu cầu 3

1.1.1 Cấu trúc của tiểu cầu 3

1.1.2 Chức năng của tiểu cầu 4

1.1.2.1 Chức năng dính 4

1.1.2.2 Chức năng ngưng tập 5

1.1.2.3 Chức năng chế tiết 6

1.1.2.4 Khả năng hấp thụ và vận chuyển các chất 6

1.2 Sinh hóa của tiểu cầu 6

1.2.1 Các quá trình chuyển hóa của tiểu cầu không hoạt hóa 6

1.2.1.1 Chuyển hóa carbohydrate tiểu cầu 7

1.2.1.2 Chuyển hóa lipid tiểu cầu 7

1.2.2 Các quá trình chuyển hóa của tiểu cầu hoạt hóa 7

1.3 Phân loại khối tiểu cầu và các phương pháp sản xuất khối tiểu cầu 8

1.3.1 Khối tiểu cầu sản xuất từ máu toàn phần 8

1.3.1.1 Tách từ huyết tương giàu tiểu cầu 8

1.3.1.2 Phương pháp tách tiểu cầu từ buffy coat 9

1.3.2 Khối tiểu cầu lọc bạch cầu 10

1.3.3 Khối tiểu cầu gạn tách từ một người hiến 10

1.3.4 Khối tiểu cầu chiếu xạ 10

1.3.5 Khối tiểu cầu bổ sung dung dịch bảo quản tiểu cầu 10

1.4 Bảo quản tiểu cầu 11

1.4.1 Nhiệt độ bảo quản 11

1.4.2 Lắc trong quá trình bảo quản 11

1.4.3 Túi bảo quản khối tiểu cầu 12

1.4.4 Tình hình nhiễm khuẫn của khối tiểu cầu trong quá trình bảo quản 12

1.4.5 Sự thay đổi các yếu tố của khối tiểu cầu trong quá trình bảo quản 12

1.4.5.1 Hoạt độ lactat dehydrogenase 12

1.4.5.2 Lactat, độ pH và glucose 13

1.4.5.3 Ion Calci 13

1.4.5.4 Kiểm tra độ vẩn xoáy của tiểu cầu 13

1.5 Một số chỉ tiêu chất lượng khối tiểu cầu lọc bạch cầu 14

1.6 Đánh giá độ ổn định của chế phẩm khối tiểu cầu 15

vi

1.7 Điều kiện bảo quản và hạn sử dụng 15

1.8 Tác hại của bạch cầu, cytokin, chất trung gian và gốc tự do trong an toàn truyền máu 16

1.8.1 Cytokin trong máu bảo quản 16

1.8.2 Các chất trung gian trong máu bảo quản 17

1.8.3 Các men bạch cầu trong máu bảo quản 17

1.8.4 Các chất tự do trong máu bảo quản 18

1.8.5 Gây phản ứng miễn dịch đồng loài ……… ….20

1.8.6 Giải pháp nhằm giảm tác dụng phụ của khối tiểu cầu 20

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Đối tượng nghiên cứu 21

2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn 21

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ và nguyên vật liệu 21

2.1.3 Thời gian nghiên cứu 22

2.2 Phương pháp nghiên cứu 22

2.2.1 Kỹ thuật sản xuất khối tiểu cầu pool lọc - bạch cầu từ lớp Buffycoat của máu toàn phần 22

2.2.2 Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cấp cơ sở của khối bạch cầu pool lọc bạch cầu 25

2.2.2.1 Tính chất / cảm quan 26

2.2.2.2 Thể tích của chế phẩm 26

2.2.2.3 Các chỉ số huyết học 26

2.2.2.4 Khảo sát chỉ số sinh hóa 27

2.2.3 Đánh giá độ ổn định về chất lượng của khối tiểu cầu pool lọc bạch cầu 28

2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu 28

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 29

3.1 Kết quả nghiên cứu sản xuất khối tiểu cầu lọc bạch cầu 29

3.1.1 Đánh giá nguyên liệu túi Buffy coat pool trước khi ly tâm lần 2 29

3.1.3 Hiệu suất thu được của Khối tiểu cầu pool lọc bạch cầu 31

3.1.4 Giới hạn số lượng bạch trong Khối tiểu cầu pool lọc bạch cầu 32

3.2 Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cấp cơ sở của khối tiểu cầu pool lọc bạch cầu mới sản xuất 33

3.3 Độ ổn định 35

3.3.1 Tính chất/ cảm quan 36

3.3.2 Chỉ tiêu số lượng tiểu cầu 36

3.3.3 Chỉ số pH 37

3.3.4 Chỉ số Glucose 38

vii

3.3.5 Chỉ số LDH 39

3.3.6 Độ vẩn xoáy của tiểu cầu 40

3.3.7 Độ vô khuẩn 40

3.2.7 Hình ảnh khối tiểu cầu pool lọc bạch cầu sau khi sản xuất 41

Chương 4 BÀN LUẬN 42

4.1 Sản xuất khối tiểu cầu pool lọc bạch cầu bằng phương pháp Buffy coat 42

4.2 Về tiêu chuẩn chất lượng của khối tiểu cầu pool lọc bạch cầu 44

4.3 Đánh giá độ ổn định của khối tiểu cầu lọc bạch cầu 48

KẾT LUẬN 49

KIẾN NGHỊ 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO 52

viii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Một số chỉ tiêu chất lượng của khối tiểu cầu lọc bạch cầu 14

Bảng 2.2 Các chương trình ly tâm 24

Bảng 3.3 Thể tích của túi Buffy coat 29

Bảng 3.4: Thể tích túi KTC-BC 30

Bảng 3.5 Hiệu suất thu được của KTC-BC 31

Bảng 3.6: Số lượng bạch cầu trong KTC-BC và tỷ lệ loại bỏ bạch cầu trong quá trình sản xuất 32

Bảng 3.7: Bảng kết quả đánh giá các chỉ tiêu chất lượng của KTC-BC ngay sau khi sản xuất 34

Bảng 3.8: Xây dựng tiêu chuẩn dự thảo cấp cơ sở khối tiểu cầu pool lọc bạch cầu 35 Bảng 3.9: Số lượng tiểu cầu thay đổi theo thời gian bảo quản 36

Bảng 3.10: pH thay đổi theo thời gian bảo quản 37

Bảng 3.11: Glucose thay đổi theo thời gian bảo quản 38

Bảng 3.12: LDH thay đổi theo thời gian bảo quản 39

Bảng 3.13: Độ vẩn xoáy thay đổi trong thời gian bảo quản 40

Bảng 3.14: Thể tích, số lượng tiểu cầu và số lượng bạch cầu của KTC-BC 43

ix

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Cấu trúc tiểu cầu dưới kính hiển vi điện tử 3

Hình 1.2: Ảnh chụp tiểu cầu bình thường và trạng thái hoạt động dưới KHV điện tử 4

Hình 2.3 Sơ đồ khảo sát và lựa chọn qui trình sản xuất KTC-BC 25

Hình 3.4: Hiệu suất tách khối tiểu cầu pool lọc bạch cầu khi khảo sát chương trình ly tâm 31

Hình 3.5: Sự thay đổi số lượng tiểu cầu theo thời gian bảo quản 36

Hình 3.6: Sự thay đổi của pH theo thời gian bảo quản 37

Hình 3.7 Sự thay đổi của glucose theo thời gian bảo quản 38

Hình 3.8 Sự thay đổi của LDH theo thời gian bảo quản 39

Hình 3.9: Hình ảnh túi KTC - BC 41

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC Phụ lục 1: Bảng so sánh chất lượng, hiệu quả, chi phí giữa các loại khối tiểu cầu 56 Phụ lục 2: Quy trình điều chế khối hồng cầu, khối tiểu cầu bằng phương pháp Buffy coat 57

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Tiểu cầu là một trong những thành phần máu đóng vai trò quan trọng trong quá trình đông cầm máu.Truyền khối tiểu cầu trong trường hợp xuất huyết do giảm số lượng hoặc giảm chức năng tiểu cầu là một liệu pháp điều trị quan trọng, ngăn chặn quá trình chảy máu, cứu sống người bệnh [21].Bên cạnh lợi ích cứu sống người bệnh, khối tiểu cầu còn có các tác dụng phụ Một trong những nguyên nhân đó là do sự có mặt của bạch cầu trong khối tiểu cầu Những bất lợi do bạch cầu gây ra như sau: 1) Gây miễn dịch đặc biệt là kháng nguyên HLA (kháng nguyên bạch cầu) và HPA (kháng nguyên tiểu cầu), gây miễn dịch hệ HLA sẽ làm tăng nguy cơ thải ghép cho những bệnh nhân tiến hành ghép tạng [32] 2) sốt, rét run, mẩn ngứa, dị ứng, mày đay do trong quá trình bảo quản khối tiểu cầu, bạch cầu sẽ bị thoái hóa, giải phóng nhiều chất hóa học trung gian và các cytokin 3) Có thể gây ra tổn thương phổi cấp tính (TRALI) [21] Vì vậy, cần loại bỏ bạch cầu trong chế phẩm khối tiểu cầu [18]

Trên thế giới, việc sản xuất và bảo quản khối tiểu cầu được bắt đầu từ máu toàn phần vào những năm 1950 Đến nay, việc sản xuất khối tiểu cầu còn được cải thiện liên tục nhằm làm giảm thiểu các phản ứng phụ, nâng cao chất lượng truyền khối tiểu cầu như lọc bạch cầu, khối tiểu cầu bổ sung dung dịch bảo quản Ngoài khối tiểu cầu được sản xuất từ máu toàn phần, việc sản xuất khối tiểu cầu bằng gạn tách từ một người hiến máu là một thành tựu lớn

mở đầu cho thời kỳ điều chế thành phần máu bằng gạn tách với các thiết bị tự động hiện đại

Ở nước ta, việc sản xuất huyết tương giàu tiểu cầu bắt đầu từ năm 1984 tại Viện huyết học – Truyền máu TƯ trong hệ thống hở sử dụng chai thủy tinh Từ đó đến nay, ở các trung tâm truyền máu lớn như : Viện huyết học – Truyền máu Trung ương, Bệnh Viện Huyết học – Truyền máu Hồ Chí

2

Minh,Trung tâm truyền máu Chợ Rẫy, Trung tâm truyền máu Huế, Trung tâm Truyền máu Cần Thơ… đã qua nhiều bước cải tiến Trong lĩnh vực điều chế khối tiểu cầu từ máu toàn phần có các phương phápsau: Sản xuất khối tiểu cầu pool tách từ nhiều túi máu toàn phần bằng phương pháp huyết tương giàu tiểu cầu, sản xuấtkhối tiểu cầu pool tách từ nhiều túi máu toàn phần bằng phương pháp Buffy coat Khối tiểu cầu này vẫn còn lẫn nhiều bạch cầu

Đứng trước tình trạng này, hãng Terumo đã sản xuất ra kít - PB dùng để sản xuất khối tiểu cầu - lọc bạch cầu, loại túi này bắt đầu được đưa vào Việt Nam Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương bước đầu sản xuất thử nghiệm nhằm đểđáp ứng được nhu cầu điều trị cho bệnh nhân về số lượng, chất lượng của chế phẩm khối tiểu cầu Khối tiểu cầu pool – lọc bạch cầu được sản xuất từ nguồn nguyên liệu dồi dào là các túi máu toàn phần, sau đó loại bỏ bạch cầu bằng màng lọc

Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài với mục tiêu sau:

1 Sản xuất chế phẩm khối tiểu cầu pool - lọc bạch cầu

2 Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cơ sở của khối tiểu cầu pool - lọc bạch cầu

3 Đánh giá độ ổn định của khối tiểu cầu pool - lọc bạch cầu

3

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Cấu trúc và chức năng tiểu cầu

Tiểu cầu là một trong những thành phần có vai trò quan trọng của quá trình cầm máu và đông máu.Tiểu cầu là những mảnh tế bào nhỏ, không nhân, được sinh ra từ tủy xương [10] Bình thường chỉ có khoảng 2/3 số lượng tiểu cầu lưu hành ở máu ngoại vi, tương đương 150-500 x 109/l; còn khoảng 1/3 được tích tụ ở lách Đời sống của tiểu cầu khoảng 8-10 ngày [2]

1.1.1 Cấu trúc của tiểu cầu

Dưới kính hiển vi điện tử, tiểu cầu là một tế bào hình đĩa không nhân, kích thước từ 3-8 μm, cấu trúc bao gồm: Màng tiểu cầu, hệ thống vi ống, vi sợi, các hạt đặc và hệ thống kênh mở, bề mặt tiểu cầu xù xì, trên bề mặt xuất hiện những nụ sùi kéo dài khoảng 14-20 nm, người ta cho rằng các nụ sùi trên được tạo bởi các glycoprotein, glycolipid, mucosposaccharide và các protein huyết tương được hấp thụ, ngoài ra còn một số hình cưa ở trên bề mặt của tiểu cầu Các hình cưa này được xem là phần cửa của hệ thống kênh mở (hình 1.1

Hệ thống ống đặc

4

Hình 1.2: Ảnh chụp tiểu cầu bình thường và trạng thái hoạt động

dưới KHV điện tử 1.1.2 Chức năng của tiểu cầu

Chức năng cơ bản của tiểu cầu là tham gia quá trình cầm máu, đông máu nhằm bảo vệ cơ thể khỏi sự mất máu khi thành mạch bị tổn thương Khi tế bào nội mô bị tổn thương ngay tức khắc tiểu cầu dính vào thành mạch, giải phóng thành phần trong các hạt và kích thích các tiểu cầu khác dính vào gây ngưng tập, tiểu cầu tạo thành nút tiểu cầu sau cùng là tạo thành khối nơi thành mạch bị tổn thương [6]

1.1.2.1 Chức năng dính

Bình thường tiểu cầu không dính vào nội mô mạch máu còn nguyên vẹn do tế bào nội mô sản xuất ra prostaglandin I2 là yếu tố ức chế chức năng tiểu cầu, nhưng chỉ vài giây sau khi thành mạch bị tổn thương thì tiểu cầu được tập trung đến và dính vào nơi bị tổn thương [6], [10]

Thành phần tham gia hiện tượng dính bao gồm:

Collagen: Chất quan trọng để tiểu cầu bám dính, kích thích tiểu cầu ngưng tập – collagen tồn tại ở vùng gian bào của thành mạch, khi thành mạch tổn thương thì lớp collagen bị bộc lộ

6

1.1.2.3 Chức năng chế tiết

Với sự có mặt của collagen hoặc thrombin hoạt hóa sẽ dẫn đến việc tăng chế tiết của hạt tiểu cầu bao gồm ADP, serotonin, fibrinogen, men lysosome, β-thromboglobulin, heparin, collagen và thrombin hoạt hóa quá trình tổng hợp prostaglandin tiểu cầu Các chất trên không chỉ làm tăng hoạt hóa tiểu cầu tiếp theo mà còn có tác dụng tăng tính thấm thành mạch, hoạt hóa proteinC, tạo thromboxane A2 và prostacyclin Từ đây một chuỗi phản ứng gồm tăng tính thấm thành mạch, giảm Ca++

, ức chế ngưng tập tiểu cầu sẽ xảy ra [6], [7]

1.1.2.4 Khả năng hấp thụ và vận chuyển các chất

Tiểu cầu có khả năng hấp thụ các chất trong huyết tương và các tế bào

mô như serotonin, adrenalin, các yếu tố đông máu trong huyết tương…, nhờ

đó các chất cần thiết cho quá trình đông cầm máu được vận chuyển đến những nơi cần thiết để thực hiện nhiệm vụ [6]

1.2 Sinh hóa của tiểu cầu

Tiểu cầu là những mảnh nhỏ không nhân của tương bào mẫu tiểu cầu nên sự tổng hợp protein không có hoặc tổng hợp rất ít ở tiểu cầu Khi tiểu cầu không hoạt động thì sự ly giải đường và sự phosphoryl hóa là hai quá trình chuyển hóa chính Khi tiểu cầu bị hoạt hóa thì hai quá trình chuyển hóa này tăng lên rõ rệt, sự dịch chuyển của ion calci, sự phosphoryl hóa protein và sự giải phóng các arachide cũng xảy ra [6], [10]

1.2.1 Các quá trình chuyển hóa của tiểu cầu không hoạt hóa

Khi không hoạt động: tiểu cầu sử dụng năng lượng lấy từ ATP ATP có được từ sự thoái giáng của glycose, acid béo, acid amin từ huyết tương và từ glycogen của tiểu cầu

7

1.2.1.1 Chuyển hóa carbohydrate tiểu cầu

Con đường chuyển hóa chính của tiểu cầu để tạo năng lượng là sự phân giải glucose và glycogen, quá trình này phụ thuộc vào nồng độ glucose ngoại bào và oxy Tiểu cầu trong môi trường bảo quản không có đường và đầy đủ khí O2(hiệu ứng Crabtree) Ngược lại, sự hiện diện của glucose trong môi trường yếm khí sẽ ức chế tạo ATP của ty thể và làm tăng sự tạo thành lactat (hiệu ứng Pasteur) Nhờ hai hiệu ứng này mà tiểu cầu giữ được ATP ở mức hằng định Trong môi trường glucose sự chuyển hóa của glycogen tiểu cầu đáp ứng được nhu cầu ATP Khi glucose giảm xuống, chuyển hóa yếm khí của glycogen không đủ, vì vậy ATP giảm xuống

Sự phân giải glucose trong môi trường ái khí sẽ tạo ra pyruvat, chất này

bị oxy hóa thành CO2 và H2O trong ty thể tiểu cầu

Sự phân giải đường yếm khí là quá trình chuyển hóa glucose 6 phosphat thành lactate, có hai con đường hình thành glucose 6 phosphat Một là sự phosphoryl hóa của glucose được vận chuyển qua màng tế bào bởi hexokinase, hai là sự chuyển hóa từ glucose 1 phosphat là sản phẩm phân giải

từ glycogen, glucose 6 phosphat cũng được chuyển hóa bởi con đường hexose-monophosphate, quá trình này tạo ra CO2 và NADPH, chất này được dùng để tổng hợp acid béo

1.2.1.2 Chuyển hóa lipid tiểu cầu

Phospholipid được tạo thành nhờ sự kết hợp các acid béo

1.2.2 Các quá trình chuyển hóa của tiểu cầu hoạt hóa

Khởi đầu là sự gắn kết các chất đồng tác (agonist) khi tiểu cầu đáp ứng với các kích thích từ bên ngoài Các chất đồng tác có thể hòa tan hay không hòa tan như collagen Tiểu cầu tổng hợp các chất dẫn truyền tín hiệu có bản chất là lipid trên màng tiểu cầu sau khi đã gắn kết các chất đồng tác Chức

8

năng của tiểu cầu thay đổi do tác động trực tiếp hoặc gắn gián tiếp của các chất dẫn truyền tín hiệu [5] Các thụ thể dành cho chất đồng tác trên tiểu cầu gắn chặt với glycoprotein, các thụ thể này có thể biến đổi cấu trúc để đáp ứng với sự gắn các chất agonist khác nhau

Khi tiểu cầu bị hoạt hóa, các quá trình chuyển hóa tăng nhiều lần Chuyển hóa ATP tăng từ 3,6 ở trạng thái nghỉ lên 14,4 ATP mỗi phút cho 1011

TC Đồng thời sự dịch chuyển của các ion, đặt biệt là ion calci từ ngoại bào

và từ hạt đậm làm cho nồng độ calci trong bào tương của tiểu cầu tăng gây ra hiện tượng hoạt hóa các enzyme phụ thuộc calci như myosin light chain kinase, calpain I hay calpain II, các enzym này sẽ đóng vai trò quan trọng trong sự biến đổi hình dạng của tiểu cầu khi bị hoạt hóa Ion Kali còn đóng vai trò quan trọng trong việc đảm bảo tính toàn vẹn của tiểu cầu, nhất là bơm năng lượng như Na+

K+-ATPase, bơm Ca++

1.3 Phân loại khối tiểu cầu và các phương pháp sản xuất khối tiểu cầu 1.3.1 Khối tiểu cầu sản xuất từ máu toàn phần

Có hai phương pháp sản xuất khối tiểu cầu từ máu toàn phần :

1.3.1.1 Tách từ huyết tương giàu tiểu cầu

Ly tâmtúi máu toàn phầnvớilực ly tâm nhẹ, sao cho đảm bảo có số lượng tiểu cầu nhiều nhất trong huyết tương (huyết tương giàu tiểu cầu) nổi trên cùng, bạch cầu và hồng cầu lắng xuống dưới

Đặt túi máu toàn phần sau ly tâm vào bàn ép máu để tách huyết tương giàu tiểu cầu

Ly tâm huyết tương giàu tiểu cầu với tốc độ cao sao cho huyết tương nổi

ở trên và tất cả tiểu cầu được lắng xuống đáy túi Tách phần huyết tương nổi

[16]

1.3.1.2 Phương pháp tách tiểu cầu từ buffy coat

Ly tâm túi máu toàn phần vớilực ly tâm mạnh, sao cho túi máu phân thành 3 lớp, trên cùng là huyết tương, giữa là lớp buffy coat (lớp chứa bạch - tiểu cầu), cuối cùng hồng cầu

Tách lớp huyết tương ra trước sau đó tách lớp buffy coat

Ly tâm nhẹ túi chứa Buffy coat sao cho toàn bộ tiểu cầu nằm treo trong

huyết tương và ở lớp trên cùng lúc này tách được khối tiểu cầu [16]

Cứ mỗi túi máu toàn phần thể tích 350 ml sẽ tách được khối tiểu cầu gồm từ 45 x 109 đến 85 x 109tiểu cầu được treo trong 50 - 60 ml huyết tương,

số lượng bạch cầu tối đa cho phép là 0,05 x109 bạch cầu [16]

Vậy, từ hai phương pháp điều chế khối tiểu cầu trên, số lượng tiểu cầu thu được rất ít, chưa đủ cho một lần truyền, vì vậy cần phải pool (dồn) tiểu cầu từ các túi vào một túi để có số lượng tiểu cầu lớn khoảng 130 x 109, đủ cho một lần truyền Có thể pool (dồn) các túi khối tiểu cầu ngay sau khi điều chế vào một túi chứa to hơn hoặc có thể pool các túi chứa tiểu cầu bán thành phẩm vào túi chứa trong quá trình điều chế (tùy thuộc vào từng phương pháp) Khối tiểu cầu pool được tách ra từ 4 đến 6 túi máu toàn phần mà có

10

cùng nhóm máu hệ ABO được bảo quản ở nhiệt độ phòng 20 - 240C trong vòng 24 giờ

1.3.2 Khối tiểu cầu lọc bạch cầu

Là khối tiểu cầu đã được loại bỏ bạch cầu bằng bầu lọc Khối tiểu cầu này làm giảm nguy cơ đồng miễn dịch HLA, phản ứng ghép chống chủ [18]

và các phản ứng phụ khác do bạch cầu gây ra Số lượng bạch cầu cho phép tối

đa là 5 x 106

[11]

1.3.3 Khối tiểu cầu gạn tách từ một người hiến

Quy trình gạn tách bao gồm việc lấy máu toàn phần từ người hiến máu vào trong một thiết bị được thiết kế về cơ bản như một máy ly tâm, các thành phần của máu được ly tâm để phân tách Tách tiểu cầu và một phần huyết tương trực tiếp từ ven người hiến còn hồng cầu, bạch cầu, phần lớn huyết tương sẽ đượctự động trả lại người hiến Khối tiểu cầu - apheresis có số lượng tiểu cầu tối thiểu là 300 x 109 và trong thể tích huyết tương không dưới 300

ml, số lượng bạch cầutối đa khoảng 5 x 106, độ pH là 6,4-7,4 [16] Thời gian bảo quản là 5 ngày, nhiệt độ bảo quản từ 20-240C và phải được lắc liên tục

1.3.4 Khối tiểu cầu chiếu xạ

Là khối tiểu cầu được chiếu xạ gamma để bất hoạt bạch cầu lympho phòng ngừa nguy cơ bệnh ghép chống chủ trước khi truyền cho người bệnh mắc chứng suy giảm miễn dịch, với liều chiếu xạ cho mỗi lượt chiếu phải đạt

ít nhất 25 Gy (2.500cGy) Hạn sử dụng của tiểu cầu chiếu xạ không thay đổi sau chiếu xạ [1]

1.3.5 Khối tiểu cầu bổ sung dung dịch bảo quản tiểucầu

Là khối tiểu cầu được loại bỏ 60-65% huyết tương sau đó bổ sung dung dịch bảo quản tiểu cầu Khối tiểu cầu này có hạn sử dụng từ 7-9 ngày [13]

11

Dung dịch bảo quản bao gồm NaCl, Acetat, Citrat, pH = 7,0 - 7,2, ngoài

ra có một số thành phần khác như KCl, MgCl2, Gluconat [29], có tác dụng cải thiện sự sống cho tiểu cầu, giảm lượng huyết tương trong tiểu cầu và giảm nhẹ các phản ứng dị ứng huyết tương [33]

1.4 Bảo quản tiểu cầu

Bảo quản[1], [16], [17]các loại khối tiểu cầu đều ở các điều kiện sau: Duy trì ở nhiệt độ thích hợp 22 ± 240C

Lắc liên tục

Đựng trong túi dẻo có khả năng thấm khí giúp trao đổi khí qua màng của túi bảo quản

1.4.1 Nhiệt độ bảo quản

Trong tất cả các nghiên cứu về bảo quản tiểu cầu nhiệt độ từ 1 – 24oC, các tác giả đều nhận xét có mối tương quan rất chặt chẽ giữa thời gian bảo quản với việc mất hình thái đĩa của tiểu cầu Thực tế cho thấy rằng việc mất

đi hình thái bình thường của tiểu cầu là do tiểu cầu được bảo quản ở nhiệt độ lạnh Một số tác giả cho rằng tiểu cầu bị phá hủy khi bảo quản ở nhiệt độ

16oC trong vòng 16 giờ, ở 12oC trong vòng 10 giờ, ở 4oC trong vòng 6 giờ.Ngày nay, nhiều tác giả đã chứng minh rằng khối tiểu cầu được bảo quản

ở nhiệt độ thích hợp là 20 – 24o

C [1], [11], [16], [26]

1.4.2 Lắc trong quá trình bảo quản

Tiểu cầu được lắc liên tục trong quá trình bảo quản là một lựa chọn tối

ưu, nếu tiểu cầu không được xáo trộn (lắc) thì sản phẩm acid lactic sẽ tăng và dẫn đến pH của khối tiểu cầu giảm xuống, thậm chí nếu pH không giảm thì theo một số nghiên cứu cũng đã chỉ ra rằng tiểu cầu không được lắc sẽ bị vón

và vai trò của tiểu cầu trong điều trị sẽ không còn hiệu quả [16], [17]

12

Tránh có bọt khí trong tiểu cầu bảo quản [31]

1.4.3 Túi bảo quản khối tiểu cầu

Khối tiểu cầu bảo quản trong túi nhựa dẻo có thể trao đổi được khí Trong giai đoạn ổn định áp suất riêng phần O2 phản ánh độ thăng bằng giữa việc trao đổi khí qua túi dẻo và tiểu cầu sử dụng oxy, nếu tiểu cầu tăng lên thì oxy sẽ giảm đi cho đến khi nó ở trạng thái bình ổn, điểm bắt đầu của trạng thái thái bình ổn là chỉ khi lượng oxy có đủ cho nhu cầu của tiểu cầu, nếu thấp hơn điểm này tiểu cầu bị thiếu oxy

1.4.4 Tình hình nhiễm khuẫn của khối tiểu cầu trong quá trình bảo quản

Tình hình nhiễm khuẩn trong quá trình sản xuất và bảo quản khối tiểu cầu có thể xảy ra khi kim chọc ven được chọc qua vết sẹo hoặc nếp da ở vị trí khi sát trùng hoặc khi sát trùng ven không cẩn thận Nếu vi khuẩn vào trong túi máu toàn phần (là nguyên liệu để tách khối tiểu cầu) hoặc túi đựng tiểu cầu thì vi khuẩn phát triển rất nhanh vì nhiệt độ trong quá trình tách và bảo bảo quảnkhối tiểu cầu đều ở nhiệt độ 20 – 24oC và môi trường huyết tương đều là những yếu tố thuận lợi tạo điều kiện cho vi khuẩn phát triển[12]

So với các chế phẩm máu khác, chế phẩm tiểu cầu có nguy cơ nhiễm khuẩn và phản ứng truyền máu do nhiễm khuẩn xảy ra cao nhất và thường xảy ra vào cuối thời gian bảo quản (ngày bảo quản thứ 4, thứ 5) [21]

1.4.5 Sự thay đổi các yếu tố của khối tiểu cầu trong quá trình bảo quản 1.4.5.1 Hoạt độ lactat dehydrogenase

Là một enzyme lactate-dehydrogenase (LDH)xúc tác phản ứng chuyển lactact thành pyruvat Tế bào chất của tiểu cầu có chứa LDH Tiểu cầu phóng thích enzyme này vào môi trường khi bị tổn thương [14] Hoạt độ LDH tăng dần lên từ ngày thứ 1 đến ngày thứ 5 trong quá trình bảo quản khối tiểu cầu theo kết quả của nhiều nghiên cứu

13

1.4.5.2 Lactat, độ pH và glucose

Tiểu cầu dùng năng lượng nhờ vào sự tiêu thụ glucose theo con đường Embden-Meyerhoff Trong quá trình bảo quản, do điều kiện yếm khí nên sự chuyển hoá glucose tạo ra lactat [33] Độ pH củakhối tiểu cầu giảm là do sự tích tụ lactat Khối tiểu cầu bảo quản cần ổn định được độ pH từ 6,4- 7,4 [16].Nếu pH của khối tiểu cầu < 6,4 thì tiểu cầu sẽ trương lên, tiểu cầu chuyển

từ hình đĩa sang hình cầu; có thể khắc phục được những thay đổi này nếu tiểu cầu được đưa trở lại với pH sinh lý [9] Nếu pH từ 6,4-6,6 thì GPIb trên bề mặt tiểu cầu bị giảm Khi pH<6,3 thì tiểu cầu mất dạng đĩa và chức năng [33] Khi pH giảm xuống dưới 6 thì toàn bộ tiểu cầu sẽ chuyển thành hình cầu không hồi phục, các tế bào dần mất đi khả năng tiêu thụ O2 [13]

1.4.5.4 Kiểm tra độ vẩn xoáy của tiểu cầu

Đây là phương pháp kiểm tra định tính hình thái và chức năng của tiểu cầu Lắc nhẹ và soi túi chứa khối tiểu cầu dưới bóng đèn điện để quan sát hình thái của tiểu cầu khi tiểu cầu di chuyển tạo nên hình vẩn xoáy Hiện tượng tạo vẩn xoáy chứng tỏ tiểu cầu có hình dạng đĩa Hiện tượng vẩn xoáy được đánh giá bằng mắt thường và kết quả được phân loại theo cấp độ 0, +, ++ hoặc +++ (0= không có hiện tượng vẩn xoáy, tiểu cầu bị trương lên hình cầu; +++ = rất vẩn xoáy, tiểu cầu có dạng hình đĩa) [7]

14

1.5 Một số chỉ tiêu chất lượng khối tiểu cầu lọc bạch cầu

Bất cứ sản phẩm nào cũng cần có tiêu chuẩn chất lượng Tiêu chuẩn chất lượng để đảm bảo an toàn cho người hiến máu cũng như hiệu quả điều trị, an toàn cho người bệnh sử dụng máu Tiêu chuẩn chất lượng cần được phù hợp với các điều kiện của từng quốc gia

Tiêu chuẩn chất lượng của Mỹ, các nước Châu Âu và các nước phát triển đều gần như tương đương nhau.Ở Việt Nam, tiêu chuẩn chất lượng đã cập nhật và quy định áp dụng theo thông tư số 26/2013/TT-BYT hướng dẫn hoạt động truyền máu

Bảng 1.1 Một số chỉ tiêu chất lượng của khối tiểu cầu lọc bạch cầu

[1]

1 Thể tích

Tùy quốc gia, mật độ tiểu cầu >1,5 x

(*) Tiêu chuẩn Châu Âu: khối tiểu cầu pool lọc bạch cầu tách từ 4 - 6 túi máu toàn phần 450ml (tương đương 1,8 - 2,7 lít) tách được > 2 x 1011tiêu cầu và tối thiểu 75% mẫu kiểm tra phải đạt tiêu chuẩn này Tiêu chuẩn Mỹ: cứ 1 túi máu toàn phần 450ml tách được > 5,5 x 1010 tiểu cầu và tối thiểu 75% mẫu kiểm tra phải đạt tiêu chuẩn này Tiêu chuẩn Việt Nam: cứ 1 lít máu toàn

1.6 Đánh giá độ ổn định của chế phẩm khối tiểu cầu

Các kết quả kiểm tra phải đạt tiêu chuẩn chấp nhận

Phương pháp nghiên cứu độ ổn định thực của thuốc: là đánh giá bằng những thí nghiệm về lý, hóa, sinh học, vi sinh học của thuốc trong và ngoài thời gian dự kiến của tuổi thọ và bảo quản mẫu trong điều kiện mong muốn Kết quả này được sử dụng để thiết lập tuổi thọ, xác nhận tuổi thọ đã dự kiến

và đưa ra điều kiện bảo quản thích hợp[3]

1.7 Điều kiện bảo quản, hạn sử dụng, chỉ định và nhu cầu sử dụng

 Đối với khối tiểu cầu điều chế từ đơn vị máu toàn phần trong hệ thống kín: hạn sử dụng theo khuyến nghị của nhà sản xuất túi lấy máu, nhưng không quá 05 ngày kể từ ngày lấy máu và bảo quản tiểu cầu ở nhiệt độ từ

20oC đến 24o

C kèm theo lắc liên tục [1], [11], [17]

 Đối với khối tiểu cầu điều chế từ đơn vị máu toàn phần trong hệ thống hở: hạn sử dụng không quá 06 giờ, kể từ khi kết thúc điều chế khi bảo quản ở nhiệt độ từ 20oC đến 24o

C kèm theo lắc liên tục[1], [11], [17]

 Chỉ định: Điều trị chảy máu do nguyên nhân giảm số lượng tiểu cầu hoặc giảm chức năng tiểu cầu; phòng ngừa chảy máu do giảm tiểu cầu, chẳng hạn như suy tủy xương, sốt xuất huyết

 Chống chỉ định: Thường không chỉ định để phòng ngừa chảy máu cho bệnh nhân phẫu thuật, trừ khi có tình trạng giảm tiểu cầu rõ rệt trước mổ; Không chỉ định trong các trường hợp xuất huyết do giảm tiểu cầu tự miễn, xuất huyết giảm tiểu cầu do vón tiểu cầu, đông máu rải rác trong

C lắc liên tục, huyết tương bảo quản ở -35oC hoặc -85oC [7] Tất cả các thành phần này nếu còn bạch cầu đều có thể làm cho đơn vị máu trở thành không an toàn và giảm chất lượng Bạch cầu tác động xấu đến chất lượng máu bảo quản bởi các nguyên nhân sau:

1.8.1 Cytokin trong máu bảo quản

Các nghiên cứu gần đây về bạch cầu trong khối tiểu cầu và huyết tương giàu tiểu cầu bảo quản trong 7 ngày cho thấy các cytokine (TNF-α, IL-6, IL-8) tăng nhanh sau 2 ngày bảo quản [8] Mức độ tăng các cytokin phụ thuộc vào số lượng bạch cầu có trong khối tiểu cầu Nếu số lượng bạch cầu < 3×109trong một đơn vị tiểu cầu thì lượng cytokine rất thấp, nếu bạch cầu còn > 6×109 thì các cytokine đều tăng rất nhanh trong khối tiểu cầu bảo quản Giảm lượng bạch cầu trong các chế phẩm máu có thể giảm lượng cytokin và giảm các phản ứng truyền máu [34]

17

1.8.2 Các chất trung gian trong máu bảo quản

Bên cạnh sự có mặt của cytokine, các kết quả nghiên cứu còn cho thấy các chất trung gian có hoạt tính sinh lý cũng có mặt trong huyết tương bảo quản, mức độ của các chất trung gian như histamine, serotonin phụ thuộc vào

số lượng bạch cầu trong máu bảo quản Bạch cầu đóng vai trò quan trọng trong sự có mặt của các cytokine và các chất trung gian có hoạt tính sinh lý trong máu bảo quản [8]

1.8.3 Các men bạch cầu trong máu bảo quản

Bạch cầu hạt đời sống ngắn, trong máu bảo quản sau 48-72 giờ chúng chết và phân hủy, giải phóng ra nhiều thành phần nội bào như các men bạch cầu (Phosphatase, eslatase, LDH, Protease), histamine, serotonin,…hòa tan vào huyết tương Bạch cầu, đặc biệt là bạch cầu hạt trung tính và mono/đại thực bào có rất nhiều men thuộc nhóm diệt khuẩn, tiêu đạm… do đời sống của bạch cầu trung tính rất ngắn (14 ngày kể từ khi mới sinh) nên trong máu bảo quản ngay trong tuần đầu bạch cầu hạt đã chết, giải phóng các chất trung gian từ các hạt đặc hiệu của bạch cầu vào huyết tương máu bảo quản Mức độ của các chất này cũng tăng theo thời gian bảo quản Tương tự như sự hình thành các cytokine, nếu loại bỏ bạch cầu thì các men này có mặt trong huyết tương ở mức thấp [8]

Như chúng ta biết, các cytokine, các chất trung gian như serotonin, histamine, các men bạch cầu như: protease, phosphatase có lượng rất thấp trong máu, nay trong máu bảo quản tăng lên gấp hàng chục lần, sự tăng này

đã gây các tác hại sau đây cho chất lượng máu bảo quản

Trước hết, do xuất hiện một số men bạch cầu làm pH máu bảo quản giảm, pH giảm gây nhiếu bất lợi, trong đó một số bất lợi đáng chú ý là tạo điều kiện hình thành các gốc tự do có nhiều tác hại [8]

18

Mặt khác men bạch cầu, nhất là protease, các gốc tự do, các cytokine (TNF) tác động lên màng hồng cầu làm thay đổi hình dạng và cấu trúc của chúng làm cho hiệu quả trao đổi oxy của hồng cầu sẽ bị ảnh hưởng, chất lượng máu truyền sẽ giảm sút

Các chất trung gian như serotonin, histamine, prostaglandin…, các cytokine xuất hiện trong huyết tương bảo quản sẽ gây các phản ứng sốt, dị ứng khi truyền máu, nếu nhiều ở các cá thể nhạy cảm có thể gây tụt huyết áp

và sốc

Ngoài ra, sự có mặt của bạch cầu còn lại khác như gây bệnh ghép chống chủ do truyền máu, gây phản ứng miễn dịch đồng loại làm giảm bạch cầu, tiểu cầu sau truyền máu, gây bệnh phổi cấp tính do kháng thể đặc hiệu bạch cầu làm kết dính bạch cầu vi mạch phổi Sự có mặt của bạch cầu có thể làm lây nhiễm HIV do truyền máu trong giai đoạn cửa sổ không sang lọc được [8]

Vì các lý do trên, vấn đề tách và chuẩn hóa các thành phần máu, truyền máu từng thành phần, vấn đề loại bỏ bạch cầu bằng ly tâm hoặc lọc bạch cầu

là một vấn đề có tính chiến lược trong an toàn truyền máu

1.8.4 Các chất tự do trong máu bảo quản

Đối với bạch cầu hạt và tiểu cầu, đời sống ngắn, trong thời gian bảo quản chúng cũng cần năng lượng, nhất là tiểu cầu, bạch cầu mono và lympho Nguồn năng lượng này cũng lấy từ phân giải đường trong môi trường bảo quản Trong quá trình chuyển hóa năng lượng xuất hiện nhiều chất bất lợi cho

tế bào máu bảo quản, trong đó có các gốc tự do Vì vậy, việc nghiên cứu các gốc tự do trong máu bảo quản để tìm ra phương pháp hạn chế tác dụng có hại của chúng, góp phần nâng cao chất lượng của máu bảo quản là một yêu cầu cấp thiết cho an toàn truyền máu [8]

19

Gốc tự do là các nguyên tử hoặc nhóm nguyên tử hay phân tử mà lớp điện tử ngoài cùng của chúng có chứa điện tử không cặp đôi, chúng có thể mang điện tích dương hoặc âm hoặc không mang điện tích Các gốc tự do thường gặp: O2, H2O2, HO, 1O2

Sau nhiều nghiên cứu thực nghiệm và trên người, các nhà khoa học đã chứng minh rằng: bên cạnh quá trình chuyển hóa tạo ra các gốc tự do có hại cho cơ thể, cơ thể còn có hệ thống thứ hai chống lại quá trình này và chống lại các gốc tự do, chúng được gọi là chất chống oxy hóa (anti - oxydants) Trong

cơ thể người và động vật, chất chống oxy hóa có hai loại: loại có bản chất enzyme và loại không có bản chất enzyme

* Chất chống oxy hóa có bản chất enzyme: gồm các chất như superoxyd

dismutase (SOD), glutathion peroxydase (GPx), glutathion reductase (GR), catalase (CAT)

* Hệ thống chống oxy hóa không có bản chất enzyme

Trong máu bảo quản cũng có hai quá trình hoạt động đối kháng: quá trình oxy hóa và quá trình khử oxy hóa mà sản phẩm chung là các gốc tự do Quá trình oxy hóa luôn tạo ra năng lượng và các gốc tự do Trong máu bảo quản bao gồm các sản phẩm máu là tế bào đều có khả năng tạo ra các gốc tự

do Nguyên nhân tăng gốc tự do có thể do:

* Thiếu năng lượng làm cho hoạt động men chống oxy hóa như SOD, GPx, GR, giảm dần theo thời gian bảo quản

* Mặt khác trong điều kiện thiếu oxy, pH giảm, các gốc tự do dễ dàng được hình thành

* Hệ thống chống oxy hóa không phải enzyme (hệ thống khử các chất tự do) cũng giảm nặng

20

1.8.5 Gây phản ứng miễn dịch đồng loài

Kháng nguyên bạch cầu thuộc hệ HLA có thể gây phản ứng miễn dịch chống bạch cầu, làm giảm bạch cầu hạt, giảm tiểu cầu, giảm lympho sau truyền máu

1.8.6 Giải pháp nhằm giảm tác dụng phụ của khối tiểu cầu

Nguyên nhân: các rối loạn trong máu bảo quản nói trên là do:

Do số lượng bạch cầu hạt trung tính trong chế phẩm máu, làm giảm pH máu, làm thay đổi môi trường sống, tạo điều kiện tăng gốc tự do

Do thiếu năng lượng, thiếu chất dinh dưỡng, tăng chuyển hóa đường theo con đường pentose, tăng acid lactic, giảm pH máu

Giảm các enzyme chống oxy hóa, làm tăng gốc tự do

Tăng sản xuất các cytokin tỷ lệ thuận với thời gian bảo quản máu

Giải pháp nhằm giảm tác dụng phụ của khối tiểu cầu

Loại bạch cầu bằng màng lọc bạch cầu trước khi bảo quản

Tăng cường chất lượng dung dịch bảo quản tiểu cầu theo hướng tăng cung cấp và giảm tiêu hao năng lượng

Ổn định nhiệt độ và điều kiện bảo quản

Khi cần kiểm tra và vận chuyển cần hết sức nhẹ nhàng

2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn

Túi máu toàn phần thể tích 350 ml ± 35ml Máu được lấy từ người hiến máu tình nguyện sau khi được khám, tuyển chọn tuân thủ thông từ 26/2013/TT-BYT Cân nặng: ≥ 45 kg Huyết áp trong giới hạn bình thường Huyết sắc tố ≥ 125 g/l Các túi máu toàn phần được làm xét nghiệm âm tính các bệnh lây truyền qua đường truyền máu: viêm gan B; viêm gan C; giang mai; HIV

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ và nguyên vật liệu

Túi máu toàn phần chất liệu nhựa dẻo của hãng Terumo, Nhật Bản Kít PB của hãng Terumo - Nhật Bản - gồm 1 túi chứa lớp bạch - tiểu cầu pool có thể tích chứa khoảng 550 ml, 1 bầu lọc bạch cầu, 1 túi chứa khối tiểu cầu pool - lọc bạch cầu có thể tích chứa khoảng 1000 ml Máy ly tâm lạnhnhiệt độ từ -10oC đến +40o

C của hãng Thermo - Sorval 12R của Mỹ

Tủ bảo quản khối tiểu cầu chuyên dụng Helmer của Mỹ được điều chỉnh nhiệt độ 20 oC- 24oC, lắc liên tục

Máy phân tích tế bào tự độngUnicel DxH 800(Hãng Beckman Counter, Mỹ)

Máy đếm tế bào Flow Cytometry Navios của Mỹ

Máy đo pH Hanna, Ý

Máy xét nghiệm sinh hoá tự động AU 2700 của Đức

Bàn ép máu Baxter 4R4414 của Mỹ

2.1.3 Thời gian nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 11 năm 2014 đến tháng 8 năm 2015, tại Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương, đường Trần Thái Tông (kéo dài), phường Yên Hoà, quận Cầu Giấy, Hà Nội

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Kỹ thuật sản xuất khối tiểu cầu pool lọc - bạch cầu từ lớp Buffycoat của máu toàn phần

Điều kiện phòng làm việc: phòng an toàn sinh học cấp II

Nguyên liệu đầu vào: Máu toàn phần được lấy từ ven người hiến máu đạt tiêu chuẩn hiến máu [1], túi máu toàn phần có thể tích khoảng 350 ml được chứa trong hệ thống túi nhựa dẻo gồm 4 túi Túi máu toàn phần được làm xét nghiệm có kết quả âm tính với các bệnh lây truyền qua đường truyền máu và được làm xét nghiệm nhóm máu hệ nhóm máu ABO, Rh

Ly tâm túi máu toàn phần thể tích 350 ml ở tốc độ 3500 vòng/phút trong

7 phút 30 giây, nhiệt độ 20-24oC Sau ly tâm, túi máu phân thành 3 lớp: lớp huyết tương trên cùng, lớp bạch-tiểu cầu (lớp Buffy coat) ở giữa và lớp dưới cùng là hồng cầu

Đặt túi máu toàn phần đã ly tâm vào bàn ép máu (bàn ép máu dùng lực

ép của lò xo để đẩy các thành phần máu chảy ra theo ống dây của túi máu )

Cân các túi buffy coat và tính thể tích túi buffy coat

V ml

Để túi Buffy coat nằm yên, không lắc trong vòng 1 giờ, sau đó lắc túi buffy coat trong 10 phút và lấy mẫu làm kiểm nghiệm số lượng tiểu cầu trong túi Buffy coat pool

Khảo sát chương trình ly tâm (lần 2) túi Buffy coat pool gồm tốc độ và thời gian phù hợp cho để tách khối tiểu cầu:

+ Điều kiện nhiệt độ ly tâm: 20oC đến 24o

Bước 1: Tìm thời gian thích hợp: thay đổi thời gian nhưng cố định tốc độ quay

Bước 2: Tìm tốc độ quay thích hợp: thay đổi tốc độ quay, cố định thời gian

Mỗi chương trình ly tâm sử dụng 3 túi buffy coat

Sau đó chọn chương trình ly tâm có hiệu suất thu được tiểu cầu cao nhất,

có lẫn số lượng bạch cầu thấp nhất

Chúng tôi đã sử dụng các chương trình ly tâm thay đổi theo bảng sau:

Đặt túi Buffy coat vào bàn ép máu, ép cho khối tiểu cầu pool chảy qua màng lọc bạch cầu và chảy vào túi chuyển để thu được KTC-BC Hàn tách rời túi chứa KTC-BC và túi cặn Buffy coat (gồm bạch cầu và một ít hồng cầu)

Cân các túi KTC-BC và tính thể tích túi KTC-BC

V ml

Lắc đều túi KTC-BC trên máy lắc máu trong 10 phút Lấy mẫu làm kiểm nghiệm các chỉ số: số lượng tiểu cầu; số lượng bạch cầu, số lượng hồng cầu tồn dư

Hiệu suất tách tiểu cầu của các KTC-BC được tách từ các chương trình

ly tâm trên

Xác định được chương trình ly tâm phù hợp

25

Quá trình khảo sát để lựa chọn quy trình sản xuất KTC-BC được tóm tắt

tronghình2.3

Hình 2.3 Sơ đồ khảo sát và lựa chọn qui trình sản xuất KTC-BC

2.2.2 Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cấp cơ sở của khối bạch cầu pool

lọc bạch cầu

Sản xuất 30 túi KTC-BC theo chương trình tâmlựa chọn được

Lấy mẫu làm kiểm nghiệm các chỉ số huyết học, sinh hóavà hình thái

của tiểu cầu ngay sau khi sản xuất

So sánh kết quả trên với các tiêu chuẩn chất lượng của các sản phẩm

cùng loại sản xuất của AABB (Mỹ), Châu Âu, quy định tại thông tư

Máu toàn phần

Huyết tương Bạch - Tiểu cầu

Khảo sát chương trình ly tâm (lần 2)

và ép tách KTC-BC

30 túi

Cho mục tiêu 1, 2

Khối tiểu cầu pool - lọc bạch cầu

Bảo quản khối tiểu cầu pool - lọc bạch cầu trong vòng 7 ngày

Lấy mẫu làm xét nghiệm

Lấy mẫu làm xét nghiệm

Phương pháp làm: Đo trên máy đếm tế bào tự động DXH Beckman counter

Nguyên tắc: gồm cơ chế tế bào đi qua hai điện cực làm thay đổi điện trở giữa hai điện cực và cơ chế Laser scatter, nhuộm men peroxydase: tạo ra không gian ba chiều để nhận dạng bạch cầu, kể cả tế bào blast

Máy đếm tế bào được kiểm định hàng ngày bằng mẫu chuẩn

Số lượng tiểu cầu/túi = thể tích túi KTC-BC x số lượng máy đếm /1000 Giới hạn số lượng bạch cầu trong khối tiểu cầu lọc bạch cầu bằng máy đếm tế bào tự động dòng chảy - flow cytometry Navios

Nguyên tắc: Sử dụng kỹ thuật PI 10% (Propidium Iodide) vào mẫu chế phẩm máu, PI bắt màu với tế bào có nhân (bạch cầu) sau đó bổ sung tiếp hạt gắn đặc hiệu phát huỳnh quang (Fluoresces count) và hạt gắn đặc hiệu phát huỳnh quang sẽ gắn vào các bạch cầu nhuộm PI Máy đếm tế bào dòng chảy sẽ đếm các hạt gắn đặc hiệu phát huỳnh quang ở bước sóng 488nm và đọc kết quả số lượng bạch cầu trên phần mềm

Máy đếm tế bào được kiểm định hàng ngày bằng mẫu chuẩn

Hoạt độ LDH

Nguyên tắc: Dưới tác dụng của LDH sẽ xảy ra các phản ứng:

Pyruvat + NADH + H+ L lactat + NAD+

Hoạt độ của LDH tỷ lệ thuận với mức giảm độ hấp thụ ánh sáng do sự chuyển đổi NADH sang NAD+ và đo được ở bước sóng 340 nm Lấy 0,5 ml mẫu thử vào ống nghiệm nhựa PVC Ly tâm ở 3000 vòng/phút trong 5 phút, lấy phần huyết tương nổi ở phía trên đặt vào máy sinh hóa tự động AU 2700

để đo hoạt độ LDH

Độ vô khuẩn: Lấy mẫu KTC-BC trong hốt vô trùng, cấy vào chai thạch

vô trùng Chuyển chai vào thiết bị nuôi cấy vi khuẩn Bactec 9120 (Mỹ), theo dõi trong 5 ngày Máy đọc kết quả sau 5 ngày và hiển thị kết quả trên màn hình

Độ vẩn xoáy

28

Kiểm tra độ vẩn xoáy (Swirling): gồm các mức từ 3 đến 0 để đánh giá sự thay đổi hình dạng của tiểu cầu từ hình đĩa sang hình cầu dưới ánh sáng nhằm đánh giá định tính chất lượng tiểu cầu [28], [25], [26] Hiện tượng vẩn xoáy xảy ra do tiểu cầu hình đĩa khúc xạ ánh sáng tạo nên khi lắc tròn và nhẹ túi KTC-BC dưới bóng đèn điện

+ Mức 3: Có vẩn xoáy rất rõ nét trong tất cả các vị trí của túi

+ Mức 2: Có vẩn xoáy rõ trong tất cả các vị trí của túi

+ Mức 1: Có vẩn xoáy ở một số vị trí của túi và không rõ ràng

+ Mức 0: Độ đục đồng đều

2.2.3 Đánh giá độ ổn định về chất lượng của khối tiểu cầu pool lọc bạch cầu

Bảo quản KTC-BC ở 20-24oC, lắc liên tục

Đánh giá chỉ tiêu: số lượng tiểu cầu, pH, độ vô khuẩn trong quá trình bảo quản sau khi sản xuất từ 1 đến 7 ngày

2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu

Xử lý số liệu trên phần mềm SPSS 16.0

Sử dụng T-student test

ml huyết tương cùng nhóm máu hoặc A hoặc B hoặc O hoặc AB Ly tâm lần

2 các túi Buffy coat pool để tách KTC-BC, chúng tôi khảo sát chương trình ly tâm lần 2 phù hợp để thu được hiệu suất tách tiểu cầu tối ưu nhất Sau đây là kết quả sản xuất KTC-BC sau khi tách bằng các chương trình ly tâm Buffycoat pool

3.1.1 Đánh giá nguyên liệu túi Buffy coat pool trước khi ly tâm lần 2

Kết quả khảo sát thể tích của túi Buffy coat pool được thể hiện trong bảng 3.3

Bảng 3.3 Thể tích của túi Buffy coat Chương trình ly tâm