Đang tải... (xem toàn văn)
Đề tài:Thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa xylanase trong nấm mốc
! "! # $#% &'()() *%+,-&.*/0'1234&5/26372 /809: ; <=> ?$ ; * ; ; #: ; @ */A:!6"/*/!23! B ; C ? B "! ?C $?%: D$! C :! ! $ ; "%) ,2&'()()E$FGHI/23F JK$#,$L"K?M9N23!8O28.LP!:Q1 "#"R1SP9T2 !:/$D$,#U?MK%%$V$W H6372L9XYJ&17"K?M/# 6:Z"[/9"9173\]\]V?:^W /9"&17IH3_`:3F$a/:3P!2! K$:$R"%8:XK$I!3F) ! b 21 ! :A:!(- G! ; : ; A:!6[-G`6E$4!+W3! B ! b ?! ; "! c93d: #$4D$1H6R9" ; ; $ ; "%) ! : b :! b! ! ; &: ; <=> ?$ ; @* ; ; #: ; 3% ; ; ! ()e$+F"A()*f+, 3! B $ 93 B "! C b ! b : ; C :#$ ! ; ; $ ; "%) $$ UX!3C ! ; 8 "3g/9: # $ #%"C # ; D$! 23 ; ""! : 9 ::#$D$! C : ; ; 9"! : ! $ ; "%) +: ; " Nguyễn Thị Mai Hương NHƯ ̃ NG TƯ ̀ VIÊ ́ T TĂ ́ T AS Acetosyringone ATP Adenosine triphosphate bp Base pair DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxynucleoside triphosphate ddNTP Dideoxynucleoside triphosphate EDTA Ethylene diamine tetra acetic acid EtBr Ethidium bromide xylB Xylanase B Hph Hygromycin photpotransferase encoding gene IM Induction medium kb Kilo base kDa Kilo Dalton LB Luria – Bertani LC Luria – Complete MES (2 – N – morpholine) – ethane sulfonic acid PCR Polymerase Chain Reaction RNase Ribonuclease RNA Ribonucleic acid SDS Sodium Dodecyl Sulphate TAE Tris – acetate – EDTA vir Virulence region 2 MỤC LỤC MỤC LỤC .3 MỞ ĐẦU .5 Chương 1 – TỔNG QUAN .7 1.1. Xylanase và ứng dụng trong công nghệ sản xuất thức ăn chăn nuôi 7 1.1.1. Xylanase và sự phân hủy sinh học xylan .7 1.1.2. Ứng dụng xylanase trong sản xuất thức ăn chăn nuôi .9 1.2. Nấm mốc và ứng dụng của công nghệ chuyển gen vào nấm mốc thông qua A. tumefaciens .10 1.2.1. Giới thiệu về nấm mốc .10 1.2.2. Agrobacterium và ứng dụng trong công nghệ chuyển gen thực vật và nấm .12 1.2.3. Chuyển gen vào nấm mốc thông qua A. tumefaciens .17 1.2.3.1. Kỹ thuật chuyển gen vào nấm mốc A. niger .17 Chương 2 – NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1. Nguyên liệu 24 2.1.1. Nguyên liệu .24 2.1.2. Hóa chất 24 ** Các nguyên tố vi lượng: 100 mg ZnSO4. 7H2O; 100 mg H3BO3; 100 mg MnSO4. H2O; 100 mg CuSO4. 5H2O; 100 mg Na2MoO4. 2H2O; bổ sung H2O đến 100 ml, khử trùng .26 2.1.3. Thiết bị .26 2.2. Phương pháp nghiên cứu .26 2.2.1. Các phương pháp sử dụng để nối ghép gen 26 2.2.2. Biến nạp vào tế bào E. coli và A. tumefaciens 30 2.2.3. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose 32 2.2.4. Nhân gen bằng kỹ thuật PCR 33 2.2.5. Phương pháp tách chiết DNA plasmid lượng nhỏ .34 3 2.2.6. Phân tích DNA plasmid tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn .36 2.2.7. Xác định trình tự gen và xử lý số liệu bằng các phần mềm chuyên dụng .37 2.2.8. Phương pháp nuôi nhiễm A. tumefaciens và A. niger 38 Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .40 3.1.1. Lắp ghép xylB vào vector trung gian .43 3.1.2. Lắp ghép cấu trúc GluA promoter + hph gene + TrypC terminator vào vector trung gian 49 3.1.3. Kiểm tra sự có mặt của cấu trúc biểu hiện xylB và hph trong vector trung gian (pKS_xylB_hph) .55 3.2. Thiết kế Ti plasmid mang hai cấu trúc biểu hiện xylB và hph .56 3.2.1. Lắp ghép đoạn gen mang hai cấu trúc biểu hiện xylB và hph trong vector trung gian vào Ti plasmid .56 3.2.2. Kiểm tra sự có mặt của xylB và hph trong vector tái tổ hợp Ti plasmid .57 3.3. Tạo chủng vi khuẩn A. tumefaciens mang vector biểu hiện pCB_xylB_hph .61 3.3.1. Biến nạp Ti plasmid tái tổ hợp vào A. tumefaciens 61 3.3.2. Kiểm tra sự có mặt của xylB và hph trong Agrobacterium .61 3.4. Kết quả chuyển vector biểu hiện xylB và hph vào A. niger thông qua A. tumefaciens 63 3.4.1. Kết quả nuôi nhiễm .63 3.4.2. Chọn lọc thể nấm chuyển gen trên môi trường kháng sinh .66 KẾT LUẬN .68 KIẾN NGHỊ 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO .70 4 MỞ ĐẦU Trong nhiều năm gần đây, nhu cầu sử dụng enzyme có nguồn gốc từ vi sinh vật ngày càng tăng, đặc biệt là enzyme xylanase. Xylanase được sử dụng trong nhiều ngành sản xuất công nghiệp trên toàn thế giới [18, 29]. Một trong những ứng dụng quan trọng của xylanase là được dùng để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi. Sự có mặt của xylanase trong thức ăn chăn nuôi có tác dụng thúc đẩy quá trình tiêu hóa, từ đó cải thiện hệ vi sinh vật đường ruột của động vật [4, 13]. Ngoài ra, xylanase còn được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác ví dụ: phân hủy rác thải; làm trắng trong công nghiệp sản xuất giấy… [22, 29]. Trong tự nhiên, rất nhiều loại vi khuẩn và nấm mốc tiết ra xylanase [22], trong đó xylanase do nấm mốc tiết ra được quan tâm hơn cả bởi chúng có hàm lượng cao và ổn định. Nấm mốc Aspergillus hay còn gọi là nấm sợi, là nhóm nấm đa dạng và phân bố rộng trong tự nhiên. Với tiềm năng vô cùng phong phú, Aspergillus được quan tâm nghiên cứu và ứng dụng trong sản xuất enzyme cũng như trong các ngành nghiên cứu cơ bản về cơ chế sinh lý và sinh hóa và cơ chế di truyền vi sinh vật từ nhiều năm nay trên thế giới [9, 11]. Do nhu cầu sử dụng xylanase trong nhiều lĩnh vực đặc biệt là lĩnh vực sản xuất thức ăn chăn nuôi ngày càng tăng. Bởi vậy, nghiên cứu sản xuất và ứng dụng enzyme xylanase có chất lượng cao, ổn định từ các vi sinh vật tái tổ hợp nhờ công nghệ chuyển gen đã thu hút sự quan tâm của nhiều nhà nghiên cứu [22, 31]. Chuyển gen vào nấm dựa trên nền tảng của công nghệ DNA tái tổ hợp, để cải biến hệ gen của nấm mốc nhằm đáp ứng nhu cầu của con người về các sản phẩm protein cũng như enzyme để sản xuất trên qui mô công nghiệp. Hơn nữa, kỹ thuật chuyển gen cho phép chọn lựa promoter đặc hiệu cũng như các chủng vi sinh vật chuyển gen mong muốn, nhờ vậy đặc tính của enzyme tái tổ hợp đã được cải thiện [22]. Hiện nay, kỹ thuật chuyển gen thông vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens được sử dụng phổ biến trên thế giới để chuyển gen vào thực vật. Bởi đây là một hệ thống 5 chuyển gen có hiệu suất cao, ổn định và đơn giản. Agrobacterium đã và đang được nghiên cứu, áp dụng để chuyển gen vào nấm mốc [3, 9]. Xuất phát từ vấn đề trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “a"8: 7$/82_.!!!#8:L224” Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen và Phòng Công nghệ DNA ứng dụng – Viện Công nghệ sinh học. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu của đề tài Mục tiêu Sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử và công nghệ chuyển gen để thiết kế Ti–plasmid tái tổ hợp mang gen mã hóa xylanase và gen kháng hygromycin B. Trên cở sở đó tạo các chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tái tổ hợp phục vụ công tác chuyển gen mã hóa xylanase và gen kháng hygromycin B vào A. niger. Nội dung nghiên cứu - Thiết kế vector tách dòng trung gian pKS_xylB_hph dựa trên vector pBluescript II KS (-) mang hai cấu trúc biểu hiện gen mã hóa xylanase và gen kháng hygromycin B:(GpdA promoter + xylanase gene + TrypC terminator) và (GluA promoter + hph gene + TrypC terminator). - Thiết kế Ti plasmid tái tổ hợp pCB_xylB_hph dựa trên vector pCAMBIA1300 mang hai cấu trúc biểu hiện biểu hiện gen mã hóa xylanase và gen kháng hygromycin B: (GpdA promoter + xylanase gene + TrypC terminator) và (GluA promoter + hph gene + TrypC terminator. - Tạo các chủng vi khuẩn A. tumefaciens mang vector biểu hiện pCB_xylB_hph để làm nguyên liệu chuyển gen vào nấm mốc. - Chuyển vector biểu hiện pCB_xylB_hph vào nấm mốc A. niger thông qua vi khuẩn A. tumefaciens. 6 Chương 1 – TỔNG QUAN 1.1. Xylanase và ứng dụng trong công nghệ sản xuất thức ăn chăn nuôi h)h)h)Xylanase"#[9 I#6! Xylanase (Endo – 1,4 – ß – xylanase (1,4 – D – xylan xylanohydrolase: E.C. 3.2.1.8)) là enzyme quan trọng nhất tham gia thủy phân xylan [13, 29]. Xylanase thủy phân xylan bằng cách cắt đứt các liên kết ß – 1,4– glycoside, tạo thành các xylo – oligo [30]. Tuy nhiên, do cấu trúc của xylan rất phức tạp nên để phân cắt nó hoàn toàn cần một lượng lớn enzyme xylanase [19]. Xylanase được tách chiết từ vi khuẩn, nấm chẳng hạn như: Trichoderma, Bacillus, Cryptococcus, Aspergillus, Penicillium, Aureobasidium, Fusarium, Chaetomium, Phanerochaete, Rhizomucor, Humicola, Talaromyces…[22]. Hình 1. 1: Cấu trúc hóa học của xylan Xylan là thành phần chính cấu tạo nên hemicellulose của thành tế bào thực vật và là một trong số hợp chất polysaccharide quan trọng nhất trong tự nhiên [12, 28]. Xylan chủ yếu tìm thấy trong cấu trúc thứ cấp của thành tế bào thực vật và tạo thành pha giữa giữa lignin và các hợp chất polysaccharide khác [29]. Xylan cũng là một trong những polysaccharid phổ biển nhất trong các loài thực vật thông thường, chiếm 30% tổng trọng lượng khô trong sinh khối thực vật nhiệt đới. Với cây gỗ mềm ở vùng ôn đới, xylan ít phổ biến hơn và chiếm khoảng 8% tổng trọng lượng khô [29]. 7 Như vậy, vô tình xylan đã trở thành một trong những thành phần có trong thức ăn chăn nuôi [28]. Xylan đa dạng về cấu trúc và khối lượng phân tử. Xylan là polymer không đồng nhất, mạch thẳng, gồm các đơn phân d – xylose được liên kết với nhau bằng liên kết ß – 1,4 – glycoside. Trong tự nhiên, chúng được thay thế một phần bằng acetyl 4 – 0 – methyl – d – glucuronosyl và arabinofuranosyl tạo thành cấu trúc polymer không đồng nhất. Tác động của xylan về mặt cấu trúc vẫn còn chưa rõ ràng bởi những khó khăn trong việc tách chiết xylan từ nguyên liệu trong tự nhiên mà không bị biến đổi hay mất đi một số cấu trúc ban đầu của xylan cũng như sự liên kết của nó với các thành phần khác [18, 23, 29]. Vi sinh vật tham gia tích cực vào việc phân hủy xylan, đặc biệt là vi sinh vật tiết ra enzyme xylanase. Ứng dụng của xylanase đã được Hoppe - Seyler báo cáo từ hơn một trăm năm qua [18]. Sự phân hủy sinh học bộ khung cấu tạo nên xylan phụ thuộc chủ yếu vào hai lớp enzyme: endo – 1,4 – ß - xylanase (1,4 – ß – D – xylanohydrolase; EC 3.2.1.8), lớp enzyme này thủy phân liên kết 1,4 – ß - Glucosid nối với xylose và ß – xylosidases (1,4 – ß – D – xylan xylanohydrolase; EC 3.2.1.37), lớp enzyme này thủy phân xylobiose và xylooligosaccharid ngắn nhờ hoạt động của enzyme endo – xylanase. Các enzyme loại mạch nhánh (debranching enzyme) chẳng hạn như α – glucuronidase và α – L – arabinifuranosidase và esterase chẳng hạn như acetylxylan esterases và ferulyl và p – coumaroyl esterase sẽ loại bỏ mạch nhánh acetyl và mạch nhánh phenol [29]. Ở cây gỗ rắn, xylan có công thức O – acetyl – 4 – O – methylglucuron – oxylan. Arabino – 4 – O – methylglucuroxylan tìm thấy trong cây gỗ mềm và arabinoxylan rất điển hình trong cây cỏ và thực vật bình thường khác [13]. Sự đa dạng của xylan dẫn đến sự đa dạng của enzyme xylanase [13]. Xylanase tiết ra từ vi sinh vật được chia làm hai họ enzyme thủy phân chính: họ 10 và họ 11 dựa trên trình tự tương đồng của amino acid [28]. Xylanase thuộc họ 10 nhìn chung có khối lượng phân tử lớn (>30 kDa), đa dạng và phức tạp hơn (có thể thủy phân 8 cellulose và xylan), trong khi xylanase thuộc họ 11 có khối lượng phân tử nhỏ hơn (khoảng 20 kDa) và đặc hiệu hơn đối với xylan [13, 29]. Xylanase có trong nhiều loài sinh vật trong tự nhiên, ở sinh vật nhân sơ và sinh vật nhân chuẩn và đã được tìm thấy cả trong vi khuẩn ở nước, nấm, tảo biển, côn trùng. Cho đến nay, hầu hết xylanase được chiết xuất từ vi khuẩn và nấm [13, 29]. Trong đó, nấm sợi là nguồn vi sinh vật tiềm năng nhất để chiết xuất xylanase với hàm lượng cao [13, 29]. Trong nhiều thập kỉ gần đây, xylanase còn được tách chiết từ nấm gây bệnh trên các cây ngũ cốc nói riêng và vi sinh vật gây bệnh thực vật nói chung [29]. Hơn nữa, nhiều vi sinh vật tiết enzyme xylanase phân hủy xylan cũng có thể phân hủy cellulose do sự tương đồng của các liên kết (1,4 – ß – glucosid) giữa hai enzyme celllulase và xylanase. Một số loài Bacillus chỉ tiết ra xylanase, trong khi nhiều loài nấm sợi lại tiết ra lượng lớn protein ngoại bào và tạo thành xylanase thường kèm theo cả enzyme phân hủy cellulose, chẳng hạn như một số loài thuộc Trichoderma, Penicillium và Aspergillus [29]. Do đó, để ứng dụng xylanase đạt hiệu quả cao nhất cần phải loại bỏ ảnh hưởng của cellulase, hoạt động và bền vững với nhiệt độ. Ngày nay, xylanase đã và đang được chú trọng nghiên cứu rộng rãi trên toàn thế giới, từ Châu Âu, đến Châu Á và được áp dụng trong nhiều ngành công nghiệp [13, 30]. h)h)\)i?M!!#8:#,$LK%%$ Xylanase được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Xylanase hỗ trợ quá trình tẩy trắng trong công nghiệp sản xuất giấy thay vì phải sử dụng các hóa chất độc hại; xylanase tham gia quá trình xử lý rác thải nông, lâm nghiệp [8]; trong công nghiệp sản xuất bánh, xylanase được dùng để làm tăng độ phồng và giảm độ dính của bánh; xylanase được dùng trong công nghiệp sản xuất đồ uống, sản xuất nhiên liệu [20, 29]. Một trong những ứng dụng quan trọng của xylanase là được dùng để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi. Sự có mặt của xylanase trong thức ăn chăn nuôi làm giảm độ 9 nhớt trong đường tiêu hóa, giảm rối loạn tiêu hóa, tăng cường hấp thu thức ăn, nhờ vậy cải thiện hệ vi sinh vật đường ruột, giúp phân thải ra khô hơn [4, 5, 13, 27]. Ngoài xylanase, một số enzyme khác cũng được dùng để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi, bao gồm: mananase, ß – glucanase và cellulase, α – amylase, protease và phytase. Các loại enzyme này đều được sử dụng rộng rãi trong nhiều năm qua trên toàn thế giới, từ Châu Âu, đến Châu Mĩ và Châu Á [5, 13, 27]. Do tiềm năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực mà xylanase đã thu hút mạnh mẽ sự quan tâm của các nhà nghiên cứu. Xylanase tách chiết từ Aspergillus đã được tách dòng và biểu hiện thành công. Đặc tính của enzyme này cũng đã được phân tích [13]. Những thành tựu trên là cơ sở để nghiên cứu tạo sinh vật chuyển gen mã hóa xylanase vào vật chủ mong muốn với mục đích thu lượng lớn enzyme phục vụ cho các ngành sản xuất công nghiệp. 1.2. Nấm mốc và ứng dụng của công nghệ chuyển gen vào nấm mốc thông qua <)$28j!8# h)\)h)'X/$"FL224 Nấm mốc hay còn gọi là nấm sợi là vi sinh vật đa dạng nhất trong tự nhiên. Ước tính có khoảng 1,5 triệu loài nấm, trong đó chiếm số lượng lớn là các loài thuộc chi Aspergillus. Chúng là các vi sinh vật nhân chuẩn bậc thấp, sinh bào tử và sống hoại sinh nhờ khả năng sinh enzyme để phân hủy các hợp chất hữu cơ [8, 22]. Aspergillus là một chi thuộc ngành Eumycota và gồm rất nhiều loài phổ biến, ví dụ: A. niger, A. oryzae . Giống như các loài khác trong chi Aspergillus, A. niger sinh bảo tử có màu đen, vì thế chúng còn được gọi là mốc đen [33]. A. niger gây ảnh hưởng đến các sản phẩm nông sản sau khi thu hoạch nhưng chúng ít gây bệnh cho con người so với một số loài thuộc chi Aspergillus chẳng hạn như A. flavus, A. fumigatus. A. niger cũng đã được sử dụng từ rất lâu trong sản xuất thực phẩm, sản xuất citric acid, gluconic acid gluconic [33]. Nhờ khả năng tiết enzyme với hàm lượng cao, A. niger được sử dụng phổ biến trong sản xuất thực phẩm và được coi là loài một vi sinh vật quan trọng trong sản 10 [...]... bằng cách thay các gen tạo khối u (oncogenes) nằm trong 2 đầu vùng biên bằng các gen mong muốn Khi các gen tạo khối u bị loại bỏ, tế bào hoặc mô thực vật chuyển gen sẽ phát triển bình thường [1, 22] Gen tổng hợp opine cần thiết để tổng hợp opine [12, 26] Hợp chất này không được tổng hợp trong Agrobacterium mà chỉ được tổng hợp trong tế bào vật chủ vì gen điều khiển sự biểu hiện của gen sinh tổng hợp... vùng gen độc trong DNA của chúng, các gen độc sẽ cảm ứng vi khuẩn chuyển gen quan tâm sang tế bào chủ khi có mặt các chất cảm ứng; iv) chủng vi khuẩn chuyển gen sẽ được tiến hành nuôi nhiễm với bào tử nấm A niger trong môi trường có bổ sung chất cảm ứng AS; v) nấm chuyển gen được chọn lọc và phân biệt với nấm không được chuyển gen dựa trên đặc tính của đoạn DNA được chuyển vào nấm hoặc dựa trên sự biểu. .. ghép gen * Chuẩn bị vector và gen mong muốn cho phản ứng nối ghép gen – Tinh chế đoạn gen và vector: Để nối ghép gen vào một vector, trước hết chúng phải được với cùng một enzyme cắt giới hạn để tạo đầu cắt tương ứng cho phản ứng nối ghép gen Ngoài ra, để phản ứng đạt hiệu suất cao cần tinh chế đoạn gen hoặc vector trước khi tiến hành lai Phản ứng cắt lượng lớn để thôi gel và tinh sạch đoạn gen và vector. .. phân tử T – DNA có mang gen mong muốn hoặc thay đổi điều kiện khi nuôi nhiễm hoặc thay đổi gen chọn lọc [11] Như vậy, rõ ràng hệ thống chuyển gen nhờ Agrobacterium là một hệ thống chuyển gen hiệu quả, đơn giản và là một công cụ hữu ích để chuyển gen vào nấm mốc [9, 11, 12, 16] 20 1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen vào nấm mốc thông qua Agrobacterium Chuyển gen vào nấm thông qua A tumefaciens... nấm hoặc dựa trên sự biểu hiện của gen được chuyển Nấm chuyển gen tiếp tục được nuôi cấy trên môi trường chọn lọc để làm ổn định nguồn gen [11, 22] 18 Như vậy, phương pháp chuyển gen vào nấm mốc thông qua Agrobacterium không khác nhiều so với phương pháp chuyển gen vào thực vật Đó là chúng đều cần một sinh vật chuyển gen gián tiếp, một Ti plasmid tái tổ hợp đã ghép nối đoạn gen mong muốn, và đều phải... Các hệ thống vector dùng trong chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium * Vector liên hợp (cointegrate) Vì kích thước Ti plasmid quá lớn nên thao tác với chúng rất khó khăn Giải pháp cho việc này là chuyển vùng T – DNA lên một vector nhỏ hơn Điều này là hoàn toàn có thể nhờ gen vir đóng vai trò vận chuyển gen vào tế bào chủ Hệ thống này gọi là hệ thống vector liên kết Cả gen tiền ung thư và gen tổng hợp... 16] Tuy nhiên, hiệu suất chuyển gen vào nấm thông qua Agrobacterium cũng khác nhau khi sử dụng các loài nấm khác nhau Do đó, để hiệu suất chuyển gen đạt được cao nhất, các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen cần được tối ưu hóa [18] • Nguyên liệu nấm Một trong những thuận lợi của phương pháp chuyển gen nhờ Agrobacterium là nguyên liệu ban đầu dùng cho chuyển gen gen rất đa dạng Nguyên liệu để... tự có tốc độ sao mã cao [12] Ngoài các kỹ thuật chuyển gen trực tiếp, chuyển gen có thể được thực hiện một cách gián tiếp thông qua vi khuẩn A tumefaciens Phương pháp này đã và đang được nghiên cứu và ứng dụng để chuyển gen vào nấm mốc [1, 9, 12] 11 1.2.2 Agrobacterium và ứng dụng trong công nghệ chuyển gen thực vật và nấm 1.1.2.1 Giới thiệu về vi khuẩn đất Agrobacterium tumefaciens Trong tự nhiên,... Colletotrichuni gloeosporioides Chuyển gen vào nấm mốc gián tiếp thông qua A tumefaciens gồm một số bước sau: i) trước hết gen cần chuyển phải được nối ghép với một vector tách dòng của A tumefaciens; ii) gen mong muốn phải được nối ghép vào giữa biên phải và biên trái của vector tách dòng để lợi dụng cơ chế chuyển gen của loài vi khuẩn này; iii) vector tái tổ hợp mang gen mong muốn phải được biến nạp vào... các kỹ thuật chuyển gen khác được áp dụng ví dụ: chuyển gen nhờ các transposon hay nhờ các enzyme giới hạn Tuy nhiên, các kỹ thuật này bộc lộ nhiều nhược điểm, chẳng hạn như tần suất tái tổ hợp tương đồng thấp; có thể chuyển nhiều loại gen, kể cả những gen không mong muốn [11, 16]; có thể tạo ra những vùng gen không mã hóa hoặc sau khi chuyển gen thường xảy ra hiện tượng sắp xếp lại genome hoặc tồn tại![Hình 1. 2: Khố iu thực vật do Agrobacterium [18] - Thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa xylanase trong nấm mốc](https://media.store123doc.com/figures/002/706/hinh-kho-iu-thuc-vat-agrobacterium-2706994.png)
![Hình 1. 3: Mô hình xâm nhiễm của A. tumefaciens vào tế bào thực vật [19] - Thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa xylanase trong nấm mốc](https://media.store123doc.com/figures/002/706/hinh-mo-hinh-xam-nhiem-tumefaciens-thuc-vat-2706995.png)
