ĐỀ TÀI: Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bảo vệ PA của vi khuẩn bacillus anthracis

Chính vì vậy, việc nghiên cứu phát hiện, chẩn đoán bệnh than và tác nhân gây bệnh than là rất quan trọng Kháng nguyên tái tổ hợp PA là một trong 3 loại độc tố than của vi khuẩn Bacillu

MỞ ĐẦU

Bệnh than là một căn bệnh nhiễm khuẩn cấp tính do vi khuẩn

Bacillus anthracis (B anthracis) gây ra cho gia súc, đặc biệt là cho các

động vật ăn cỏ nh- trâu, bò, dê cừu ngựa Bệnh than có khả năng lây nhiễm sang người thành dịch với tỷ lệ tử vong cao Bệnh có nhiều dạng biểu hiện khác nhau tuỳ theo cách tiếp xúc với bệnh, nhưng nhìn chung, bệnh than bao gồm 4 dạng: than thể da, than thể hô hấp, than thể tiêu hoá và than thể màng não

Bệnh than là một căn bệnh vô cùng nguy hiểm Nã mang một số đặc điểm được trung tâm kiểm soát và ngừa bệnh Hoa Kỳ dùng để nhận biết các trường hợp có thể làm vũ khí sinh học như thời gian lây nhiễm nhanh, tỷ lệ gây chết cao, tác nhân gây bệnh có thể chống chịu được với điều kiện khắc nghiệt Chính vì vậy, việc nghiên cứu phát hiện, chẩn đoán bệnh than và tác nhân gây bệnh than là rất quan trọng

Kháng nguyên tái tổ hợp PA là một trong 3 loại độc tố than của vi

khuẩn Bacillus anthracis PA là nhân tố quyết định tính độc của vi khuẩn

than Bản thân PA không gây độc nhưng khi kết hợp với nhân tố gây chết

LF hay nhân tố gây phù thũng EF lại sinh sản độc tố gây chết hoặc phù thũng cho tế bào vật chủ Ngoài ra, PA còn có chứa vùng liên kết thụ thể

và có khả năng gây đáp ứng miễn dịch chống bệnh than Chính vì vậy, hiện nay có nhiều nghiên cứu sử dụng kháng nguyên bảo vệ PA để tạo protein tái tổ hợp làm nguyên liệu để tạo kit chuẩn đoán bệnh than còng nh- tạo vaccine phòng chống bệnh than

Trên thế giới hiện nay đã có rất nhiều công trình công bố về việc

biểu hiện gan pagA mã hoá kháng nguyên bảo vệ PA Tuy nhiên, ở Việt

Nam đây vẫn là vấn đề mới đang được quan tâm Đáp ứng những yêu cầu cấp bách trong phòng và trừ bệnh than, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:

“Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bảo vệ PA của vi

khuẩn Bacillus anthracis”

Mục tiêu của đề tài:

 Biểu hiện protein PA của vi khuẩn B anthracis trong E coli BL21,

 Thu nhận protein PA với lượng lớn để tinh sạch

Nhiệm vụ của đề tài:

 Thiết kế vector biểu hiện pET-TRX-FUS mang gen pagA,

 Nghiên cứu tạo chủng E coli BL21 tái tổ hợp mang gen pagA,

 Tìm ra điều kiện thích hợp cho quá trình biểu hiện về nhiệt độ,

nồng độ IPTG, thời gian,

 Tinh sạch được protein trên cột sắc kí ái lực Probond Nikel Resin

CHƯƠNG I

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

I Sơ lược về bệnh than

1 Lịch sử xuất hiện và phát triển của bệnh than

Bệnh than hay còn gọi là bệnh nhiệt thán, đã gây ra những thiệt hại vô cùng to lớn cho ngành chăn nuôi gia súc cũng nh- làm ảnh hưởng tới sức khoẻ con người Vì thế mà nó được đặt tên là “Black Bane” nghĩa là thảm hoạ

đen, vì khi bị nhiễm bệnh, vết thương có màu đen [1] “Bệnh Than” bắt

nguồn từ Hy Lạp “Anthrakos” nghĩa là than, do vết thương trên da có màu đen Bệnh than được tìm ra bởi John Bell vào cuối thế kỷ 15

Năm 1876, Robert Kock đã tìm ra nguốn gốc của bệnh than và quả

trình hình thành bào tử của vi khuẩn Bacillus anthracis (B anthracis)

Bệnh than thường xuất hiện ở những trang trại vào một thời điểm nhất định, đặc biệt là những vùng nông nghiệp phía Nam Châu Mỹ và Châu Phi Bệnh thường gặp ở những động vật ăn cỏ nh-: cừu, dê, ngựa, trâu bò Đặc biệt bệnh có thể lây nhiễm sang người nên được coi là mối hiểm hoạ đe doạ cho sức khoẻ cộng đồng

Trận dịch Than được biết đến đầu tiên trong Lịch sử xảy ra năm 1500 Trước Công Nguyên làm chết nhiều vật nuôi của người Ai Cập

Năm 1491 Trước Công Nguyên, tiếp tục một cơn lốc bệnh Than ở Ai Cập làm chết nhiều gia súc, và làm nóng lên sự kiện bệnh Than

Những năm 1960, bệnh than đã làm chết khoảng 60.000 gia súc ở Châu

Âu

Năm 1789, một trận dịch bệnh than lan tràn ở vùng Tresnobin (Nga) Tháng 4/1979, ở Sverdlovsk, Liên Xô nay là Ekatarinbua, xảy ra một

trận dịch than thể hô hấp làm chết 66 người [20] Sau đó vài năm, một trận

dịch tương tự xảy ra ở Paraguay

Năm 1989, ở miền Bắc xứ Wales xảy ra một trận dịch than lớn Người

ta phải giết 4492 con gia súc bị nhiễm than và áp dụng các biện pháp sát trùng chất thải, nhà cửa, thiết bị, đường xá, đất đai bằng fomalin

Năm 1978- 1980, một trận dịch than ở Zimbabwe làm hơn 6000 người

bị nhiễm bệnh và 100 người chết

Sau sự kiện ngày 11/9/2001, bọn khủng bố sinh học đã dùng bào tử của

vi khuẩn B anthracis tấn công một số bưu điện của Mỹ bằng các phong bì thư

làm 5 người chết và 17 người bị nhiễm bệnh [1]

Trận dịch Than gần đây nhất là ngày 14/6/2005 xảy ra ở một quốc gia nhỏ ở Châu Phi làm chết 4 người và hơn 80 người bị nhiễm bệnh [27]

Ở Việt Nam, bệnh Than cũng đã xuất hiện từ lâu nhưng Ýt được thông báo Theo số liệu thống kê của Viện Vệ sinh Dịch tÔ Trung ương, năm 1997

có 30 người mắc bệnh Than, năm 1998 có 59 người, năm 1999 có 58 người Riêng năm 2000 có 27 người mắc bệnh than, trong đó có 12 ca ở Cao Bằng,

11 ca ở Lai Châu, 4 ca ở Đồng Nai, tuy nhiên không có ca nào bị tử vong Hầu hết các ca mắc phải đều tập trung ở miền núi chăn nuôi gia súc lớn nh-

Thanh Hoá, Tuyên Quang, Nghệ An, Lai Châu, Đắk Lăk [1, 2] Đối với các

trường hợp mắc bệnh than ở nước ta hầu hết do tiếp xúc với động vật ăn cỏ

nh- trâu, bò, những người làm nghề thuộc da chế biến xương [28]

người ta chia bệnh than thành 4 các thể than khác nhau: Than da, than tiêu hoá, than hô hấp, than màng não [19]

2.1 Bệnh than thể da

Đây là hình thức thức than phổ biến nhất chiếm hơn 90% và loại bệnh

có khả năng điều trị Bệnh thường gặp ở những nhóm đối tượng nguy cơ lây nhiễm cao, thường xuyên tiếp xúc với động vật và các sản phẩm từ gia súc đã

bị nhiễm than, thường là những người nông dân, bác sỹ thú y, người giết mổ

gia sóc hay thịt Từ các vết thương hở trên da, vi khuẩn hay bào tử B

anthracis có thể xâm nhập vào

Hình 1.1: Bệnh than thể da

Triệu chứng của bệnh: Sau 1-2 ngày đầu thấy xuất hiện các vết sẩn ngứa như côn trùng đốt, dần dần xuất hiện các dấu hiệu ngoại tử trong vùng tâm Sau 2-3 ngày sẽ xuất hiện các mụn nhỏ hay nốt nhú tại vị tri nhiễm, xung quanh xuất hiện các mụn nước Vài ngày sau, tại vùng trung tâm vết loét sẽ xuất hiện các nốt đen, khô bắt đầu bong vẩy Trong khoảng 1-2 tuần kể từ khi nhiễm bệnh sẽ xuất hiện các mủ và các hiện tượng đau nhức, mệt mỏi, sốt, bạch cầu tăng, các hạch bạch huyết tăng lên Sau đó vùng thương tổn sẽ chuyển sang dạng tự phát Nếu bệnh nặng thêm vết loét sẽ lan rộng và ăn sâu

làm nhiễm trùng máu dẫn đến không thể chữa khỏi Than da gây tử vong khoảng 20% các trường hợp không được điều trị

2.2 Bệnh than thể tiêu hoá

Nguyên nhân của bệnh than thể tiêu hoá là do ăn phải thịt gia súc đã bị nhiễm bào tử than mà không được nấu chín, thậm chí cả khi được nấu chín thì khả năng gây bệnh vẫn cao [2] Người ta tìm thấy vi khuẩn than trong dịch ruột của bệnh nhân mắc bệnh than Đầu tiên vi khuẩn sẽ tấn công vào những

vị trí thương tổn của màng ngày ruột và dạ dày Từ những vị trí này sẽ xuất hiện những vết loét, lan rộng và lan vào hệ bạch huyết Bệnh than tiêu hoá thường Ýt gặp nhưng lại có tỷ lệ tử vong khá cao Bệnh thường có hai thể lâm sàng [11]:

Thể bụng: dấu hiệu đầu tiên và rất dễ nhận là có thương tổn xuất huyết hoại tử ở manh tràng và các vùng lân cận Triệu chứng ban đầu không đặc biệt với những cảm giác buồn nôn, biếng ăn, sốt cao Sau đó là các triệu chứng đau bụng, tiêu chảy, sốc do nhiễm trùng và tử vong Bệnh nhân có thể viêm phúc mạc hoặc viêm lá lách do vi khuẩn tấn công vào khu bạch huyết Sau 2-3 ngày kể từ khi xuất hiện dấu hiệu của bệnh sẽ gây tử vong

Thể họng, miệng: Tại vùng thương tổn thấy xuÊt hiện hoại tử ở vùng vòm họng, cổ họng cứng, sưng amidan Bệnh nhân sốt cao, khó nuốt, hạch vùng cổ sưng to, nhiễm độc máu và đa số dẫn đến tử vong Dạng than này có

tỷ lệ tử vong cao chiếm 50% mặc dù có được điều trị

Hình 1.2: Manh tràng đã bị nhiễm vi khuẩn than

2.3 Bệnh than hô hấp

Nguyên nhân gây than hô hấp là do hít phải bào tử than Sau khi vào cơ

thể, các bào tử than sẽ phát triển thành thể hoạt động và di chuyển tới các phế nang, hạch lympho phổi và trung thất gây xuất huyết hoại tử và phù thũng làm trung thất giãn rộng ra cả hai bên làm bệnh nhân có cảm giác đau vùng ức, sốt cao Các thương tổn xuất huyết và hoại tử lan đến màng phổi gây tràn máu màng phổi Khí quản cũng bị ảnh hưởng với các triệu chứng nh- ho khan, co thắt, vùng phổi bị phù Vi khuẩn sẽ theo đường máu lan đến phần dưới niêm mạc của ống tiêu hoá và tạo nên các vết loét ở thành ruột làm bệnh nhân nôn

ra máu, tiêu hoá ra máu hoặc cả hai triệu chứng trên Một sè nang Lympho của đường tiêu hoá cũng bị phù và xung huyết, nếu bệnh nặng hơn có thể biến chứng sang thể màng não gây xuất huyết Đa số bệnh nhân đều tử vong trong khoản 1- 2 ngày kể từ khi phát bệnh Tỷ lệ tử vong của bệnh than này rất cao

Hình 1.3: Trung thất dãn ra do hít phải bào tử than

2.4 Bệnh than thể màng não

hiện khi vi khuẩn B anthracis tấn công vào hệ thống thần kinh trung ương

theo đường máu và các mạch bạch huyết Triệu chứng của bệnh là thường sốt

cao, mệt mỏi, đau cơ, đau đầu, buồn nôn lên cơn mê sảng khi phát bệnh và dẫn đến hôn mê Đa số bệnh nhân thường dẫn đến tử vong sau 1- 2 ngày kể từ khi mắc bệnh Thể than này có tỷ lệ tử vong rất cao

Hình1 4: Não của người bị nhiễm bệnh than

3 Bệnh than và chiến tranh sinh học

Sức tàn phá của bệnh than là vô cùng to lớn, đồng thời nó dễ chuẩn bị

và phát tán nhanh nên đã được sử dụng nh- một loại vũ khí sinh học làm tê

liệt cả một thành phố, thậm chí cả một quốc gia [24]

Trong chiến tranh thế giới thứ nhất, bệnh than đã được sử dụng nh- một thứ vũ khí vô cùng lợi hại Một vài nước nh- Đức, Nhật, Hoa Kỳ, Liên hiệp Anh, Iraq và Liên Xô cũ đã thừa nhận là sử dụng bệnh than làm phương tiện của chiến tranh [30]

Năm 1915, Mỹ đã tiêm vi khuẩn bệnh than vào ngựa, la, trâu, bò, để cung cấp cho các nước trong chiến tranh thế giới thứ nhất

Năm 1937, Nhật bắt đầu thử nghiệm vũ khí bệnh than ở Mãn Châu Lý (Trung Quốc)

Năm 1942, Liên hiệp Anh cũng tiến hành thử nghiệm vũ khí bệnh than

ở Gruinard Island, vùng duyên hải Scotland

Năm 1943, Mỹ bắt đầu phát triển vũ khí bệnh than Sau chiến tranh thế giới thứ hai, Mỹ vẫn tiếp tục thực hiện chiến tranh sinh học ở Fort Detrick, Maryland

Mặc dù năm 1972, quy ước Quốc tế cấm phát triển và dự trữ vũ khí sinh học nhưng các cuộc chiến tranh và khủng bố vẫn tiếp diễn

Năm 1979, bào tử than đã được phóng thích ở quân đội Liên Xô cũ làm chết 68 người

Năm 1991, lính Mỹ được tiêm phòng vaccine bệnh than để chuẩn bị cho chiến tranh vùng vịnh

Năm 1990-1993, nhóm khủng bố Aum Shinrikyo đã phóng thích bệnh than ở Tokyo nhưng không gây tổn thương

Năm 1995, Iraq thừa nhận đã tạo ra 8.500 lá thư có chứa tác nhân gây bệnh than

Ngày 22/10/2001, những lá thư có chứa bào tử than được chuyển đến các bưu điện Mỹ làm 5 người chết, và 17 người bị nhiễm bệnh Sự kiện này

đã làm đau đầu các nhà cầm quyền Mỹ và buộc họ phải chi trả nhiều triệu đô

la cho việc tiêm phòng vaccine

Tháng 9/2001, sau vụ khủng bố ngày 11/9, tại Cangene xảy ra một vụ tương tự làm 22 người mắc bệnh trong đó 11 người mắc bệnh than da và 11 người mắc bệnh than hô hấp, 5 người trong số mắc than hô hấp đã chết [31]

Nguyên nhân mà bệnh than được sử dụng như một loại vũ khí sinh học hiệu quả là do vi khuẩn than phát tán rất nhanh và bào tử của nó có khả năng chống chịu tốt với điều kiện khắc nghiệt của ngoại cảnh

Trước tình hình chính trị bất ổn như hiện nay thì nguy cơ xảy ra chiến tranh sinh học luôn là mối đe doạ lớn Vì vậy chóng ta cần phải nghiên cứu kỹ

về tác nhân và cơ chế gây bệnh than để ngăn ngừa và chống lại chúng bất cứ lúc nào

II Tác nhân gây bệnh than

Năm 1849, lần đầu tiên nguồn gốc bệnh than được nhà nghiên cứu

người Đức Pallender phát hiện ra tác nhân gây bệnh là vi khuẩn B anthracis

Năm 1950, ông Daven, nhà nghiên cứu người Pháp cũng tìm ra tác nhân gây

bệnh là B anthracis Nhiều năm đó, cũng có nhiều nhà khoa học nghiên cứu

kỹ hơn về loại vi khuẩn này nh- Kock và cộng sù (1876), Pasteur và cộng sự (1877), Xenkovck và cộng sự (1883) Năm 1877, Kock đã nuôi cấy vi khuẩn

B anthracis trên môi trường tinh khiết và chứng minh nó có khả năng hình

thành bào tử và có thể gây chết cho động vật Ông đã chứng minh sự có mặt của vi khuẩn này trong máu của động vật chết bởi bệnh than Năm 1822 -

1905, Pasteur và cộng sự đã tìm thấy bào tử B anthracis ở nơi chôn xác động

vật bị chết bởi bệnh than

Vi khuẩn B anthracis thuộc nhóm I, chi Bacillus Nó tồn tại trong đất, trong nước và không khí Vi khuẩn B anthracis là vi khuẩn gram dương sinh

bào tử (trong điều kiện kị khí hay kị khí bắt bắt buộc) không có lông roi nên không có khả năng di động Kích thước tế bào từ 3-5 m, rộng từ 1-2 m Tế bào hình que, vuông đầu, sắp xếp với nhau thành chuỗi dài như sợi rơm hoặc chỉ vài tế bào nối với nhau [19]

Hình 1.5: Hình thái tế bào của vi khuẩn Bacillus anthracis

Bào tử B anthracis có hình elip nằm ở trung tâm tế bào, kích thước

khoảng từ 1- 1,5 m, nang bào tử không phồng, bào tử được hình thành vào thời kỳ cuối của pha sinh trưởng Logarit [15]

Hình 1.6: Bào tử của vi khuẩn Bacillus anthracis

Khuẩn lạc B anthracis có màu trắng sữa hoặc trắng xám tới xám, bề mặt sần sùi, dính, ướt, đường kính 3-5mm [5]

Điều kiện thích hợp cho B anthracis phát triển là ở điều kiện nhiệt độ

28-320C, pH=7, thời gian nuôi cấy từ 3 - 5 ngày Khi gặp điều kiện bất lợi tế bào sinh dưỡng sẽ hình thành nội bào tử Các nội bào tử nằm bên trong tế bào

mẹ, khi tế bào mẹ phân giải, thì các nội tử sẽ được giải phóng, chúng có thể tồn tại và phát triển độc lập trong một thời gian dài Các nội bào tử khá bền vững, chúng có thể chịu đựng được các điều kiện khắc nghiệt của môi trường bên ngoài như tia tử ngoại, sự ăn mòn, nhiệt độ môi trường (quá nóng hay quá lạnh), thiếu hụt chất dinh dưỡng hoặc nước Khi gặp điều kiện thuận lợi, các nội bào tử sẽ nảy mầm và phát triển thành tế bào sinh dưỡng Các tế bào sinh dưỡng lại tiếp tục phát triển nếu gặp điều kiện thuận lợi và ngược lại nếu gặp điều kiện bất lợi nó lại hình thành nên các nội bào tử

Bào tử B anthracis được hình thành trong điều kiện nhiệt độ 12- 420

C

và có khả năng chống chịu tốt với các điều kiện khắc nghiệt Bào tử B

anthracis đã được tìm thấy ở rất nhiều nơi trên thế giới Nó vùi sâu trong lòng

đất và có thể tồn tại ở đó hàng chục năm Sau những cơn mưa rào hoặc hạn hán, bào tử sẽ nảy mầm trên bề mặt đất, khi động vật ăn phải sẽ bị nhiễm

bệnh và chết Bào tử B anthracis có khả năng chống chịu với điều kiện khắc

nghiệt của ngoại cảnh rất tốt, vì vậy nó được sử dụng nh- một thứ vũ khí lợi hại trong chiến tranh và khủng bố [8]

2 Đéc tố của vi khuẩn B anthracis

Các độc tố của vi khuẩn B anthracis bao gồm độc tố vỏ nhày và các độc tố than Độc tố vỏ nhày bản chất là acid poly -  - D- glutamic, đã được

mã hoá bởi các gen capA, capB, capC nằm trên plasmid pXO2 (95kb) Các

độc tố than bao gồm kháng nguyên bảo vệ PA, nhân tố gây chết LF, nhân tố

gây phù nhũng EF Các độc tố than lần lượt được mã hoá bởi các gen pagA,

lef và cya, các gen này nằm trên plasmid pX01 (185kb) [6, 15]

2.1 Độc tố vỏ nhày

Độc tố vỏ nhày hay vá capsule có bản chất là acid poly - D

-glutamic, có trọng lượng phân tử là 215 kDa ở trong tế bào và ở ngoài tế bào

là 20- 55 kDa Nó được mã hoá bởi các gen cap nằm trên plasmid pXO2 có

khuẩn lạc nhẵn [19]

Vỏ nhày không được hình thành khi nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường dinh dưỡng thông thường Nó chỉ hình thành trong môi trường thạch huyết ngựa hoặc môi trường có bổ sung 0,7 % Na2CO3, ủ ở 370C, trong điều kiện bị

khí [11] Bản thân chuỗi Poly -  - D- glutamic không gây độc nhưng có chức

năng bảo vệ vi khuẩn chống lại thành phần diệt khuẩn của huyết thanh và bạch huyết, chống lại hiện tượng thực bào Vì vậy, vỏ nhày có vai trò trong suốt quá trình xâm nhiễm và có vai trò nhất định trong giai đoạn cuối của bệnh [11]

2.2 Độc tố than

Các độc tố than đóng vai trò quan trọng trong quá trình gây bệnh ở cả

giai đoạn đầu của bệnh cũng như trong suốt quá trình phát triển của bệnh [7]

Độc tè than bao gồm 3 thành phần: Kháng nguyên bảo vệ PA (Protective antigen), nhân tố gây phù thòng EF (Edema Factor) và nhân tố gây chết LF (Lethal Factor)

2.2.1 Kháng nguyên bảo vệ PA (Protective Antigen-PA)

Protein độc tố PA hoàn chỉnh có trọng lượng phân tử là 83kDa, bao gồm 735 acid amin (Mr82,684), 394 phân tử nước và 2 nguyên tử canxi Phân

tử PA hoàn chỉnh có 4 vùng chức năng, mỗi vùng có vai trò khác nhau trong quá trình nhiễm bệnh [19, 22]

Kháng nguyên bảo vệ PA được mã hoá bởi gen pagA nằm trên plasmid

XO1 Bản thân PA không gây độc nhưng khi kết hợp với nhân tố gây chết LF hay nhân tố gây phù thũng EF lại sinh sản độc tố gây chết hoặc phù thũng cho

tế bào vật chủ Do đặc tính này mà kháng nguyên bảo vệ PA được xem là một kênh dẫn truyền gián tiếp cho các nhân tố EF và LF để chúng phát huy độc lực

2.2.2 Tác nhân gây phù thũng (Edema Factor - EF)

EF được coi nh- mét enzym Adenylate Cyclase (AC), có trọng lượng

phân tử 89 kDa, chứa 767 gốc axid amin Nó có chức năng chuyển hoá ATP nội bào thành cAMP, quá trình này được thực hiện khi EF kết hợp với Calmodulin (CaM- là một thụ quan canxi lớn trong tế bào nhân chuẩn [19,

22] EF phụ thuộc calmodulin có 3 trình tự được duy trì chặt chẽ, gồm 24

acidamin (303-339) mang vị trí gắn ATP Trình tự này có liên quan đến quá trình xúc tác EF có thể tương tác với màng kép lipid mà không phụ thuộc vào

pH, không giống như LF, EF còn liên kết với các lỗ màng sau khi được

chuyển vào trong tế bào chất [19]

Khi EF được kháng nguyên bảo vệ PA dẫn vào trong tế bào vật chủ độc

tố EF sẽ gây nên hiện tượng mất cân bằng enzym và dẫn đến làm mất tính thấm của tế bào vật chủ Dịch tế bào bị dồn ứ và gây nên hiện tượng trương bào, màng tế bào căng ra mọng nước, đây chính là nguyên nhân gây phù

thũng ở tế bào vật chủ [18]

Hình 1.7: Tác nhân gây phù thũng EF

Nhân tố gây phù thũng EF được tạo bởi Ýt nhất 3 vùng chức năng riêng biệt, trong đó có vùng EF3 (là phức tạp bởi phần enzym của EF với CaM và adennosine 5’-  - β - Methylene – triphosphat, đây là vùng quan trọng nhất,

nó kết hợp với CaM để gây phù thũng cho tế bào vật chủ

2.2.3 Nhân tố gây chết (Lethal Factor- LF)

Nhân tố gây chết LF là một protein gồm 776 acid amin, trọng lượng

phân từ 90kDa Nó được coi là một nhân tố quan trọng do vi khuẩn B

anthracis tiết ra [19]

LF chứa một loạt 4 trình tự lặp lại không hoàn toàn trong phần trung tâm, sự mất đoạn trong vùng này làm protein bị bất hoạt hoặc không hoạt động Sự đột biến ở những gốc có tính chất quyết định sẽ tiêu huỷ hoạt tính độc tố gây chết và gắn Zn2+

với LF [19] Vì thế, LF được coi là một metalloprotease kẽm [9] Gần đây, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng LF phân giải

các acid amin đầu N của protein kinase hoạt hoá quá trình phân bào (Mitogen

Activated Protein Kinase- MAPKs) [19] Sự đột biến ở vùng xúc tác của LF

sẽ làm mất độc tính của đại thực bào và ảnh hưởng đến sự phân bào [6]

Hình 1.8: Nhân tố gây chết LF

Khi LF kết hợp với Zn2+ sẽ làm tăng quá trình sản xuất cytokin trong đại

thực bào và tế bào bạch huyết [18] Đây chính là nguyên nhân gây phá huỷ

đại thực bào và là thủ phạm chính dẫn đến hiện tượng sốc và tử vong Sau khi được vận chuyển vào trong tế bào, độc tố LF sẽ làm tăng tính thấm của các ion Na+ và K+, sau đó là quá trình thuỷ phân ATP Quá trình này ức chế sự

tổng hợp các đại phân tử liên quan đến đáp ứng miễn dịch [10] LF phong toả

hệ thống báo động của cơ thể bằng cách gắn với một cấu trúc protein đặc biệt của tế bào, vùng metallo- protease của LF sẽ nhằm tới các kênh dẫn truyền tín hiệu nội bào làm cho những thông tin mà tế bào cần thông báo cho hệ miễn dịch về sự xuất hiện của yếu tố lạ bị đình chỉ, từ đó các protease sẽ phá huỷ cấu trúc nội bào gây chết cho tế bào vật chủ

3 Điều khiển sự biểu hiện của các gen gây độc trong vi

khuẩn B anthracis

Người ta đã xác định được rằng có hai nhân tố chính điều hoà sự dịch

mã và biểu hiện của gen là atxA và acpA Gen acpA nằm trên plasmind pXO2 hoạt hoá sự biểu hiện của gen capB (mét trong các gen mã hoá vỏ capsule) Gen atxA nằm trên plasmind pXO1 hoạt hoá sự biểu hiện của các gen capB

và các gen mã hoá protein độc tố pagA, lef và cya Gen atxA là nhân tố điều

hoà dương cho sự hoạt hoá quá trình dịch mã của các gen độc tố Sự hoạt hoá này phải thực hiện trong môi trường có nồng độ CO2/bicacbonat cao Ngoài ra

atxA còn thực hiện một vai trò khác là điều chỉnh sự biểu hiện của các gen

độc tố khi nó xâm nhiễm vào tế bào vật chủ để gây độc [19, 26]

Để hiểu rõ vai trò của nhân tố điều hoà atxA, người ta tiến hành gây đột biến để tạo một thể đột biến atxA Khi nuôi cấy trong môi trường giàu dinh dưỡng, thể đột biến atxA và chủng gốc có sự phát triển nh- nhau Nhưng trên

trường tương tự khác thì thể đột biến không gây độc chủng Steme (pXO1+

pXO2) rất khó phát triển Thể đột biến này tạo ra những đám khuÈn lạc nhỏ

hơn so với chủng gốc Nh- vậy gen atxA có liên quan trực tiếp đến sự tổng

hợp vỏ capsule có nghĩa là nó liên quan đến gen mã hoá vỏ capsule Đồng

thời sự có mặt của atxA còn có tác dụng rõ rệt đến sự hình thành bào tử Thể đột biến atxA của chủng Sterne tạo nhiều bào tử hơn khi phát triển trong môi trường giàu dinh dưỡng, còn các chủ Sterne ban đầu mang đột biến atxA

nhưng đã loại bỏ các gen độc tố thì không có đặc tiònh trên Điều đó thể hiện

sự liên quan chặt chẽ của atxA và các gen độc tố [26]

Cùng với hai nhân tố điều hoà acpA và atxA, người ta cũng tìm thấy một gen pag kích thước 300bp, nó cùng được dịch mãc xuôi chiều với gen

pagA Gen pagR mã hoá cho mét protein có trình tự acid amin giống các tác

nhân điều hoà dịch mã trong các sinh vật khác Gen pagR ức chế sự biểu hiện

của gen acpA và atxA Ngoài ra, gen pagR còn điều khiển sự biểu hiện của một vài tổ hợp phiên mã promoter- lacZ được hoạt hoá bởi CO2

/atxA Sự điều hoà những tổ hợp này cùng với gen pagA và pagR có thể phụ thuộc vào sự thay đổi mức độ AtxA hoặc không phụ thuộc vào sự biểu hiện của atxA [26]

Sự dịch mã các gen độc tố và gen mã hoá vỏ capsule tăng lên khi tế bào phát triển trong môi trường có nồng độ CO2/bicacbonat cao và ngược lại, nếu

nồng độ này thấp sẽ ức chế quá trình dịch mã [15]

Hai nhân tố là CO2/bicacbonat và nhiệt độ cũng đóng vai trò quan trọng trong sự biểu hiện của 3 gen độc tố Sự tổng hợp độc tố thu được nhiều nhất khi ủ canh trường có nồng độ CO2>>5% hoặc bổ sung khí bicacbonat vào môi trường đã được đậy kín Sự tổng hợp độc tố khi ủ canh trường ở nhiệt độ 370

C cũng nhiều hơn khi ủ ở 280

C [15]

Nh- vậy quá trình dịch mã và biểu hiện của gen độc tố và gen mã hoá

vỏ capsule trong vi khuẩn B Anthracis được điều khiển bởi ba nhân tố điều hoà là acpA, atxA và pagR Đồng thời 2 yếu tố CO2/ bicacbonat và nhiệt độ cũng chi phối sự biểu hiện của các gen độc tố [22, 24]

III Kháng nguyên bảo vệ PA

1 Vai trò của kháng nguyên bảo vệ PA

Kháng nguyên bảo vệ PA là thành phần quan trọng trong quá trình gây

độc của vi khuẩn B anthracis Phân tử PA hoàn chỉnh có trọng lượng 83 kDa,

gồm 735 acid amin, kích thước không gian 3 chiều là 100 x 50 x 30A0

[19, 24] Đây là bước rất nguy hiểm trong quá trình gây độc của PA Các

nghiên cứu gần đây cho thấy nếu trên phân tử PA83 không chứa vị trí phân cắt này thì không có khă năng gây độc Sau đó, các mảnh PA63 sẽ liên kết với nhau để tạo thành vòng heptam có 7 nhánh Khi vòng heptam kết hợp với nhân tố LF sẽ gây chết và kết hợp với nhân tố EF sẽ gây phù nhũng cho tế bào vật chủ Vì vậy, kháng nguyên bảo vệ PA được coi là tác nhân gián tiếp gây

ra hiệu quả độc tố của nhân tố gây chết và phù thòng

Bên cạnh đó PA còn có vai trò chính trong miễn dịch bệnh than Người

ta đã nghiên cứu khả năng kích thích miễn dịch của nhiều kháng nguyên vi

khuẩn B anthracis như vá capsule, S - layer hay cá protein khác, kết quả cho

thấy chỉ có các protein hình thành độc tố than mới có khả năng kích thích

miễn dịch sinh kháng thể nhờ khả năng trung hoà độc tố than [9] Kháng thể

PA sẽ phá huỷ protein PA ở vị trí liên kết với thụ thể trên tế bào vật chủ hoặc phá huỷ vị trí phân cắt trên vùng I của PA83 Chính nhờ vai trò dẫn truyền quan trọng của PA cũng như khả năng kích thích cơ thể sản sinh kháng thể chống bệnh than nên PA đã trở thành tâm điểm chú ý của nhiều nghiên cứu

chẩn đoán, phòng ngừa bệnh than cũng như các nghiên cứu sản xuất vaccine

sử dụng nguyên liệu là protein kháng nguyên bảo vệ tái tổ hợp

Hình 1.9: Cấu trúc đơn phân kháng nguyên bảo vệ PA

Phân tử PA hoàn chỉnh gồm 735 acid anim (83 kDa) Nó có trình tự tương đồng với một họ các độc tố nhị nguyên ADP – ribosyltransferase như:

thể nhân B của Clostridium botulinum C2 (33% tương đồng), Clostridium

difficile cdt (35% tương đồng), Clostridium perfingens iota-toxin-1b (34%

tương đồng), Clostridium spiroforme Sb (33% tương đồng) và protein VIP1 của Bacillus cereus (27% đồng nhÊt) Các con sè này nhằm giải thích cấu trúc

bậc 2, 3, 4 của phân tử PA Nhưng trình tự tương đồng giữa PA và họ độc tố

nhị nguyên ADP - ribosyltransferase không bao gồm vùng IV, điều này chỉ ra

sự khác biệt giữa các thụ thể của các độc tố

Kháng nguyên bảo vệ PA được tạo thành bởi các cấu trúc đối song song

[17] Phân tử PA83 hoàn chỉnh gồm 4 phần chức năng:

Vùng 1 (1 - 249): Cấu trúc xoắn , vùng này chứa 2 ion Ca2+ và một vị trí hoạt hoá phân giải của các protease Sau khi PA được hoạt hoá bởi protease nội bào, nó sẽ giải phóng ra mảnh PA20 có chứa đầu N và mảnh PA63 Mảnh PA20 sau khi giải phóng sẽ bị phân giải trong môi trường, 7 mảnh PA63 sẽ liên kết lại với nhau tạo nên vòng heptam cã 7 nhánh (PA63)7,

cấu trúc này tan trong nước và xâm nhiễm vào trong tế bào vật chủ [22]

Vùng II (250 – 487): là một  rỗng chứa một cấu trúc nh- cái móc lớn

và linh hoạt Vùng này liên quan đến sự hình thành vòng heptam [19] Nó

chứa một vòng xoắn lớn linh hoạt (302-325) liên quan đến sự hình thành lỗ màng Ở pH thấp, heptam sẽ biến đổi và chuyển từ dạng tiền lỗ thành lỗ Ngoài ra, vùng này còn có liên quan đến sự sắp xếp lại 7 vòng xoắn của

heptam để tạo thành một lõi gồm 14 chuỗi  liên kết với màng Vòng này có

điểm cắt cho chymotrysin (Phe313

- Phe314) hai gốc này còn có liên quan tới sự vận chuyển EF và LF vào trong tế bào chất Vòng hep tam hình thành nên kênh chọn lọc trong màng nhân tạo và màng tế bào [19]

Vùng III (488 – 594): là vùng nhỏ nhất có cấu trúc  kiểu gấp nếp [22] Vùng này chứa một lõi kị nước (282- 328) gồm 101 acid amin của 5 trình tự nhắc lại nối đuôi nhau và dường như được tạo ra thông qua quá trình sao chép Vùng này bao gồm 4 tấm  bện chặt hỗn độn và 4 vòng xoắn ốc nhỏ

và 1 khe tương tự nh- ở ferredoxins và vùng A của độ tố gây hội chứng shock

độc 1 [22] Vùng này liên quan đến sự tương tác giữa các Protein với nhau

Có nghiên cứu cho rằng vùng III liên quan đến quá trình oligomerization tạo thành heptam (PA63), một nửa liên kết với thụ thể và một nửa gắn với enzym

thuỷ phân [19]

Vùng IV (595 - 735): đây là vùng liên kết với thụ thể và chứa vị trí

epitop quyết định kháng nguyên của PA [22, 24] Vùng này đã được chứng minh là có khả năng gây đáp ứng miễn dịch Nó gồm hai vùng là vòng xoắn lớn (704- 723) và vòng xoắn nhỏ (679-693), trong đó chỉ có vòng xoắn nhỏ là

có trình tự liên kết với thụ thể Ngoài ra còn có các gốc ở cuối đầu C tham gia hỗ trợ cho việc liên kết Nếu loại bá 2 phần là đầu C và vòng xoắn nhỏ sẽ

làm giảm tính độc bằng cách ức chế sự liên kết của PA với thụ thể [24]

Mảnh PA20 sau khi giải phóng sẽ bị phân giải trong môi trường, 7 mảnh PA63 sẽ liên kết lại với nhau tạo nên vòng heptam có 7 nhánh Cấu trúc (PA63)7 có khả năng liên kết với nhân tố gây chết LF hoặc nhân tố gây phù thũng EF để gây chết hoặc phù thũng cho tễ bào vật chủ

Hình 1.10 : Cấu trúc vòng heptam của kháng nguyên bảo vệ PA

Hình 1.11: Cơ chế dẫn truyền độc tố của kháng nguyên bảo vệ PA

Sự phân cắt PA83 thành PA63 và PA20 là một bước then chốt trong quá trình gây độc bởi vì sự mất đi của PA20 sẽ làm lộ ra vị trí liên kết của PA với hai nhân tố là EF và/ hoặc LF Đồng thời nó làm giảm sự cản trở của không gian lập thể và ngăn cản sự oligomer Sự phân cắt protein có thể hoàn thành trong cơ thể với nồng độ trypsin thấp Trypsin phân cắt ở Arg167 được chứng minh bởi trình tự N cuối và có một giả thuyết đưa ra rằng sự phân cắt trong cơ thể xảy ra ở gần nhau hặc cùng một vị trí Để kiểm tra giả thuyêt này,

PA được biến đổi chút Ýt với việc cắt bỏ từ vị trí 163 đến 168, phân tử này không bị phân cắt bởi Trypsin hoặc protease trong cơ thể và hoàn toàn không gây độc tế bào khi tiếp xúc với lf vị trí này trong PA bao gồm bốn phần cơ bản: Arg164

- Lys165 - Lys166 - Arg167 Đây là bằng chứng thể hiện endoprotease furin phân cắt cùng một vị trí của Arg - X - Lys/ Arg - Arg, giả thuyết đưa ra rằng furin có khả năng phân cắt PA Trong thực tế việc phân cắt

PA của furin được quan sát trong ống nghiệm và chất ức chế furin ngăn chặn

sự phân cắt của liên kết thụ thể với kháng nguyên bảo vệ PA trên bề mặt tế bào

Đầu tiên các protease fusin sẽ hoạt hoá các protein thuỷ phân trên bề mặt tế bào của vùng I của PA83 và giải phóng ra mảnh PA20 (20kDa) ở đầu

N [6] Mảnh PA20 (1-157) không có vai trò quan trọng trong sự gây độc và bị

phân giải trong môi trường Phần chính của vùng I (168-258) hình thành trên đầu N của mảnh PA63 hoạt động và bộc lộ vị trí liên kết trên PA63 với nhân

tố gây chết và hoặc nhân tố gây phù thũng Sau đó, các mảnh PA63 liên kết lại với nhau tạo thành vòng heptam có 7 nhánh Cấu tróc heptam này hoà tan trong nước ở pH trung tính hoặc kiềm, vì thế có thể cài lên màng tế bào có pH acid hình thành nên các kênh cation chọn lọc trong màng kép lipid nhân tạo

và màng tế bào Do vòng heptam này tan trong nước nên nó hình thành một vòng lõm có đường kính 160 A0

, cao 85 A0 [22] Mỗi phân tử PA63 có khả

năng liên kết với một phân tử EF hoặc LF Phức hợp (PA 63)7- LF và/hoặc EF xâm nhập vào đại thực bào thông qua cơ chÕ thẩm bào trung gian thụ thể

(receptor- mediated endocytosis) Phức hợp này được chuyển vào trong mét

nang có tính acid để duy trì hoạt tính và ức chế sự acid hoá của endosome, cùng với bề mặt có tính acid của kênh truyền dẫn, cho phép nhân tố EF và LF

đi vào bên trong tế bào chất để sinh sản độc tố gây phù thũng và độc tố gây chết [19, 22]

Nhiều thí nghiệm với furin không loại trừ khả năng rằng các protease khác cũng hoạt động trên bề mặt tế bào để hoạt hóa PA Sự thiếu hụt tế bào CHO của furin gây ra vởi sự phát sinh nhung đột biến hóa học, và ảnh hưởng đến sự liên kết của PA và ngoại độc tố LF Một nhân tố của họ furin protease khác cũng thể hiện khả năng phân cắt PA, nã bao gồm: PCI và PACE4

IV Gen mã hoá kháng nguyên bảo vệ PA

Kháng nguyên bảo vệ PA được mã hoá bởi gen cấu trúc pagA nằm trên

plasmid pXO1 Kháng nguyên bảo vệ PA bản thân nó không có độc nhưng nó

được coi là một thành phần quan trọng của vi khuẩn B.anthracis trong quá

trình gây bệnh vì nó là nhân tố dẫn truyền trung có khả năng liên kết với EF hoặc LF để gây độc Đặc biệt, trên bề mặt PA có vị trí liên kết với kháng nguyên, do đó mà có khả năng gây đáp ứng miễn dịch Hiện nay việc nghiên

cứu để tạo protein tái tổ hợp trong việc chẩn đoán, phòng ngừa bệnh than còng nh- việc chế tạo vaccine tái tổ hợp là xu hướng có triển vọng Chính vì vậy, việc nghiên cứu tách dòng và biểu hiện gen mã hoá kháng nguyên bảo vệ

PA là rất cần thiết

Trên cơ sở các nghiên cứu về đặc tính di truyền cũng nh- đặc điểm PA người ta có thể ứng dụng để sản xuất protein tái tổ hợp PA sử dụng trong tạo vaccine tái tổ hợp phòng bệnh than Đồng thời cũng có thể hiểu rõ hơn vai trò của những vùng chức năng khác nhau của PA trong quá trình gắn lên màng tế bào đích để đưa các nhân tố gây độc LF và EF vào bên trong tế bào chất gây

ra hiệu quả độc tố [26]

Gen mã hoá cho kháng nguyên bảo vệ PA là gen pagA nằm trên plasmid pXO1 Theo tài liệu nghiên cứu trên thế giới, gen pagA có khung đọc

mở (ORF) dài 2319 codon, trong đó đoạn có kích thước 2205bp mã hoá cho

735 acid amin của PA hoàn chỉnh PA83 Trước vùng mã hoá protein này có

29 codon mã hoá chuỗi peptide tín hiệu có đặc tính tương tự ở những protein

khác do B anthracis tiết ra Chúng đều tích điện âm, có đầu cuối N gồm 5

acid amin (Met - Lys - Lys - Arg - Lys), vùng kỵ nước trung tâm (6 - 21), gốc alanine [26]

Thành phần base của gen pagA có tỷ lệ A + T cao, chiếm 69%, trong

đó, A = 39%, T= 30%, G = 17%, C = 14% Thành phần base này khác với những gen mã hoá protein ở những vi khuẩn khác Gen cấu trúc của protein hoàn chỉnh PA83 bắt đầu từ vị trí nt 1891, đứng trước vị trí này là 2 codon mở đầu ATG (mã hoá cho acid amin methionin) nằm ở vị trí nt 1834 và 1804 Gen mã hoá PA83 không có codon mã hoá cystein [26]

Khi nghiên cứu 26 chủng B anthracis khác nhau thì thấy xuất hiện 5

đột biến điểm, trong đó có 2 đột biến làm biến đổi aa và 3 đột biến cùng nghĩa Theo lý thuyết, tỷ lệ đột biến làm biến đổi acid amin so với đột biến cùng nghĩa là 1: 5 Tuy nhiên ở đây tỷ lệ này lớn hơn Những đột biến làm

biến đổi acid amin nằm ở vùng có tính kháng nguyên cao, nằm ngang phần giao nhau của vùng III và IV ảnh hưởng tới vùng liên kết với LF [21]

V Biểu hiện gen pagA

1 Hệ thống biểu hiện

1.1 Vector biểu hiện

Vector biểu hiện gen (expression vector) là những vector tách dòng mang các promoter mạnh, cho phép biểu hiện đồng thời cả gen chỉ thị và gen tách dòng tạo nên các protein lai [4]

Hình 1.12: Vector biểu hiện

Vector biểu hiện mạnh là các vector có các đặc điểm:

 Có khả năng tạo số lượng lớn bản sao trong tế bào chủ

 Promoter hoạt động mạnh

 Dịch mã tạo nhiều protein lai

 Đoạn trình tự MCS (Multiple cloning site) có nhiều vị trí cắt đặc hiệu của nhiều loại enzym giới hạn

 Vector vẫn giữ được hoạt tính khi cài gắn gen tách dòng

có kích thước lớn

 Hoạt động của vector không ảnh hưởng hoặc gây ức chế tế bào chủ

 Gen chỉ thị dễ dàng nhận biết

Để có thể thu nhận protein tái tổ hợp thì gen mã hoá cho protein phải đựơc gắn vào vectơ biểu hiện Có rất nhiều hệ vectơ biểu hiện tương ứng với nhiều loại tế bào biểu hiện khác nhau Dựa trên những đặc điểm của vector

biểu hiện đã nêu trên, đÓ biểu hiện gen pagA mã hoá kháng nguyên bảo vệ

PA chóng tôi sử dông vectơ pET-TRX (pET-TRX Fusion Expression Vector System) làm vectơ biểu hiện

Vectơ pET-TRX có kích thước khoảng 5800bp, được thiết kế dựa trên cơ

sở của vectơ pET-28a(+) nhưng được gắn thêm đoạn gen mã hoá cho protein Thioredoxin với mục đích làm tăng tính hoà tan của protein tái tổ hợp, có vị trí gắn của T7 promoter, vùng Lac Operator là vị trí nhận biết và gắn các protein điều hoà giúp cho quá trình điều hoà hoạt động của gen, vùng cắt gắn đa vị chứa vị trí cắt của các enzym giới hạn Một đuôi gồm 6 Histidine có vai trò trong việc tinh sạch protein tái tổ hợp, vị trí T7 terminator kết thúc quá trình dịch mã Vùng nhận biết gồm gen kháng kháng sinh là kanamycin giúp cho việc chọn lọc chính xác dòng plasmid tái tổ hợp

Hình 1.13: Sơ đồ cấu trúc và vị trí cắt giới hạn của vectơ pET-28a(+)

1.2 Lựa chọn chủng biểu hiện

Có rất nhiều hệ thống biểu hiện khác nhau nh- biểu hiện gen bằng hệ

biểu hiện nấm men, B subtilis, Baculovirus, E coli hay biểu hiện trong tế bào

động vật bậc cao…

Khi sử dụng hệ biểu hiện nấm men các protein tái tổ hợp thường được tiết ra ngoài môi trường rất hiệu quả, có độ tinh sạch cao và đảm bảo hoạt tính sinh học của chúng Nhưng ở nấm men có hiện tượng glycosyl hoá làm ảnh hưởng tới một số hoạt tính của protein Nấm men biểu hiện tốt và tiết ra tốt các sản phẩm của gen có nguồn gốc từ động vật, thực vật bậc cao, nấm nhưng

không tiết ra tốt các sản phẩm của gen có nguồn gốc từ vi khuẩn ra ngoài môi trường

Khác với hệ biểu hiện nấm men, sử dụng hệ thống biểu hiện E coli sẽ tránh được hiện tượng glycosyl hoá Biểu hiện E coli hệ thống biểu hiện E coli có

rất nhiều ưu điểm hơn hẳn các hệ thống biểu hiện khác nh- [4]:

- Vi khuẩn E coli có tốc độ sinh trưởng nhanh, khả năng biểu hiện

protein tái tổ hợp mạnh, chỉ sau 8 giờ nuôi cấy ở điều kiện thích hợp đã có sản phẩm protein tái tổ hợp Khả năng tạo sản phẩm gen cao từ 50 mg/l đến 500 mg/l

- Biểu hiện gen trong tế bào E coli có thể giảm được các chi phí cho

công nghệ và hoá chất, nên giá thành sản phẩm hạ

- Cấu tróc bộ gen E coli và các đặc điểm di truyền đã được biết tương

đối đầy đủ

- Có rất nhiều chủng vi khuẩn E coli được sử dụng trong biểu hiện gen trong đó chủng E coli BL21 là một trong những chủng E coli được ưa

chuộng và sử dụng rộng rãi để biểu hiện nhiều loại gen khác nhau

Tuy nhiên sử dụng vi khuẩn E coli làm tế bào chủ trong biểu hiện gen

có một số hạn chế sau:

- Các gen mã hoá các loại protein có kích thước lớn hơn 50 kD, protein giàu cystein (ví dô nh- gen mã hoá plasminogen) hoặc những sản phẩm protein có sự hình thành nhiều liên kết disunfua (S - S) rất khó khi biểu hiện

gen trong tế bào E coli

- Tế bào E coli có thể cho biểu hiện tốt các loại protein không biến đổi

cấu trúc phân tử sau dịch mã và không có quá trình glycosyl hoá

- Một số chủng vi khuẩn E coli có thể gây bệnh hoặc tạo các độc tố khi

biểu hiện gen của sinh vật bậc cao

- Mặt khác, khả năng tạo và tiết protein ngoại bào của các chủng vi

khuẩn E coli tương đối thấp

2 Phương pháp biểu hiện

Để biểu hiện gen pagA, đầu tiên người ta phải tách dòng gen pagA và

đem cài gen đã được tách dòng này vào một vector biểu hiện Để cho các gen tách dòng được biểu hiện mạnh mẽ, phải lựa chọn các tế bào vật chủ phù hợp các tiêu chuẩn sau [4]:

- Phải biết rõ đặc điểm di truyền và cấu trúc bộ gen của vật chủ, không nên chọn những tÕ bào vật chủ có khả năng gây bệnh

- Có khả năng tạo một số lượng lớn sản phẩm của gen tách dòng, giá thành thấp, dễ sử dụng

Trong thực nghiệm tách dòng gen, người ta thường chọn hai loại tế bào vật

chủ là vi khuẩn E coli và nấm men Đây là hai đối tượng có khả năng biểu

hiện gen mạnh nhất

Quá trình biểu hiện gen bao gồm một số bước chung như sau:

 Bước 1: Lựa chọn hệ biÓu hiện thích hợp để biệu hiện gen

 Bước 2: Dựa vào trình tự gien, thiết kế các đoạn mồi để nhân gen Tổng hợp đoạn mồi

 Bước 3: Chuẩn bị DNA khuôn để nhân gien

 Bước 4: Nhân gien bằng PCR từ DNA hệ gien của vi khuẩn hoặc từ ngân hàng AND nhưng tốt nhất là nhân gien trực tiếp từ chính plasmid mang gen đã từng dùng để đọc trình tự gen đó

 Bước 5: Đưa gen vào vecto tách dòng và biến nạp vào tế bào E coli

DH5α để khuyếch đại dòng gen

 Bước 6: Tách plamid từ các thể biến nạp E.coli D5α KiÓm tra gen

trong vector tách dòng bằng enzym hạn chế

 Bước 7: Đưa gen vào vector biểu hiện và biến nạp vào tế bào E coli

DH5α

 Bước 8: Tách plasmid từ các thể biến nạp trong E coli và kiểm tra gen

và đặc biệt là chiều của gen trong vector biểu hiện Gen cần biểu hiện phải nằm đúng chiều của promoter

 Bước 9: Biến nạp vector biểu hiện có mang gen vào tế bào chủ E coli

và tiến hành biểu hiện

Sau khi tiến hành biểu hiện thành công, tiến hành điện di kiểm tra trên gel polyacrylamid và tinh sạch protein

CHƯƠNG II

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

1 Vật liệu

1.1 Sinh phẩm

Vector tái tổ hợp pCR2.1-pagA nhận từ phòng Di truyền Vi sinh vật, Viện

Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Plasmid mang vector biểu hiện pET - TRX - FUS nhận từ phòng Vi sinh Phân

tử, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Cét Probond Nikel Resin mua từ hãng Invitrogen

1.2 Hoá chất và môi trường

1.2.1 Hoá chất, dung dịch

Các hoá chất dùng cho nghiên cứu sinh học phân tử được mua từ các

hãng Sigma, Merk, Invitrogen, Bio- Rad, bao gồm: dNTP, Taq polymerase,

agarose 1%, polyacrylamide, marker, ethidium bromide, protease, RNAse, axid acetic, kháng sinh Kanamycin, IPTG, enzym, Chloroform…

Các hoá chất dùng cho nghiên cứu vi sinh vật bao gồm: cao nấm men, cao thịt, trypton, agar, glucose, NaCl…

 Dung dịch đệm SDS – PAGE 10X

Tris base 15,14 g Glycine 72,1 g SDS 20% 25 ml

 Dung dịch nhuộm Coomasive Brilliant Blue 0,25%

Coomasive Brilliant Blue 0,25 g Dung dịch tẩy màu 100 ml

 Dung dịch Acrylamide – bisacrylamide 30%

Acrylamide 29 g Bisacrylamide 1 g

H2O khử ion 100 ml

 Guanidinium Lysis Buffer

Gu.HCl 6M

NaH2PO4 200mM NaHPO4 200mM NaCl 500mM Nước

pH= 7,8

 Denaturing Binding Buffer

Ure 8M

NaCl 500mM