Phương pháp biểu hiện gen

V. Biểu hiện gen pagA mã hoá kháng nguyên bảo vệ PA

4. Phương pháp nghiên cứu

2.11 Phương pháp biểu hiện gen

 Cấy hoạt hoá 1 khuẩn lạc trong môi trường LB có bổ sung

kanamycin (25 mg/ ml) với nồng độ cuối là 50 g/ ml, nuôi lắc ở

370C qua đêm.

 Cấy chuyển 1% vào 20 ml môi trường MPB có bổ sung kháng sinh

kanamycin nồng độ là 50 g/ ml và nuôi lắc ở 370C để OD đạt 0,5-

0,8 (Khoảng 2-3h).

 Hót 10 ml làm đối chứng trước cảm ứng và tiếp tục nuôi lắc ở 370

C trong 4h để thu mẫu không cảm ứng.

 Phần còn lại, cảm ứng IPTG (100 mM) đạt 1mM, nuôi ở 370

C trong 4h.

 Thu mẫu sau cảm ứng, ly tâm thu tế bào 6000 v/p trong 10 phót.

 Rửa tế bào bằng nước khử ion 200 l, ly tâm 6000 v/p trong 5 phót,

thu tế bào.

 Bổ sung 200 l nước khử ion, làm tan tế bào.

 Lấy 30 l dịch trên bổ sung thêm 5 l treatment buffer 6X.

 Xử lý mẫu ở 950

C trong 10 phót.

 Điện di trên gel polyacrylamide 12,6%.

 Nhuộm bản gel bằng Comassie Brilliant trong 30 phót trên máy lắc.

 Tẩy màu và quan sát trực tiếp.

2.12. Khảo sát điều kiện biểu hiện thích hợp cho quá trình biểu hiện

a, Khảo sát điều kiện nhiệt độ thời gian và thích hợp cho quá trình biểu hiện

Quá trình biểu hiện được thực hiện ở các nhiêt độ khác nhau (250C,

280C, 300C, 370C) với nồng độ cảm ứng IPTG (100mM) 1mM ở 370

C trong 5h và lấy mẫu theo thời gian (0, 1, 2, 3, 4, 5h) để xác định nhiệt

độ và thời gian thích hợp cho quá trình biểu hiện gen pagA

b, Khảo sát nồng độ IPTG thích hợp cho quá trình biểu hiện

Cố định nhiệt độ và thời gian thích hợp cho quá trình biểu hiện gen

pagA, tiến hành biểu hiện lại ở những nồng độ IPTG khác nhau, cụ thể

là: 0,1 mM; 0,2 mM; 0,5 mM; 0,7 mM; 1; 2 mM.

Thu mẫu và điện di kiểm tra trên gel polyacrylamid 12,6%.

2.13. Xác định khả năng hoà tan của protein

 Mẫu sau khi biểu hiện được ly tâm 6000 v/p trong 10 phót, thu tủa.

 Rủa tế bào và ly tâm ở 6000 v/p trong 10 phót.

 Bổ sung 100 ml dung dịch C.

 Ủ ở 370

C trong 30 – 60 phót.

 Siêu âm.

 Ly tâm, thu dịch pha trên (phần tan).

 Phần cặn bổ sung 100 μl nước khử ion, vortex.

 Hót 30 μl, bổ sung 5 μl Treatment buffer 6X

 Điện di kiểm tra khả năng hòa tan của protein trên gel

polyacrylamide 12,6%.

2.14. Tinh chế protein dung hợp bằng cột Probond Nikel Resin

Protein tái tổ hợp được biểu hiện ở dạng inclusion bodies. Sử dụng

phương pháp tinh sạch bằng Kit ProBond TM

của hãng invitrogen có thể chuyển protein từ dạng không hoà tan thành dạng hoà tan, điều này hết sức

quan trọng cho mục đích tạo ra các protein tái tổ hợp để phát triển các Kit chuẩn đoán. Quá trình tinh sạch được thực hiện theo các bước sau:

Bước 1: Chuẩn bị dịch tế bào trước khi đưa lên cột

 Làm tan hoàn toàn Guanidinium Lysis Buffer

 Ly tâm huyền dịch tế bào (100 ml) đã kiểm tra khả năng biểu hiện,

thu cặn tế bào.

 Hoà lại tế bào trong 8 ml Guanidinium Lysis Buffer, pH= 7,8.

 Làm tan cặn tế bào bằng cách lắc nhẹ trên máy vortex ở nhiệt độ phòng trong thời gian 5 phót.

 Phá màng tế bào bằng máy siêu âm trong thời gian 15 phót – 20 phút, để huyền dịch tế bào trên đá, phá tế bào bằng máy Labsonic

 Ly tâm dịch phá tế bào ở tốc độ 1000 vòng trong thời gian 15 phót,

thu dịch nổi, loại xác tế bào.

Bước 2: Chuẩn bị cột

 Lắc đều để proBond TM Resin tạo thành huyền dịch đồng nhất

 Dùng pipet hót 2ml huyền dịch Nikel Resin đưa lên cột tinh sạch dung tích 10ml

 Rửa cột bằng 6 ml nước khủ ion

 Bổ sung 6 ml Denaturing Binding Buffer

 Hoà lại Resin bằng cách đảo cột bằng tay, sau đó để cột lại theo phương thẳng đứng để Resin lắng xuống. Bổ sung 6 ml Denaturing Binding Buffer

 Hoà lại Resin bằng cách đảo cột bằng tay, sau đó để cột lại theo phương thẳng đứng để Resin lắng xuống và cho dịch chảy qua cột và cho dịch chảy qua cột

Bước 3 Đưa protein lên cột và đẩy ra khỏi cột

 Lắc nhẹ cột trên máy vortex trong thời gian 15 phót - 30 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó để cột lại theo phuong thẳng đứng để huyền dịch Nikel Resin lắng xuống và cho dịch chảy qua cột.

 Rửa cột bằng 4ml Denaturing Binding Buffer, pH= 7,8, lặp lại 3 lần.

 Rửa cột bằng 4ml Denaturing Wash Buffer, lặp lại 3 lần

 Rửa cột bằng 8 ml Native Wash Buffer

 Đẩy protein tái tổ hợp ra khổi cột bằng 8 ml Native Elusion Buffer,

thu 12 phân đoạn, mỗi phân đoạn 1ml

 Kiểm tra protein sau tinh sạch bằng điện di trên gel polyacrylamide

12,6%.

CHƯƠNG III

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Hình 3.1 Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện

Sau khi nhận được plasmid tái tổ hợp (vector pCR2.1 có gắn đoạn gen

pagA) từ phòng Di truyền Vi sinh, Viện Công nghệ Sinh học, và plasmid

chứa vectơ biểu hiện pET-TRX-FUS từ phòng Vi sinh phân tử, Viện Công

nghệ Sinh học, tiến hành biến nạp vào tế bào khả biến chủng E. coli DH5α

để thu lượng lớn plasmid. Các plasmid thu được đem xử lý enzym giới hạn

BamHI và XhoI kiểm tra vị trí cắt của các enzym này trong đoạn gen và

vectơ. Kết quả điện di trên gel agarose 1% thể hiện ở hình 3.2:

pCR2.1pagA 6,1kb pET-TRX- FUS 5,8kb BamHI XhoI pagA (2,2kb) BamHI XhoI pET-TRX-FUS pagA 7,6kb pagA (2,2kb)

A B

Hình 3.2: Điện di plasmid trước và sau khi cắt bằng BamHI

và XhoI trên gel agarose 1% Hình A:

Giếng 1: Thang DNA chuẩn (Fermentas) Giếng 2: pET-TRX-FUS

Giếng 3: pCR2.1-pagA

Hình B:

Giếng 1: Thang DNA chuẩn (Fermentas) Giếng 2: pCR2.1-pagA

Giếng 3: pET-TRX-FUS

Hình 3.2 cho thấy thấy ở giếng 2 xuất hiện 2 băng, băng dưới có kích

thước khoảng 2,2 kb tương ứng với kích thước của đoạn gen pagA, băng ở

trên có kích thước khoảng 3,9 kb tương ứng với kích thước của vector pCR2.1. Còn ở giếng 3 xuất hiện một băng cao hơn có kích thước khoảng 6 kb tương ứng với kích thước của vectơ pET-TRX-FUS. Như vậy có thể

thấy đoạn gen pagA và vectơ đã được tạo đầu dính bằng BamHI và XhoI.

Do đó, vectơ tái tổ hợp mang gen pagA và vectơ biểu hiện pET-TRX-FUS

tiếp tục được xử lý lượng lớn bằng 2 enzym này.

1.1. Thôi gel

Đoạn gen pagA (2,2kb) và vectơ biểu hiện pET-TRX-FUS đã được xử lý

với 2 enzym BamH1 và Xho1 được điện di trên gel agarose 1% và thu lại

bằng cách cắt gel. Sản phẩm cắt được tinh sạch qua cột của hãng Invitrogen. Kết quả thể hiện ở hình sau:

Hình 3.3: Điện di sau khi thôi gel trên gel agarose1%

Giếng 1: Gen pagA thu được sau khi được xử lý bằng BamHI và XhoI

Giếng 2: Vector pET-TRX-FUS thu được sau khi được xử lý bằng BamHI và XhoI

Giếng 3: Thang DNA chuẩn (Fermentas)

1.2. Gắn đoạn gen pagA vào vectơ biểu hiện pET-TRX-FUS

Phản ứng gắn đoạn gen pagA vào vectơ pET-TRX-FUS đã được xử lý bằng

enzym BamHI và XhoI được thực hiện nhờ T4 ligase như sau:

 Buffer T4 1 l

 T4 ligase (Fermentas) 1 l

 pagA 4 l

 Vector PET-TRX-FUS 4 l

 Để ở 370C qua đêm.

Dưới tác dụng của enzym nối đoạn gen pagA dễ dàng gắn vào vector pET-

2. Tạo chủng E. coli BL21 tái tổ hợp mang gen pagA

2.1. Biến nạp sản phẩm lai vào tế bào khả biến E. coli DH5α

Sản phẩm lai được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli chủng DH5 nhờ

sốc nhiệt ở 420C trong 60 giây và nuôi trong môi trường LB ở nhiệt độ 370

C. Nhờ bộ máy tổng hợp của vi khuẩn, plasmid tái tổ hợp được tạo ra với số lượng lớn các bản sao. Tiến hành cấy trải dịch nuôi trên môi trường MPA có chứa kháng sinh kanamycin (25mg/ml) với nồng độ cuối là 50μg/ml. Sau khi

nuôi qua đêm ở 370

C trên đĩa petri xuất hiện khuẩn lạc màu trắng, thể hiện ở hình sau:

Hình 3.4: Khuẩn lạc của vi khuẩn E. coli chủng DH5

2.2. Tách chiết DNA plasmid từ các khuẩn lạc E. coli DH5

Lựa chọn các khuẩn lạc mọc trên đĩa petri, tiến hành tách chiết DNA plasmid và điện di. Kết quả thể hiện ở hình :

Hình 3.5: Điện di plasmid thu được từ các khuẩn lạc

E. coli DH5α trên gel agarose 1%

Giếng 2,6: dòng khuẩn lạc có khả năng mang gen pagA

Giếng 1,3,4,5,7,8: dòng khuẩn lạc không mang gen pagA

Theo lý thuyết điện di, DNA kích thước lớn hơn sẽ chạy chậm hơn nghĩa là ảnh quan sát được là vạch sáng cao hơn và ngược lại. Do đó, có thể dự đoán DNA plasmid của dòng khuẩn lạc số 2 và 6 đã mang gen pagA. Tuy nhiên, để có kết luận chính xác cần nghiên cứu tiếp.

2.3. Kiểm tra sự có mặt của gen pagA

a. Phương pháp cắt giới hạn BamHI và XhoI

Plasmid tái tổ hợp của hai dòng khuẩn lạc 2 và 6 được kiểm tra bằng phương pháp cắt bằng enzym giới hạn. Chúng tôi sử dụng enzym cắt là

BamH1 và XhoI. Kết quả điện di sản phẩm cắt trên gel agrose thể hiện ở hình

Hình 3.6: Điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp trên gel agarose 1%

Giếng 1, 2: Sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp Giếng 3: Vector pET- TRX - FUS

Giếng 4: Thang DNA chuẩn (Fermentas)

Kết quả trên hình cho thấy, mỗi giếng xuất hiện hai băng, băng ở trên có

kích thước tương tự kích thước của vector pET-TRX-FUS (5,8 kb), băng ở

dưới có kích thước khoảng 2,2 kb tương tự kích thước của đoạn gen pagA.

Do đó sản phẩm cắt DNA plasmid của dòng khuẩn lạc này tạo ra 2 băng là hoàn toàn phù hợp lý thuyết.

b. Phương pháp PCR

Sau khi tách chiết DNA plasmid của chủng biểu hiện BL21, tiến hành

được thực hiện sử dụng cặp mồi BA1 và BA2, có sự tham gia của emzyme

Taq polymerase và dNTPs với chu trình nhiệt thích hợp đã được thiết kế.

Sản phẩm PCR của gen pagA được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose

1%, thể hiện ở hình sau:

Hình 3.7: Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1%

Giếng 1: DNA plasmid pCR2.1-pagA

Giếng 2,3: DNA plasmid từ dòng 2 và 6 Giếng 4: Thang DNA chuẩn (Fermentas)

Kết quả ở trên hình chỉ cho một băng duy nhất có kích thước ~ 2,2 kb. Băng sản phẩm này tương tự băng sản phẩm thu được từ DNA plasmid tái tổ

hợp pCR2.1 pagA.

2.4. Kiểm tra khung đọc của gen pagA trong vectơ biểu hiện pET-TRX-FUS

Dữ liệu về trình tự của dòng plasmid tái tổ hợp thu được được sử dụng để dịch mã ra axit amin trên lý thuyết nhằm kiểm tra khung đọc của gen xử dụng công cụ EXPASY. Kết quả cho thấy trình tự gen pagA đã được dịch mã thông, bao gồm 735 axit amin:

10 20 30 40 50 60

EVKQENRLLN ESESSSQGLL GYYFSDLNFQ APMVVTSSTT GDLSIPSSEL ENIPSENQYF

70 80 90 100 110 120

QSAIWSGFIK VKKSDEYTFA TSADNHVTMW VDDQEVINKA SNSNKIRLEK GRLYQIKIQY

130 140 150 160 170 180

QREDPTEKGL DFKLYWTDSQ NKKEVISSDN LQLPELKQKS SNSKKRRSTS AGPTVPDRDN

190 200 210 220 230 240

DGIPDSLEVE GYTVDVKNKR TFLSPWISNI HEKKGLTKYK SSPEKWSTAS DPYSDFEKVT

250 260 270 280 290 300

GRIDKNVSPE ARHPLVAAYP IVHVDMENII LSKNEDQSTQ NTDSQTRTIS KNTSTSRTHT

310 320 330 340 350 360

SEVHGNAEVH ASFFDIGGSV SAGFSNSNSS TVAIDHSLSL AGERTWAETM GLNTADTARL

370 380 390 400 410 420

NANIRYVNTG TAPIYNVLPT TSLVLGKNQT LATIKAKENQ LSQILAPNNY YPSKNLAPIA

430 440 450 460 470 480

LNAQDDFSST PITMNYNQFL ELEKTKQLRL DTDQVYGNIA TYNFENGRVR VDTGSNWSEV

490 500 510 520 530 540

LPQIQETTAR IIFNGKDLNL VERRIAAVNP SDPLETTKPD MTLKEALKIA FGFNEPNGNL

550 560 570 580 590 600

QYQGKDITEF DFNFDQQTSQ NIKNQLAELN ATNIYTVLDK IKLNAKMNIL IRDKRFHYDR

610 620 630 640 650 660

NNIAVGADES VVKEAHREVI NSSTEGLLLN IDKDIRKILS GYIVEIEDTE GLKEVINDRY

670 680 690 700 710 720

DMLNISSLQQ DGKTFIDFKK YNDKLPLYIS NPNYKVNVYA VTKENTIINP SENGDTSTNG

730

IKRILIFSKK GYEIG

Hình 3.8: Trình tự axit amin của protein kháng nguyên bảo vệ trên lý thuyết

2.5. Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào biểu hiện E. coli

BL21

Sau khi thu được vectơ biểu hienẹ tái tổ hợp mang gen pagA với khung

đọc chuẩn, tiến hành biến nạp vào E. coli BL21 bằng phương pháp sốc

nhiệt. Dịch nuôi lắc 370C (1h) được cấy trải trên môi trường LBA có chứa

knamycin. Sau khi ủ qua đêm ở 370, trên đĩa petri xuÊt hiện các khuẩn lạc

như hình 3.9:

Hình 3.9: Khuẩn lạc của vi khuẩn E. coli chủng BL21

Sau đó, tiếp tục tách chiết plasmid của chủng BL21 để điện di kiểm tra trên gel agrose 1%, kết quả thể hiện ở hình :

Hình 3.10: Điện di plasmid sau khi tinh sạch trên gel agarose 1%

Nh- vậy, đã tạo được chủng E. coli BL21 mang vectơ tái tổ hợp pET-TRX-

FUS mang gen pagA.

3. Biểu hiện gen pagA trong hệ biểu hiện E. coli BL21

3.1. Tìm điều kiện biểu hiện protein

Trước tiên chúng tôi tiến hành biểu hiện lượng nhỏ để kiểm tra xem quá trình biểu hiện protein pagA của vi khuẩn B. anthracis có thành công hay không. Bốn khuẩn lạc bất kì được chọn và nuôi hoạt hóa qua đêm trong môi trường LB lỏng có bổ sung kanamycin với nồng độ cuối là 50μg/ml ở 200 vòng/phút

ở 370C. Sau đó, dịch nuôi được cấy chuyển 1% sang môi trường có bổ sung

kanamycin và nuôi tiếp để OD đạt 0,5-0,8 (khoảng 2-3h). Một phần mẫu được hút ra làm đối chứng, phần còn lại cảm ứng IPTG với nồng độ cuối là 1mM.

Cả 2 mẫu đối chứng và cảm ứng được nuôi ở 370C với tốc độ 200 vòng/phút

Hình 3.11: Điện di sự biểu hiện protein PA trên gel polyacrylamid 12,6%

Giếng 1, 3, 6, 8 là mẫu sau cảm ứng bằng IPTG Giếng 2, 4, 7, 9 là mẫu không cảm ứng

Giếng 5: Thang DNA chuẩn (Fermentas)

Protein tái tổ hợp Thioredoxin- pagA-HisTag được hình thành bởi sự kết

nối 3 protein với nhau: TrxTag với 127 axit amin, pagA với 735 axit amin và

đuôi His-tag với 6 axit amin, tổng cộng là 868 axit amin với trọng lượng phân tử tính theo lý thuyết khoảng 98 kDa.

Hình 3.11 cho thấy, ở các giếng có cảm ứng 1,3,6,8 xuất hiện một băng protein lạ có kích thước khoảng gần 100kDa như tính toán lý thuyết. Như vậy có thể sơ bộ kết luận rằng quá trình biểu hiện đã thành công dưới sự kiểm soát của promotor T7. Ngoài ra, dòng được cảm ứng ở giếng số 3 cho kết quả biểu hiện tốt nhất. Do đó, lựa chọn dòng này cho những nghiên cứu tiếp theo.

Để xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp protein tái tổ

hợp PA, tế bào E. coli BL21 được cấy lắc ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau

là: 250C, 280C, 300C, 370C. Sau 4 giê nuôi cấy, thu tế bào. Điện di mẫu trên

Hình 3.12: Điện di mẫu protein theo nhiệt độ

trên gel polyacrylamide 12,6%

Giếng 1: MÉu trước cảm ứng

Giếng 2: Thang DNA chuẩn (Fermentas)

Giếng 3, 5, 7, 9: lần lượt là mẫu cảm ứng ở 250

C, 280C, 300C, 370C

Giếng 4, 6, 8, 10: lần lượt là mẫu không cảm ứng ở 250

C, 280C, 300C, 370C

Hình 3.12 cho thấy biểu hiện ở 300C và 370C tế bào cảm ứng tổng hợp protein là tốt như nhau nhưng do 370C là nhiệt độ thích hợp cho enzym protease hoạt động sẽ thuỷ phân protein tái tổ hợp mới được tạo thành. Do đó, lùa chọn nhiệt độ biểu hiện ở 300C là tốt nhất.

Nồng độ IPTG là yếu tố quan trọng trong việc cảm ứng biểu hiện protein tái

tổ hợp PA. Do đó, sau khi lùa chọn nhiệt độ cảm ứng là 300C, tiến hành xác

định nồng độ IPTG tối thiểu cho quá trình lên men sinh tổng hợp PA. Kết quả nghiên cứu các nồng độ cảm ứng IPTG là 0,2; 0,5; 0,7; 1; 2mM đã thử nghiệm cho thấy sự tổng hợp protein PA là tối ưu khi được cảm ứng ở 1mM. Thời gian lên men cũng là yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới năng suất biểu hiện protein tái tổ hợp PA, bởi vì lượng protein được tổng hợp ở các thời