Nghiên cứu biểu hiện protein tái tổ hợp kháng nguyên bảo vệ pa từ vi khuẩn bacillus anthracis và ứng dụng trong chẩn đoán bệnh than

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Phạm Kiều Thúy NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP KHÁNG NGUYÊN BẢO VỆ PA TỪ VI KHUẨN Bacilus anthracis VÀ ỨNG DỤNG TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH THAN Chuyên ngành: Công nghệ sinh học LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Ngơ Đình Bính Hà Nội 10 - 2008 LÝ LỊCH KHOA HỌC Họ tên: Phạm Kiều Thúy Ngày sinh: 19-9-1982 Nơi sinh: Hà Nội Địa chỉ: Số 57 ngõ 134 Trương Định, Hai Bà Trưng, Hà Nội Nguyên quán: Thanh Trì, Hà Nội Quá trình học tập: 1988-1993: Học sinh cấp 1, Trường Tiểu học Trung Hiền 1993-1997: Học sinh cấp 2, Trường THCS Nguyễn Phong Sắc 1997-2000: Học sinh cấp 3, Trường THPH Thăng Long 2000-2004: Sinh viên Khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội 2004 đến nay: Nghiên cứu viên, Phòng Di truyền Vi sinh vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, Địa nơi cơng tác: 18 Hồng Quốc Việt, Hà Nội, Tel +84 756 2880 Các cơng trình cơng bố: Phạm Kiều Thúy, Phạm Minh Tuấn, Đinh Duy Kháng, Ngô Đình Bính (2008), “Biểu tinh kháng ngun bảo vệ PA”, Chun san Tạp chí Cơng nghệ Sinh học,(Đang in) Phạm Kiều Thúy, NguyễnÁnh Nguyệt, Phạm Minh Tuấn, Ngơ Đình Bính (2008), “Biểu gen mã hóa kháng nguyên bảo vệ PA từ vi khuẩn Bacillus anthracis E coli”, Kỷ yếu hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ : Hóa sinh sinh học phân tử phục vụ nông, sinh, y học công nghệ thực phẩm, NXB KHKT, Hà Nội, 765-767 Phạm Kiều Thuý, Nguyễn Thị Ánh Nguyệt, Nguyễn Đình Tuấn, Nguyễn Đặng Tơn, Nơng Văn Hải, Ngơ Đình Bính (2006), “Tách dịng đọc trình tự đoạn gen pagA mã hóa kháng nguyên bảo vệ từ chủng vi khuẩn Bacillus anthracis VCM 1167”, Tạp chí Cơng nghệ sinh học, 4: 447-454 Lê Thị Minh Thành, Nguyễn Thị Thanh Hạnh, Nguyễn Xuân Cảnh, Nguyễn ánh Nguyệt Nguyễn Đình Tuấn, Phạm Kiều Th, Ngơ Đình Bính, (2005), “Nghiên cứu phân bố đa dạng gen Bacillus thuringiensis phân lập số tỉnh thuộc vùng Đơng Bắc Bộ”, Tạp chí Di truyền Ứng dụng, 4: 2934 Ngo Dinh Binh, Nguyen Xuan Canh, Nguyen Anh Nguyet, Nguyen Dinh Tuan, Pham Kieu Thuy, Nguyen Thanh Hanh, Shin-ichiro Asano, Michio Ohba, (2007), “Characterization of Bacillus thuringiensis strains in the Vietnamese Bacillus thuringiensis Collection”, Proceedings of the 6th Pacific Rim Conference on the Biotechnology of Bacillus thuringiensis and Its Environmental Impact Edited by Jean-Charles Cote, Imre S Otvos, Jean-Louis Schwartz Science Publishing and Creative Service Agriculture and Agri-Food Canada, 26-130 Nguyễn Thị Thanh Hạnh, Lê Thị Minh Thành, Nguyễn Thị Ánh Nguyệt, Nguyễn Đình Tuấn, Phạm Kiều Thúy, Trịnh Thị Thu Hà, Ngơ Đình Bính, Dương Văn Hợp, (2007), “Nghiên cứu phân bố số đặc điểm sinh học vi khuẩn Bacillus thuringiensis phân lập vườn Quốc gia Cát Bà Báo cáo khoa học sinh thái tài nguyên sinh vật”, Hội nghị khoa học Toàn quốc lần thứ 2, Nxb Nông nghiệp, 277-283 Nguyễn Thị Ánh Nguyệt, Nguyễn Đình Tuấn, Phạm Kiều Thuý, Nguyễn Thị Thanh Hạnh, Ngơ Đình Bính (2006), “Tách dịng đọc trình tự đoạn gen pag mã hóa kháng ngun bảo vệ từ chủng vi khuẩn Bacillus anthracis VCM1167”, Kỷ yếu Hội thảo Nghiên cứu Phịng chống Vũ khí Hạt nhân, Sinh học, Hóa học (NBC), 109-118 Ngơ Đình Bính, Nguyễn Thị Ánh Nguyệt, Nguyễn Xuân Cảnh, Nguyễn Thanh Hạnh, Nguyễn Đình Tuấn, Phạm Kiều Th (2005), “Tách dịng đọc trình tự gen cry1D từ hai chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis TQ3-3 HT21-1”, Hội nghị Khoa học toàn quốc Công nghệ sinh học nghiên cứu hướng 8.2, 194-196 Ngơ Đình Bính, Nguyễn Xn Cảnh, Phạm Kiều Thuý, Nguyễn Thị Ánh Nguyệt, Nguyễn Đình Tuấn, Nguyễn Thanh Hạnh (2005), “Nghiên cứu số đặc tính sinh học vi khuẩn Bacillus cereus phân lập Việt Nam”, Kỷ yếu Hội nghị Khoa học Vệ sinh An toàn Thực phẩm lần thứ Nxb Y học 120-125 10 Ngơ Đình Bính, Nguyễn Xn Cảnh, Phạm Kiều Th, Nguyễn Ánh Nguyệt, Nguyễn Đình Tuấn, Hồng Ngọc Hiển, Lê Thu Hồng, Nguyễn Thái Sơn (2005), “Phát vi khuẩn Vibrio cholerae gây bệnh tả phương pháp miễn dịch huỳnh quang PCR”, Kỷ yếu hội nghị khoa học vệ sinh an toàn thực phẩm lần thứ Nxb Y học.126-131 11 Ngơ Đình Bính, Phạm Minh Hương, Phạm Kiều Thuý, Nguyễn Xuân Cảnh, Phạm Việt Cường, Trần Đình Mấn, Vi Thị Đoan Chính (2004), “Nghiên cứu sử dụng chủng xạ khuẩn Streptomyces longisporus 198a để chống bệnh héo xanh vi khuẩn Ralstonia solanacearum”, Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc 2004 nghiên cứu khoa học sống định hướng Nông Lâm nghiệp miền núi, Nxb Khoa học Kỹ thuật, 325-318 12 Ngo DB, Nong H, Pham KT, Nguyen DT, Dinh DK (2006), “Bacillus anthracis patial pa gene for protective antigen, ACCESSION AM404332” LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu khoa học tơi Các số liệu kết nêu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình nghiên cứu khác Hà Nội ngày 23 tháng 10 năm 2008 Tác giả Phạm Kiều Thúy LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Ngô Đình Bính - Trưởng phịng Di Truyền Vi Sinh Vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam hướng dẫn tơi q trình thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn cán phòng Di Truyền Vi Sinh Vật ln giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Đinh Duy Kháng tập thể phòng Vi sinh phân tử, PGS.TS Nơng Văn Hải tập thể phịng ADN Ứng dụng, Viện Công nghệ sinh học giúp đỡ tơi q trình thực đề tài Tơi xin gửi lời cảm ơn tới thày, cô khoa Công nghệ sinh học, thực phẩm; trung tâm Đào tạo sau đại học, Đại học Bách Khoa Hà Nội tận tình giúp đỡ tơi q trình học tập Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè giúp đỡ, động viên tơi suốt q trình học tập cơng tác Xin chân thành cảm ơn tất giúp đỡ nhiệt tình q báu đó! Hà Nội, ngày 23 tháng 10 năm 2008 Học viên Phạm Kiều Thúy MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1- TỔNG QUAN 1.1 Bệnh than dạng bệnh than 1.1.1 Bệnh than thể da 1.1.2 Bệnh than thể tiêu hóa 1.1.3 Bệnh than hơ hấp 1.1.4 Bệnh than thể màng não 1.2 Tác nhân gây bệnh than 1.2.1 Đặc điểm vi khuẩn than (Bacillus anthracis) 1.2.2 Sự hình thành bào tử 1.2.3 Sự tương tác bào tử Bacillus anthracis đại thực bào 1.3 Các độc tố vi khuẩn Bacillus anthracis 10 1.3.1 Độc tố than (Anthrax Toxin) 10 1.3.1.1 Kháng nguyên bảo vệ PA (Protective Antigen) 10 1.3.1.2 Độc tố gây phù thũng (Edema Factor-EF) 10 1.3.1.3 Độc tố gây chết (Lethal Factor-LF) 13 1.3.2 Độc tố vỏ nhày (Capsule Toxin) 14 1.4 Sự biểu độc tố 15 1.5 Kháng nguyên bảo vệ PA 18 1.5.1 Vai trò kháng nguyên bảo vệ PA 18 1.5.2 Cấu trúc đặc tính kháng nguyên bảo vệ PA 19 1.5.3 Đặc điểm gen mã hóa kháng nguyên bảo vệ PA 22 1.5.4 Quá trình dịch mã kháng nguyên bảo vệ PA từ gen cấu trúc pagA 23 1.6 Cơ chế gây bệnh 24 1.6.1 Cơ chế chung 24 1.6.2 Các giai đoạn xảy trình xâm nhiễm 25 1.6.2.1 Liên kết thụ thể 25 1.6.2.2 Q trình hoạt hóa PA protease 26 1.6.2.3 Q trình oligomer hóa 27 1.6.2.4 Q trình liên kết EF/LF 27 1.6.2.5 Quá trình thực bào trung gian thụ thể 28 1.6.2.6 Sự hình thành lỗ màng 28 1.6.2.7 Sự vận chuyển qua màng 30 1.7 Tình hình nghiên cứu biểu ứng dụng protein tái tổ hợp kháng 31 nguyên bảo vệ PA 1.8 Hệ thống biểu 33 1.8.1 Vector biểu 33 1.8.2 Lựa chọn chủng biểu 36 PHẦN 2-VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 38 2.1 Vật liệu 38 2.1.1 Sinh phẩm 38 2.1.2 Hố chất mơi trường 38 2.1.3 Dụng cụ thiết bị thí nghiệm 44 2.2 Phương pháp nghiên cứu 45 2.2.1 Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ vi khuẩn 45 2.2.2 Phương pháp tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn 46 2.2.3 Phương pháp PCR 47 2.2.4 Phương pháp gắn đoạn gen pagA vào vector 48 2.2.4.1 Phương pháp gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng pCR2.1 48 2.2.4.2 Phương pháp gắn đoạn gen pagA vào vector biểu pET-TRX-FUS 48 2.2.5 Phương pháp làm tế bào khả biến E coli 48 2.2.6 Phương pháp biến nạp vào tế bào khả biến 49 2.2.7 Phương pháp cắt enzym giới hạn 49 2.2.8 Phương pháp gel 51 2.2.9 Phương pháp điện di gel agarose 52 2.2.10 Phương pháp xác định trình tự acid nucleic 53 2.2.11 Phương pháp điện di gel polyacrylamide 53 2.2.12 Phương pháp biểu gen 54 2.2.13 Phương pháp khảo sát điều kiện biểu thích hợp cho trình biểu 54 2.2.14 Xác định khả hồ tan protein 55 2.2.15 Tinh chế protein dung hợp cột Probond Nikel Resin 55 2.2.16 Phương pháp định lượng protein 57 2.2.17 Phương pháp thu nhận kháng thể kháng PA tái tổ hợp kháng thể kháng 58 bệnh than tự nhiên 2.2.18 Phương pháp Western Blot 58 2.2.19 Phương pháp ELISA phát kháng thể kháng bệnh than 61 2.2.20 Phương pháp Dot blot phát kháng thể kháng bệnh than 61 CHƯƠNG 3-KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 63 3.1 Tách chiết DNA tổng số 63 3.2 Khuếch đại đoạn gen pagA phản ứng PCR 63 3.3 Tách dòng gen pagA 64 3.3.1 Biến nạp vector mang gen pagA vào tế bào khả biến E coli chủng DH5α 64 3.3.2 Kiểm tra tồn gen pagA vectơ tái tổ hợp 65 3.3.3 Đọc trình tự gen pagA 69 3.4 Biểu gen pagA mã hóa kháng nguyên bảo vệ PA 72 3.4.1 Thiết kế vector biểu mang gen pagA 72 3.4.2 Gắn đoạn gen pagA vào vector biểu pET-TRX-FUS 73 3.4.3 Tạo chủng E coli BL21 tái tổ hợp mang gen pagA 74 3.4.3.1 Biến nạp vector tái tổ hợp pET-TRX-FUS-pagA vào chủng trung gian E 74 coli DH5α 3.4.3.2 Kiểm tra tồn pagA plasmid tái tổ hợp 75 3.4.3.3 Kiểm tra khung đọc vector tái tổ hợp pET-TRX-FUS-pagA 77 3.4.3.4 Biến nạp plasmid tái tổ hợp pET-TRX-pagA vào BL21 (DE3) 78 Nghiên cứu biểu gen pagA E coli BL21 79 3.4.4 3.4.4.1 Nghiên cứu điều kiện biểu gen pagA 79 3.4.4.2 Xác định khả hòa tan định khu protein 83 3.5 Tinh chế protein tái tổ hợp cột sắc kí lực Niken Probond 85 3.6 Khẳng định biểu protein tái tổ hợp PA phản ứng 85 Western blot 3.7 Phát kháng thể kháng bệnh than huyết bệnh nhân 87 phản ứng Dot blot ELISA KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO 92 PHỤ LỤC M22589 CAGAAGTTAA ACAGGAGAAC CGGTTATTAA ATGAATCAGA ATCAAGTTCC CAGGGGTTAC VCM1167 C AY997299 AY700758 TG AF306778 AF306782 M22589 TAGGATACTA TTTTAGTGAT TTGAATTTTC AAGCACCCAT GGTGGTTACC TCTTCTACTA VCM1167 AY997299 AY700758 AF306778 AF306782 T M22589 CAGGGGATTT ATCTATTCCT AGTTCTGAGT TAGAAAATAT TCCATCGGAA AACCAATATT VCM1167 AY997299 AY700758 AF306778 AF306782 M22589 TTCAATCTGC TATTTGGTCA GGATTTATCA AAGTTAAGAA GAGTGATGAA TATACATTTG VCM1167 AY997299 AY700758 AF306778 AF306782 M22589 CTACTTCCGC TGATAATCAT GTAACAATGT GGGTAGATGA CCAAGAAGTG ATTAATAAAG VCM1167 AY997299 AY700758 AF306778 AF306782 M22589 CTTCTAATTC TAACAAAATC AGATTAGAAA AAGGAAGATT ATATCAAATA AAAATTCAAT VCM1167 Phạm Kiều Thúy CNSH 06-08 60 120 180 240 300 360 Luận văn cao học 78 190 200 210 220 230 240 DGIPDSLEVE GYTVDVKNKR TFLSPWISNI HEKKGLTKYK SSPEKWSTAS DPYSDFEKVT 250 260 270 280 290 300 GRIDKNVSPE ARHPLVAAYP IVHVDMENII LSKNEDQSTQ NTDSQTRTIS KNTSTSRTHT 310 320 330 340 350 360 SEVHNGAEVH ASFFDIGGSV SAGFSNSNSS TVAIDHSLSL AGERTWAETM GLNTADTARL 370 380 390 400 410 420 NANIRYVNTG TAPIYNVLPT TSLVLGKNQT LATIKAKENQ LSQILAPNNY YPSKNLAPIA 430 440 450 460 470 480 LNAQDDFSST PITMNYNQFL ELEKTKQLRL DTDQVYNGIA TYNFENGRVR VDTGSNWSEV 490 500 510 520 530 540 LPQIQETTAR IIFNGKDLNL VERRIAAVNP SDPLETTKPD MTLKEALKIA FGFNEPNNGL 550 560 570 580 590 600 QYQGKDITEF DFNFDQQTSQ NIKNQLAELN ATNIYTVLDK IKLNAKMNIL IRDKRFHYDR 610 620 630 640 650 660 NNIAVGADES VVKEAHREVI NSSTEGLLLN IDKDIRKILS GYIVEIEDTE GLKEVINDRY 670 680 690 700 710 720 DMLNISSLQQ DGKTFIDFKK YNDKLPLYIS NPNYKVNVYA VTKENTIINP SENGDTSTNG 730 IKRILIFSKK GYEIG Hình 3.15 Trình tự acid amin protein kháng nguyên bảo vệ lý thuyết 3.4.3.4 Biến nạp plasmid tái tổ hợp pET-TRX-pagA vào E coli BL21 (DE3) Sau thu vector biểu tái tổ hợp mang gen pagA với khung đọc chuẩn, tiến hành biến nạp vào E coli BL21 phương pháp sốc nhiệt Dịch nuôi lắc 37oC (1 giờ) cấy trải mơi trường LBA có chứa knamycin Sau ủ qua đêm 37oC, đĩa petri xuất khuẩn lạc hình 3.16: Phạm Kiều Thúy CNSH 06-08 Luận văn thạc sĩ 79 Hình 3.16 Khuẩn lạc vi khuẩn E coli chủng BL21 môi trường LBA Như vậy, tạo chủng E coli BL21 mang vector tái tổ hợp pET-TRXFUS mang gen pagA 3.4.4 Nghiên cứu biểu gen pagA E coli BL21 3.4.4.1 Nghiên cứu điều kiện biểu gen pagA Tiến hành lựa chọn bốn khuẩn lạc ni hoạt hóa qua đêm mơi trường LB lỏng có bổ sung kanamycin 37oC Sau đó, dịch nuôi cấy chuyển % nuôi tiếp để OD đạt 0,5-0,8 (khoảng 2-3 giờ) Một phần mẫu hút làm đối chứng, phần lại cảm ứng IPTG với nồng độ cuối mM Cả mẫu đối chứng cảm ứng nuôi 37oC với tốc độ 200 vòng/phút Thu mẫu điện di gel 12,6 % polyacrylamid (Hình 3.17): Phạm Kiều Thúy CNSH 06-08 Luận văn thạc sĩ 80 kDa 10 116 66 45 35 25 18,4 Hình 3.17 Điện di biểu protein PA gel 12,6 % polyacrylamide Giếng 1, 3, 6, : Mẫu sau cảm ứng IPTG Giếng 2, 4, 7, 9: Mẫu không cảm ứng Giếng 5: Thang DNA chuẩn (Fermentas) Protein tái tổ hợp Thioredoxin-pagA-Histag hình thành kết nối protein với nhau: TrxTag với 127 acid amin, PA với 735 acid amin đuôi Histag với acid amin, tổng cộng 868 acid amin với trọng lượng phân tử tính theo lý thuyết khoảng 98 kDa Hình 3.17 cho thấy, giếng có cảm ứng 1, 3, 6, xuất băng protein lạ có kích thước khoảng gần 100 kDa tính tốn lý thuyết Như sơ kết luận q trình biểu thành cơng kiểm sốt promotor T7 Ngồi ra, dịng cảm ứng giếng số cho kết biểu tốt Do đó, lựa chọn dịng cho nghiên cứu Để xác định nhiệt độ thích hợp cho trình sinh tổng hợp protein tái tổ hợp PA, tế bào E coli BL21 cấy lắc điều kiện nhiệt độ khác là: 25, 28, 30, 37oC Sau nuôi cấy, thu tế bào Điện di mẫu gel 12,6 % polyacrylamide để tìm nhiệt độ tốt cho trình biểu Kết thể hình 3.18: Phạm Kiều Thúy CNSH 06-08 Luận văn thạc sĩ 81 10 kDa 116 98 kDa 66 45 35 25 18,4 14,4 Hình 3.18 Điện di protein tái tổ hợp PA theo nhiệt độ gel 12,6 % polyacrylamide Giếng 1: Mẫu trước cảm ứng Giếng 2: Thang protein chuẩn (Fermentas), Giếng 3, 5, 7, 9: Mẫu cảm ứng 25, 28, 30, 37oC Giếng 4, 6, 8, 10: Mẫu không cảm ứng 25, 28, 30, 37oC Hình 3.18 cho thấy biểu 30oC 37oC tế bào cảm ứng tổng hợp protein tốt 37oC nhiệt độ thích hợp cho enzyme protease hoạt động thuỷ phân protein tái tổ hợp tạo thành Do đó, lựa chọn nhiệt độ biểu 30oC tốt Nồng độ IPTG yếu tố quan trọng việc cảm ứng biểu protein tái tổ hợp PA Do đó, sau lựa chọn nhiệt độ cảm ứng 30oC, tiến hành xác định nồng độ IPTG tối thiểu cho trình lên men sinh tổng hợp PA Kết nghiên cứu nồng độ cảm ứng IPTG 0,2; 0,5; 0,7; 1; mM thử nghiệm cho thấy tổng hợp protein PA tối ưu cảm ứng 1mM Phạm Kiều Thúy CNSH 06-08 Luận văn thạc sĩ 82 116 98 kDa 66 45 35 25 Hình 3.19 Điện di biểu protein tái tổ hợp PA theo nồng độ IPTG Giếng 1-7: Mẫu trước cảm ứng, thang protein chuẩn (Fermentas), mẫu không cảm ứng, 0,2; 0,5; 0,7; 1; mM Thời gian lên men yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới suất biểu protein tái tổ hợp PA, lượng protein tổng hợp thời điểm khác Nếu thu sớm protein chưa tổng hợp tối đa, thu muộn sinh chất ức chế phân hủy protein tạo thành Chính vậy, chúng tơi cố định nhiệt độ cảm ứng 30oC, nồng độ IPTG cảm ứng mM khảo sát biểu protein tái tổ hợp theo thời gian (0, 1, 2, 3, 4, giờ) Mẫu xử lý điện di kiểm tra gel 12,6 % polyacrylamide Kết thể hình 3.20: Phạm Kiều Thúy CNSH 06-08 Luận văn thạc sĩ 83 kDa 116 98 kDa 66 45 35 25 18,4 14,4 Hình 3.20 Điện di mẫu protein PA theo thời gian gel 12,6 % polyacrylamide Giếng 1: Mẫu trước cảm ứng Giếng 2: Thang protein chuẩn chuẩn (Fermentas) Giếng 3, 4, 5, 6, 7, 8: mẫu cảm ứng với IPTG lúc 0,1 3,4,5 Hình 3.20 cho thấy lượng protein tái tổ hợp tạo thành tăng theo thời gian Lượng protein tạo thành thời điểm tương tự thời điểm Nếu tiếp tục kéo dài thời gian lên men, lượng protein tái tổ hợp giảm trình lên men tạo chất ức chế phân hủy Do đó, lựa chọn thời điểm để thu mẫu nhằm đảm bảo chất lượng sản phẩm chi phí lên men 3.4.4.2 Xác định khả hoà tan định khu protein Để kiểm tra khả hòa tan protein kháng nguyên bảo vệ PA, làm sở cho nghiên cứu sau, nghiên cứu khả hòa tan protein PA qua việc so sánh khả tổng hợp protein pha tan phần cặn sau siêu âm phá tế bào Sau cảm dòng E coli BL21 (DE3) mang vector tái tổ hợp 30oC, mM IPTG Ly tâm thu tế bào phá tế bào siêu âm đệm xử lý mẫu Phần tan phần cặn sau xử lý điện di gel 12,6 % polyacrylamide (Hình 3.21): Phạm Kiều Thúy CNSH 06-08 Luận văn thạc sĩ 84 kDa 116 98 kDa 98 kDa 66 45 35 25 18,4 14,4 Hình 3.21 Điện di protein tan khơng tan gel 12,6 % polyacrylamide Giếng 1: Mẫu cảm ứng lúc 4h Giếng 2: Mẫu trước cảm ứng Giếng 3: Mẫu không cảm ứng Giếng 4: Thang protein chuẩn (Fermentas) Giếng 5: protein hồ tan Giếng 6: protein khơng tan Khả hòa tan PA tái tổ hợp đánh giá sở so sánh pha tan pha không tan lần cảm ứng Pha tan phần dịch nổi, pha không tan (thể vùi-inclusion body) phần cặn thu sau phá tế bào siêu âm ly tâm Kết hình 3.21 cho ta thấy protein tái tổ hợp PA tổng hợp chủ yếu dạng thể vùi Theo tài liệu cơng bố tượng xảy phổ biến gen biểu mạnh E coli dẫn đến tượng sản phẩm protein tạo không kịp gấp nếp (folding) tập trung với nguyên sinh chất tế bào vi khuẩn dạng hạt thể vùi Do khơng thể tinh điều kiện bình thường mà phải siêu âm phá tế bào tinh điều kiện biến tính Phạm Kiều Thúy CNSH 06-08 Luận văn thạc sĩ 85 3.5 Tinh chế protein tái tổ hợp cột sắc kí lực Probond Nikel Resin Do protein tái tổ hợp có lực 6x histidine, sử dụng cột sắc kí lực, chất giá dùng để nhồi cột Ni(+) 8ml dịch phá tế bào ly tâm, phần dịch có chứa protein tái tổ hợp đưa lên cột Các protein có Histag có lực với Ni(+) bám chặt chất giá cột Sau rửa cột đệm rửa protein E coli bị trôi khỏi cột cịn protein có lực giữ lại Sau protein có lực đẩy khỏi cột nhờ đệm đẩy, thu phân đoạn, phân đoạn ml Sau tinh chế protein kiểm tra độ điện di gel 12,6 % polyacrylamide (Hình 3.22): 10 kDa 116 98 kDa 66 45 Hình 3.22 Điện di protein sau tinh gel 12,6 % polyacrylamide Giếng 1-7: Các phân đoạn đẩy khỏi cột (7- 1) Giếng 8: Protein trước tinh Giếng 9: Mẫu không cảm ứng Giếng 10: Thang protein chuẩn (Fermentas) Sau tinh hình 3.22 xuất băng tương đương với kích thước protein tái tổ hợp trước tinh (98 kDa) Như vậy, protein tái tổ hợp PA tinh thành công cột sắc ký lực Histag 3.6 Khẳng định biểu protein tái tổ hợp PA phản ứng Western blot Để khẳng định protein biểu ghi nhận SDS-PAGE dạng dung hợp Thioredoxin, sử dụng phương pháp Western blot với kháng thể Phạm Kiều Thúy CNSH 06-08 Luận văn thạc sĩ 86 đặc hiệu kháng Thioredoxin đánh dấu HPR (Hình 3.23a) Ngồi ra, sau thu nhận kháng thể đặc hiệu kháng PA kháng thể kháng bệnh than tự nhiên thỏ, tiến hành kiểm tra phản ứng với protein tái tổ hợp Western blot (Hình 3.23b,c) Cả phản ứng lai phát kháng thể anti-rabbit IgG-HPR Kết cho thấy có vạch (98 kDa) tương đương với kích thước protein tái tổ hợp theo tính tốn lý thuyết Như vậy, dựa kết Western blot khả kích thích thể sản sinh đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể kháng bệnh than cho phép kết luận protein có trọng lượng khoảng 98 kDa biểu protein dung hợp Thioredoxin-PA-Histag kDa 170 130 98 kDa 95 72 55 Hình 3.23a Phản ứng protein tái tổ hợp PA gắn Thioredoxin với kháng thể kháng Thioredoxin màng lai PVDF Giếng Thang chuẩn protein Phạm Kiều Thúy CNSH 06-08 Luận văn thạc sĩ 87 kDa 170 130 95 72 55 98 kDa Hình 3.23b Phản ứng protein tái tổ hợp PA gắn Thioredoxin với kháng thể kháng PA màng lai PVDF Giếng 7: Thang protein chuẩn (Fermentas) Giếng 8: Đối chứng (Huyết thỏ trước gây miễn dịch) 98 kDa 170 130 95 72 55 Hình 3.23c Phản ứng western blot protein tái tổ hợp PA với kháng thể kháng PA tự nhiên Giếng 1: Mẫu huyết thỏ sau gây miễn dịch Giếng 4: Thang protein chuẩn Ngoài ra, khả phản ứng protein tái tổ hợp PA với kháng thể kháng bệnh than tự nhiên cho thấy protein PA có khả sử dụng làm kit phát kháng thể kháng PA huyết bệnh nhân 3.7 Phát kháng thể kháng bệnh than huyết bệnh nhân phản ứng Dot blot ELISA Dựa kết nghiên cứu protein tái tổ hợp PA, sử dụng protein để phát kháng thể kháng bệnh than huyết bệnh Phạm Kiều Thúy CNSH 06-08 Luận văn thạc sĩ 88 nhân Dot blot ELISA làm sở cho việc tạo kit chẩn đoán bệnh nhân nghi nhiễm bệnh than Kết phản ứng Dot blot với mẫu huyết bệnh nhân cho thấy có mẫu huyết cho kết dương tính mẫu cho kết âm tính Tuy nhiên, kết dương tính có mức độ đậm nhạt khác Điều cho thấy lượng kháng thể kháng bệnh than tự nhiên huyết bệnh nhân khác Hình 3.24 Phản ứng Dot blot phát kháng thể kháng bệnh than huyết bệnh nhân 1, 2, 4, 5, 6: Các mẫu huyết dương tính 3: Mẫu huyết âm tính 7: Huyết thỏ đặc hiệu kháng PA 8: Huyết thỏ tự nhiên kháng PA Ngồi ra, chúng tơi sử dụng phương pháp ELISA gắn trực tiếp kháng nguyên PA tái tổ hợp lên kiểm tra với mẫu huyết bệnh nhân dương tính âm tính phản ứng Dot blot Kết ELISA phù hợp với kết phản ứng Dot blot Kết đo OD450 mẫu (Bảng 2): Bảng 3.2 Kết đo OD450 mẫu nghiên cứu Mẫu OD450 trung bình Kết ĐC1 ĐC2 0,060 0,065 0,155 0,349 0,113 (-) (-) (+) (+) (-) Phạm Kiều Thúy CNSH 06-08 Luận văn thạc sĩ 89 0,163 0,177 0,152 (+) (+) (+) Hình 3.25 Phản ứng ELISA phát kháng thể kháng bệnh than huyết bệnh nhân A: ĐC1 (KT1(-), KT2(-)) B: ĐC2 (KT1(-), KT2(+)) C-H: Mẫu 1-6 Như vậy, protein tái tổ hợp PA có khả sử dụng làm nguyên liệu cho kit chẩn đoán phát bệnh than Phạm Kiều Thúy CNSH 06-08 Luận văn thạc sĩ 90 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Đã tách dịng đọc trình tự gen pagA , gen pagA đọc trình tự có kích thước xấp xỉ 2210 bp, độ tương đồng 99 %, chứa vị trí thay đổi nucleotide Trong có vị trí nucleotide thay đổi công bố vị trí thay đổi nucleotide Đã thiết kế thành cơng vector biểu pET-TRX-FUS-pagA vector pET TRX có chứa trình tự mã hóa protein Thioredoxin acid amin Histidine Đã biểu thành công gen pagA mã hoá kháng nguyên bảo vệ PA vi khuẩn B anthracis E coli BL21, nhiệt độ thích hợp cho cảm ứng tổng hợp protein PA 30oC, nồng độ IPTG 1mM thời gian kết thúc cảm ứng Đã tinh protein tái tổ hợp PA cột Probond Nikel Resin Đã kiểm tra khả phản ứng protein tái tổ hợp PA với kháng thể đặc hiệu kháng PA kháng thể tự nhiên kháng bệnh than Đã sử dụng protein tái tổ hợp PA phát kháng thể kháng bệnh than từ mẫu huyết bệnh nhân Dot blot ELISA KIẾN NGHỊ Nghiên cứu hồn thiện cơng nghệ tạo kit chẩn đốn bệnh than áp dụng ngồi thực địa Nghiên cứu đặc tính kháng nguyên bảo vệ PA để tạo điều kiện cho nghiên cứu tạo vaccine tái tổ hợp phòng bệnh than tương lai Phạm Kiều Thúy CNSH 06-08 Luận văn thạc sĩ CÁC CƠNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN Phạm Kiều Thúy, Phạm Minh Tuấn, Đinh Duy Kháng, Ngơ Đình Bính (2008), “Biểu tinh kháng nguyên bảo vệ PA”, Chun san Tạp chí Cơng nghệ Sinh học,(Đang in) Phạm Kiều Thúy, Nguyễn Thị Ánh Nguyệt, Phạm Minh Tuấn, , Ngơ Đình Bính (2008), “Biểu gen pagA mã hóa kháng nguyên bảo vệ PA từ vi khuẩn Bacillus anthracis E coli”, Kỷ yếu hội nghị khoa học tồn quốc lần thứ : Hóa sinh sinh học phân tử phục vụ nông, sinh, y học công nghệ thực phẩm, NXB KHKT, Hà Nội, 765-767 Nguyễn Thị Ánh Nguyệt, Nguyễn Đình Tuấn, Phạm Kiều Th, Nguyễn Thị Thanh Hạnh, Ngơ Đình Bính (2006), “Tách dịng đọc trình tự đoạn gen pag mã hóa kháng nguyên bảo vệ từ chủng vi khuẩn Bacillus anthracis VCM 1167”, Kỷ yếu Hội thảo Nghiên cứu Phòng chống Vũ khí Hạt nhân, Sinh học, Hóa học (NBC), NXB KHKT, Hà Nội, 109-118 Ngo DB, Nong H, Pham KT, Nguyen DT, Dinh DK (2006), “Bacillus anthracis patial pa gene for protective antigen, ACCESSION AM404332” ... Tinh protein tái tổ hợp kháng nguyên bảo vệ PA, • Nghiên cứu sử dụng protein tái tổ hợp PA chẩn đoán bệnh than Nhiệm vụ đề tài: • Tách dịng đọc trình tự gen pagA mã hóa kháng ngun bảo vệ PA, •... liệu protein tái tổ hợp sử dụng vi? ??c tạo kit chẩn đoán bệnh than vaccine tái tổ hợp phòng bệnh than trrong tương lai, tiến hành thực đề tài:? ?Nghiên cứu biểu gen mã hóa kháng nguyên bảo vệ PA vi khuẩn. .. gen độc tố vi khuẩn B anthracis 1.5 Kháng nguyên bảo vệ PA 1.5.1 Vai trò kháng nguyên bảo vệ PA Kháng nguyên bảo vệ PA thành phần quan trọng trình gây độc vi khuẩn B anthracis Phân tử PA hồn chỉnh