Nguyên nhân: các rối loạn trong máu bảo quản nói trên là do:
Do số lƣợng bạch cầu hạt trung tính trong chế phẩm máu, làm giảm pH máu, làm thay đổi môi trƣờng sống, tạo điều kiện tăng gốc tự do.
Do thiếu năng lƣợng, thiếu chất dinh dƣỡng, tăng chuyển hóa đƣờng theo con đƣờng pentose, tăng acid lactic, giảm pH máu.
Giảm các enzyme chống oxy hóa, làm tăng gốc tự do.
Tăng sản xuất các cytokin tỷ lệ thuận với thời gian bảo quản máu.
Giải pháp nhằm giảm tác dụng phụ của khối tiểu cầu
Loại bạch cầu bằng màng lọc bạch cầu trƣớc khi bảo quản.
Tăng cƣờng chất lƣợng dung dịch bảo quản tiểu cầu theo hƣớng tăng cung cấp và giảm tiêu hao năng lƣợng.
Ổn định nhiệt độ và điều kiện bảo quản.
21
Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Việc nghiên cứu đƣợc tiến hành trên 378 túi máu toàn phần có thể tích 350ml để sản xuất ra 63 túi khối tiểu cầu pool - lọc bạch cầu.
2.1.1. Tiêu chuẩn lựa chọn
Túi máu toàn phần thể tích 350 ml ± 35ml. Máu đƣợc lấy từ ngƣời hiến máu tình nguyện sau khi đƣợc khám, tuyển chọn tuân thủ thông từ 26/2013/TT-BYT. Cân nặng: ≥ 45 kg. Huyết áp trong giới hạn bình thƣờng. Huyết sắc tố ≥ 125 g/l. Các túi máu toàn phần đƣợc làm xét nghiệm âm tính các bệnh lây truyền qua đƣờng truyền máu: viêm gan B; viêm gan C; giang mai; HIV.
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ và nguyên vật liệu
Túi máu toàn phần chất liệu nhựa dẻo của hãng Terumo, Nhật Bản. Kít PB của hãng Terumo - Nhật Bản - gồm 1 túi chứa lớp bạch - tiểu cầu pool có thể tích chứa khoảng 550 ml, 1 bầu lọc bạch cầu, 1 túi chứa khối tiểu cầu pool - lọc bạch cầu có thể tích chứa khoảng 1000 ml. Máy ly tâm lạnhnhiệt độ từ -10oC đến +40o
C của hãng Thermo - Sorval 12R của Mỹ.
Tủ bảo quản khối tiểu cầu chuyên dụng Helmer của Mỹ đƣợc điều chỉnh nhiệt độ 20 oC- 24oC, lắc liên tục.
Máy phân tích tế bào tự độngUnicel DxH 800(Hãng Beckman Counter, Mỹ)
Máy đếm tế bào Flow Cytometry Navios của Mỹ Máy đo pH Hanna, Ý
Máy xét nghiệm sinh hoá tự động AU 2700 của Đức. Bàn ép máu Baxter 4R4414 của Mỹ.
22 Kẹp cánh dài.
Cân điện tử Jadever, Đài Loan. Máy lắc máuTerumo, Nhật Đèn điện
Ống nghiệm
2.1.3. Thời gian nghiên cứu
Nghiên cứu đƣợc thực hiện từ tháng 11 năm 2014 đến tháng 8 năm 2015, tại Viện Huyết học – Truyền máu Trung ƣơng, đƣờng Trần Thái Tông (kéo dài), phƣờng Yên Hoà, quận Cầu Giấy, Hà Nội.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Kỹ thuật sản xuất khối tiểu cầu pool lọc - bạch cầu từ lớp Buffycoat của máu toàn phần của máu toàn phần
Điều kiện phòng làm việc: phòng an toàn sinh học cấp II.
Nguyên liệu đầu vào: Máu toàn phần đƣợc lấy từ ven ngƣời hiến máu đạt tiêu chuẩn hiến máu [1], túi máu toàn phần có thể tích khoảng 350 ml đƣợc chứa trong hệ thống túi nhựa dẻo gồm 4 túi. Túi máu toàn phần đƣợc làm xét nghiệm có kết quả âm tính với các bệnh lây truyền qua đƣờng truyền máu và đƣợc làm xét nghiệm nhóm máu hệ nhóm máu ABO, Rh.
Ly tâm túi máu toàn phần thể tích 350 ml ở tốc độ 3500 vòng/phút trong 7 phút 30 giây, nhiệt độ 20-24oC. Sau ly tâm, túi máu phân thành 3 lớp: lớp huyết tƣơng trên cùng, lớp bạch-tiểu cầu (lớp Buffy coat) ở giữa và lớp dƣới cùng là hồng cầu
Đặt túi máu toàn phần đã ly tâm vào bàn ép máu (bàn ép máu dùng lực ép của lò xo để đẩy các thành phần máu chảy ra theo ống dây của túi máu )
23
Phân tách các lớp huyết tƣơng, Buffy coat, hồng cầu vào các túi chứa. Phân loại các túi buffy coat theo nhóm máu A, B, O.
Dồn (pool) 6 túi chứa lớp Buffy coat cùng nhóm máu và 1 túi huyết tƣơng (khoảng 250 ml) [15], [30] cùng nhóm máu với buffy coat vào túi chứa Buffy coat của kít PBđể có thể tích khoảng 500ml.
Cân các túi buffy coat và tính thể tích túi buffy coat V ml
Để túi Buffy coat nằm yên, không lắc trong vòng 1 giờ, sau đó lắc túi buffy coat trong 10 phút và lấy mẫu làm kiểm nghiệm số lƣợng tiểu cầu trong túi Buffy coat pool.
Khảo sát chƣơng trình ly tâm (lần 2) túi Buffy coat pool gồm tốc độ và thời gian phù hợp cho để tách khối tiểu cầu:
+ Điều kiện nhiệt độ ly tâm: 20oC đến 24o
C.
Trên cơ sở kỹ thuật ly tâm của quy trình ly tâm tách tiểu cầu treo trong huyết tƣơng (huyết tƣơng giàu tiểu cầu) từ túi máu toàn phần 350 ml đang thực hiện thƣờng quy tại Viện huyết học - Truyền máu TW [phụ lục 2], chúng tôi nghiên cứu chƣơng trình ly tâm thích hợp cho túi buffy coat, nghiên cứu đƣợc tiến hành hai bƣớc:
Bƣớc 1: Tìm thời gian thích hợp: thay đổi thời gian nhƣng cố định tốc độ quay.
Bƣớc 2: Tìm tốc độ quay thích hợp: thay đổi tốc độ quay, cố định thời gian
Mỗi chƣơng trình ly tâm sử dụng 3 túi buffy coat.
Sau đó chọn chƣơng trình ly tâm có hiệu suất thu đƣợc tiểu cầu cao nhất, có lẫn số lƣợng bạch cầu thấp nhất
24 Bảng 2.2 Các chƣơng trình ly tâm Ký hiệu chƣơng trình ly tâm Tốc độ ly tâm (vòng/phút) Thời gian (phút, giây) T1 2700 5 phút 20 giây T2 5 phút 10 giây T3 5 phút T4 4 phút 50 giây T5 4 phút 40 giây T1 4 phút 30 giây T2 2500 4 phút 50 giây T3 2600 T4 2650 T5 2750 T6 2800
Sau khi ly tâm, túi Buffy-coat pool phân thành hai lớp: lớp trên cùng là tiểu cầu treo trong huyết tƣơng còn gọi là khối tiểu cầu pool, lớp dƣới cùng là cặn của túi Buffy coat chủ yếu chứa bạch cầu và hồng cầu.
Đặt túi Buffy coat vào bàn ép máu, ép cho khối tiểu cầu pool chảy qua màng lọc bạch cầu và chảy vào túi chuyển để thu đƣợc KTC-BC. Hàn tách rời túi chứa KTC-BC và túi cặn Buffy coat (gồm bạch cầu và một ít hồng cầu).
Cân các túi KTC-BC và tính thể tích túi KTC-BC V ml
Lắc đều túi KTC-BC trên máy lắc máu trong 10 phút. Lấy mẫu làm kiểm nghiệm các chỉ số: số lƣợng tiểu cầu; số lƣợng bạch cầu, số lƣợng hồng cầu tồn dƣ
Hiệu suất tách tiểu cầu của các KTC-BC đƣợc tách từ các chƣơng trình ly tâm trên.
Hiệu suất tách tiểu cầu (%) x100
25
Quá trình khảo sát để lựa chọn quy trình sản xuất KTC-BC đƣợc tóm tắt tronghình2.3
Hình 2.3 Sơ đồ khảo sát và lựa chọn qui trình sản xuất KTC-BC 2.2.2. Xây dựng tiêu chuẩn chất lƣợng cấp cơ sở của khối bạch cầu pool lọc bạch cầu
Sản xuất 30 túi KTC-BC theo chƣơng trình tâmlựa chọn đƣợc.
Lấy mẫu làm kiểm nghiệm các chỉ số huyết học, sinh hóavà hình thái của tiểu cầu ngay sau khi sản xuất.
So sánh kết quả trên với các tiêu chuẩn chất lƣợng của các sản phẩm cùng loại sản xuất của AABB (Mỹ), Châu Âu, quy định tại thông tƣ
Máu toàn phần
Huyết tƣơng Bạch - Tiểu cầu
(Buffy coat) Khối hồng cầu
Ly tâm (lần 1)
Pool 6 túi Buffy coat vào một túi chứa Buffy coat của
kít PB Khối Bạch - Tiểu
cầu (Buffy coat) pool
Lấy mẫu làm xét nghiệm
Khảo sát chương trình ly tâm (lần 2) và ép tách KTC-BC 30 túi Cho mục tiêu 1, 2
Khối tiểu cầu pool - lọc bạch
cầu
Bảo quản khối tiểu cầu pool - lọc bạch cầu trong vòng 7 ngày Lấy mẫu làm xét nghiệm Lấy mẫu làm xét nghiệm 30 túi 30 túi Cặn Buffy coat pool Cho mục tiêu 3
26
26/2013/TT-BYT. Mức yêu cầu chất lƣợng đối với sản phẩm sản xuất đƣợc:
2.2.2.1. Tính chất / cảm quan
Chất lỏng màu vàng chanh và hơi đục
2.2.2.2. Thể tích của chế phẩm
Kiểm tra thể tích bằng cách cân túi chế phẩm và trừ bì túi [19]. V ml
2.2.2.3. Các chỉ số huyết học
Số lƣợng tiểu cầu.
Phƣơng pháp làm: Đo trên máy đếm tế bào tự động DXH Beckman counter Nguyên tắc: gồm cơ chế tế bào đi qua hai điện cực làm thay đổi điện trở giữa hai điện cực và cơ chế Laser scatter, nhuộm men peroxydase: tạo ra không gian ba chiều để nhận dạng bạch cầu, kể cả tế bào blast.
Máy đếm tế bào đƣợc kiểm định hàng ngày bằng mẫu chuẩn.
Số lƣợng tiểu cầu/túi = thể tích túi KTC-BC x số lƣợng máy đếm /1000 Giới hạn số lƣợng bạch cầu trong khối tiểu cầu lọc bạch cầu bằng máy đếm tế bào tự động dòng chảy - flow cytometry Navios.
Nguyên tắc: Sử dụng kỹ thuật PI 10% (Propidium Iodide) vào mẫu chế phẩm máu, PI bắt màu với tế bào có nhân (bạch cầu) sau đó bổ sung tiếp hạt gắn đặc hiệu phát huỳnh quang (Fluoresces count) và hạt gắn đặc hiệu phát huỳnh quang sẽ gắn vào các bạch cầu nhuộm PI. Máy đếm tế bào dòng chảy sẽ đếm các hạt gắn đặc hiệu phát huỳnh quang ở bƣớc sóng 488nm và đọc kết quả số lƣợng bạch cầu trên phần mềm.
27
2.2.2.4. Khảo sát chỉ số sinh hóa
Độ pH:
Phƣơng pháp làm: Mẫu thử đƣợc lấy từ ống dây của túi chứa mẫu đã trộn đều. Đo giá trị pH bằng máyHanna
Nồng độ Glucose
Nguyên tắc: với sự có mặt của glucose oxidase, glucose bị oxy hóa thành acid gluconic và hydroperoxyd. Với sự có mặt của enzym peroxidase, hydroperocid phản ứng với phenol và 4-aminophenazon để tạo thành phức hợp màu. Xác định nồng độ glucose bằng cách đo độ hấp thụ ánh sáng ở bƣớc sóng 500 nm.Lấy 0,5 ml mẫu thử vào ống nghiệm nhựa PVC. Đo nồng độ glucose bằng máy sinh hóa tự động AU 2700.
Hoạt độ LDH
Nguyên tắc: Dƣới tác dụng của LDH sẽ xảy ra các phản ứng: Pyruvat + NADH + H+ L. lactat + NAD+
Hoạt độ của LDH tỷ lệ thuận với mức giảm độ hấp thụ ánh sáng do sự chuyển đổi NADH sang NAD+ và đo đƣợc ở bƣớc sóng 340 nm. Lấy 0,5 ml mẫu thử vào ống nghiệm nhựa PVC. Ly tâm ở 3000 vòng/phút trong 5 phút, lấy phần huyết tƣơng nổi ở phía trên đặt vào máy sinh hóa tự động AU 2700 để đo hoạt độ LDH.
Độ vô khuẩn: Lấy mẫu KTC-BC trong hốt vô trùng, cấy vào chai thạch vô trùng. Chuyển chai vào thiết bị nuôi cấy vi khuẩn Bactec 9120 (Mỹ), theo dõi trong 5 ngày. Máy đọc kết quả sau 5 ngày và hiển thị kết quả trên màn hình.
28
Kiểm tra độ vẩn xoáy (Swirling): gồm các mức từ 3 đến 0 để đánh giá sự thay đổi hình dạng của tiểu cầu từ hình đĩa sang hình cầu dƣới ánh sáng nhằm đánh giá định tính chất lƣợng tiểu cầu [28], [25], [26]. Hiện tƣợng vẩn xoáy xảy ra do tiểu cầu hình đĩa khúc xạ ánh sáng tạo nên khi lắc tròn và nhẹ túi KTC-BC dƣới bóng đèn điện.
+ Mức 3: Có vẩn xoáy rất rõ nét trong tất cả các vị trí của túi + Mức 2: Có vẩn xoáy rõ trong tất cả các vị trí của túi
+ Mức 1: Có vẩn xoáy ở một số vị trí của túi và không rõ ràng + Mức 0: Độ đục đồng đều
2.2.3. Đánh giá độ ổn định về chất lƣợng của khối tiểu cầu pool lọc bạch cầu cầu
Bảo quản KTC-BC ở 20-24oC, lắc liên tục.
Đánh giá chỉ tiêu: số lƣợng tiểu cầu, pH, độ vô khuẩn trong quá trình bảo quản sau khi sản xuất từ 1 đến 7 ngày.
2.2.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Xử lý số liệu trên phần mềm SPSS 16.0 Sử dụng T-student test
29
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Kết quả nghiên cứu sản xuất khối tiểu cầu lọc bạch cầu
Quy trình sản xuất KTC-BC đƣợc mô tả trong phần phƣơng pháp nghiên cứu. Sau khi ly tâm lần 1, lớp Buffycoat đƣợc tách ra từ túi máu toàn phần, lớp Buffycoat này khoảng 40 -50 ml [19], hiện đã đƣợc chuẩn hóa và làm thƣờng quy [8]. Cứ 6 túi Buffy coat này đƣợc pool cùng với khoảng 200 ml huyết tƣơng cùng nhóm máu hoặc A hoặc B hoặc O hoặc AB. Ly tâm lần 2 các túi Buffy coat pool để tách KTC-BC, chúng tôi khảo sát chƣơng trình ly tâm lần 2 phù hợp để thu đƣợc hiệu suất tách tiểu cầu tối ƣu nhất. Sau đây là kết quả sản xuất KTC-BC sau khi tách bằng các chƣơng trình ly tâm Buffycoat pool.
3.1.1 Đánh giá nguyên liệu túi Buffy coat pool trƣớc khi ly tâm lần 2
Kết quả khảo sát thể tích của túi Buffy coat pool đƣợc thể hiện trong bảng 3.3
Bảng 3.3 Thể tích của túi Buffy coat Chƣơng trình ly tâm n Thể tích (ml) p (vòng/phút x thời gian) (X ±SD) 2700 x 5 min 20 s 3 435,40 ± 12,71 > 0,05 2700 x 5 min 10 s 3 440,51 ± 13,82 > 0,05 2700 x 5 min 3 445,00 ± 17,15 > 0,05 2700 x 4 min 50 s 3 426,27 ± 12,60 > 0,05 2700 x 4 min 40 s 3 441,52 ± 14,52 > 0,05 2700 x 4 min 30 s 3 436,33 ± 17,83 > 0,05 2550 x 4 min 50 s 3 425,23 ± 15,14 > 0,05 2600 x 4 min 50 s 3 434,30 ± 13,64 > 0,05 2650 x 4 min 50 s 3 421,17 ± 14,57 > 0,05 2750 x 4 min 50 s 3 432,23 ± 15,54 > 0,05 2800 x 4 min 50 s 3 437,68 ± 16,28 > 0,05
30
Nhận xét:Thể tích túi Buffy coat của các nhóm chƣơng trình ly tâm đều
không có sự khác biệt có ý nghĩa (p> 0,05) giữa các chƣơng trình ly tâm. Điều này chứng tỏ các túi Buffy coat trƣớc khi ly tâm lần 2 có thể tích tƣơng đƣơng nhau.
3.1.2 Thể tích túi Khối tiểu cầu pool lọc bạch cầu
Kết quả khảo sát và so sánh thể tích của KTC-BC đƣợc tách ra sau khi ly tâm túi Buffy coat pool bằng các nhóm chƣơng trình ly tâm.
Bảng 3.4: Thể tích túi KTC-BC Chƣơng trình ly tâm (vòng/phút x thời gian) n Thể tích (ml) p (X ±SD) 2700x5 min 20s 3 307,43 ± 16,86 > 0,05 2700x5 min 10 s 3 315,33 ± 13,50 2700 x 5 min 3 313,25 ± 16,86 2700x4 min 50 s 3 308,53 ± 12,96 2700x4 min 40 s 3 316,29 ± 14,66 2700x4 min 30 s 3 320,96 ± 17,20 2550x4 min 50 s 3 302,85 ± 15,05 2600x4 min 50 s 3 306,15 ± 12,53 2650x4 min 50 s 3 310,36 ± 14,05 2750x4 min 50 s 3 318,52 ± 15,02 2800x4 min 50 s 3 321,54 ± 15,85 Nhận xét:
Thể tích túi KTC-BC sau khi sản xuất thu đƣợc từ các chƣơng trình ly tâm này đều > 300 ml và không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p> 0,05)
31
3.1.3 Hiệu suất thu đƣợc của Khối tiểu cầu pool lọc bạch cầu
Kết quả khảo sát hiệu suất tách tiểu cầu của 3 chƣơng trình ly tâm túi Buffy coat pool đƣợc trình bày ở bảng 3.5
Bảng 3.5 Hiệu suất thu đƣợc của KTC-BC Chƣơng trình ly tâm (vòng/phút x thời gian) n Hiệu suất (%) p (X ±SD) 2700x5 min 20s 3 76,22 ± 9,11 < 0,05 2700x5 min 10 s 3 75,11 ± 6,58 < 0,05 2700 x 5 min 3 76,10 ± 8,66 < 0,05 2700x4 min 50 s 3 86,63 ± 8,02 2700x4 min 40 s 3 75,54 ± 7,84 < 0,05 2700x4 min 30 s 3 72,07 ± 8,87 < 0,05 2550x4 min 50 s 3 56,48 ± 6,55 < 0,05 2600x4 min 50 s 3 62,71 ± 9,41 < 0,05 2650x4 min 50 s 3 73,25 ± 8,11 < 0,05 2750x4 min 50 s 3 74,35 ± 9,32 < 0,05 2800x4 min 50 s 3 65,47 ± 9,62 < 0,05
Hình 3.4: Hiệu suất tách khối tiểu cầu pool lọc bạch cầu khi khảo sát chƣơng trình ly tâm Nhận xét: 76.22 75.11 76.1 86.63 75.54 72.07 56.48 62.71 73.25 74.35 65.47 50 60 70 80 90 100 2700 x 5'20'' 2700 x 5'10'' 2700 x 5' 2700 x 4'50'' 2700 x 4'40'' 2700 x 4'30'' 2550 x 4'50' 2600 x 4'50'' 2650 x 4'50'' 2750 x 4'50'' 2800 x 4'50'' Hiệu suất (%)
32
Hiệu suất tách tiểu cầu của chƣơng trình ly tâm 2700 vòng/phút trong 4 phút 50 giây cao nhất: 86,63 ± 8,02 %
Hiệu suất thu đƣợc tiểu cầu của cácnhóm chƣơng trình ly tâm có sự khác biệt so với chƣơng trình ly tâm 2700 vòng/phút trong 4 phút 50 giây.
3.1.4Giới hạn số lƣợng bạch trong Khối tiểu cầu pool lọc bạch cầu
Kết quả khảo sát giới hạn số lƣợng bạch cầu trong KTC-BC đƣợc thể hiện ở bảng 3.6
Bảng 3.6: Số lƣợng bạch cầu trong KTC-BC và tỷ lệ loại bỏ bạch cầu trong quá trình sản xuất
Chƣơng trình ly