Nghiên cứu biểu hiện protein e2 của virus dịch tả lợn cổ điển (classical swine fever) bằng hệ thống baculovirus

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM XENGPHAVONE KHONMANY NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN PROTEIN E2 CỦA VI RÚT DỊCH TẢ LỢN CỔ ĐIỂN (CLASSICAL SWINE FEVER) BẰNG HỆ THỐNG BACULOVIRUS Chuyên ngành : Thú y Mã số 8640101 Người hướng dẫn khoa học TS Bùi Thị Tố Nga TS Đặng Vũ Hồng NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP -2019 LỜI CAM ĐOAN Luận văn sản phẩm khoa học thuộc đề tài “Nghiên cứu sản xuất vắc xin vô hoạt chứa tiểu phần E2 hệ thống Baculovirus phòng bệnh dịch tả lợn” thuộc chương trình Cơng nghệ sinh học nông nghiệp thủy sản Bộ Nông Nghiệp Phát triển nông thôn TS Trần Thị Thanh Hà làm chủ trì Là người tham gia trực tiếp nội dung thuộc đề tài trình bày luận văn này, xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa tác giả khác công bố luận văn, luận án chủ nhiệm đề tài cho phép sử dụng vào luận văn Đề tài có quyền sử dụng kết luận văn để phục vụ cho đề tài Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Tác giả luận văn Xengphavone Khonmany i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn, nhận hướng dẫn, bảo tận tình thầy giáo, cán cơng nhan viên giúp đỡ, động viên bạn bè, đồng nghiệp gia đình Nhân dịp hồn thành luận văn, cho phép tơi bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc TS Bùi Thị Tố Nga TS Đặng Vũ Hồng tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian tạo điều kiện cho tơi suốt q trình học tập thực đề tài Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới Bộ môn Bệnh lý thú y, Khoa Thú y Học viện Nông nghiệp Việt Nam, , Bộ môn Hóa sinh - Miễn dịch, Viện Thú y quốc gia (Việt Nam), tận tình giúp đỡ tơi q trình học tập, thực đề tài hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán viên chức Bộ mơn Hóa sinh Miễn dịch giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi suốt q trình thực đề tài Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tơi mặt, động viên khuyến khích tơi hồn thành luận văn Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Tác giả luận văn Xengphavone Khonmany ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng viii Danh mục hình ix Trích yếu luận văn x Thesis abstract xiii Phần Mở đầu 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Phạm vi nghiên cứu 1.4 Ý nghĩa khoa học 1.5 Ý nghĩa thực tiễn Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Hiểu biết vi rút dịch tả lợn (DTL) 2.1.1 Lịch sử bệnh DTL giới 2.1.2 Lịch sử bệnh DTL Việt Nam 2.1.3 Cấu trúc vi rút DTL 2.1.4 Sức đề kháng vi rút DTL 2.2 Bệnh dịch tả lợn 2.2.1 Nguyên nhân gây bệnh DTL 2.2.2 Loài mắc 2.2.3 Phương thức truyền lây 2.2.4 Lứa tuổi mắc bệnh 2.2.5 Chất chứa độc lực vi rút 2.2.6 Triệu chứng 2.2.7 Bệnh tích 11 2.2.8 Phương pháp chẩn đoán bệnh DTL 12 2.2.9 Phòng chống bệnh DTL 17 iii 2.3 Vắc xin phòng dịch tả lợn 19 2.3.1 Vắc xin sản xuất nước lưu hành Viêt Nam 19 2.3.2 Vắc xin phép nhập lưu hành Viêt Nam 20 2.4 Ứng dụng hệ thống biểu baculovirus sản xuất protein tái tổ hợp vi rút 21 Phần Đối tượng, nội dung, nguyên liệu phương pháp nghiên cứu 23 3.1 Đối tượng nghiên cứu 23 3.2 Nội dung nghiên cứu 23 3.3 Thời gian địa điểm nghiên cứu 23 3.4 Nguyên liệu nghiên cứu 23 3.4.1 Các loại tế bào 23 3.4.2 Môi trường cho nuôi cấy tế bào 23 3.4.3 Vật liệu, hóa chất, sinh phẩm dùng phản ứng RT-PCR 24 3.4.4 Hóa chất dùng điện di 24 3.4.5 Vật liệu dùng để tách dòng biểu protein tái tổ hợp hệ thống Baculovirus 24 3.4.6 Môi trường, sinh phẩm, máy móc, dụng cụ dùng phản ứng Western blot 24 3.4.7 Máy móc, thiết bị 24 3.4.8 Các vật liệu khác 25 3.5 Phương pháp nghiên cứu 25 3.5.1 Phương pháp nhân chủng vi rút DTL theo phương pháp thường quy Viện Thú y 25 3.5.2 Kiểm tra đặc tính chủng gốc, xác định có mặt vi rút RT– PCR, xác định TCID50 vi rút theo phương pháp thường quy Viện Thú y 25 3.5.3 Thiết kế mồi đặc hiệu gen E2 nhân gen tinh DNA phương pháp thường quy 26 3.5.4 Tạo dịng protein mã hóa E2 kít thương mại theo hướng dẫn nhà sản xuất 27 3.5.5 Giải trình tự gen phương pháp Sanger 30 3.5.6 Tạo bacmid chuyển nạp vào tế bào côn trùng SF21AE tạo Baculovirus tái tổ hợp theo quy trình dẫn nhà sản xuất (bac-to -bac Expression System), quy trình cơng nghệ Viện Thú y Nhật Bản 30 iv 3.5.7 Phương pháp PCR phát nhanh Baculovirus tái tổ hợp mang Protein E2 tế bào côn trùng (theo công bố Barbara Malitscheck et al., 1999) 31 3.5.8 Phương pháp IPMA sử dụng tế bào côn trùng phát protein E2 tái tổ hợp 32 3.5.9 Phương pháp Western Blot phát protein E2 tái tổ hợp 32 Phần Kết thảo luận 37 4.1 Kết nhân chủng vi rút dtl, kiểm tra đặc tính vi rút chung gốc 37 4.1.1 Kết nuôi cấy tế bào 37 4.1.2 Kết gây nhiễm vi rút DTL dòng tế bào PK15a 38 4.1.3 Kiểm tra đặc tính củng gốc, xác định có mặt vi rút DTL phản ứng RT-PCR phát đoạn gene noncoding E2 vi rút DTL phân lập tế bào PK15a 39 4.2 Thiết kế mồi đặc hiệu khuếch đại protein E2 vi rút dịch tả lợn phương pháp rt-pcr 40 4.3 Tạo dịng protein mã hóa E2 vector tách dịng pfastbac, kiểm tra trình tự khung protein biểu 41 4.3.1 Tạo dòng gen E2 vi rút dịch tả lợn véc tơ tách dòng pFastBac1/NTTOPO 41 4.3.2 Tạo Baculovirus tái tổ hợp sử dụng tế bào côn trùng 44 4.3.3 Kiểm tra khả biểu protein tái tổ hợp phương pháp Immuno Peroxidase Monolayer Assay (IPMA) tế bào côn trùng Western Blot 46 4.4 Đánh giá hoạt tính sinh học protein E2 tái tổ hợp hệ thống baculovirus 47 4.4.1 Kết thực phương pháp Immuno - Peroxidase Monolayer Assay (IPMA) mẫu huyết thực địa 47 Phần Kết luận kiến nghị 50 5.1 Kết luận 50 5.2 Kiến nghị 50 Tài liệu tham khảo 51 Một số hình ảnh thực đề tài 58 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt % Percentage µl Microliter ml Milliliter µg Microgram μM Micromole ºC Celsius AEC 3- Amino-9-Ethycarbazone ASEAN Association of Southeast Asian Nations ASF African swine fever BDV Border disease virus bp Base Pair BVDV Bovine viral diarrhoea virus cDNA Complementary Deoxyribonucleic Acid CPE Cytopathogenic Effect (Bệnh tích tế bào) CSF Classical swine fever CSFV Classical swine fever virus dATP Deoxyadenosine triphosphate dCTP Deoxycytidine triphosphate dGTP Deoxyguanosine triphosphate DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxynucelside triphosphate DTH Dịch tả heo DTL Dịch tả lợn dTTP Deoxythymidine triphosphate E.coli Escherichia coli EDTA Ethylene Diamine Tetracetic Acid ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay EU European Union vi GP Glycoprotein IFN Interferon IPMA Immuno - Peroxidase Monolayer Assay IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside LB Luria Bertani MDCK Madin - Darby Canine Kidney DMEM Dulbecco’s Modification of Eagle’s Medium 5’NCR 5' noncoding region NS Nonstructural protein OIE Office Internationale des Epizooties ORF Open Reading Frame PBS Phosphate buffered saline PCR Polymerase Chain Reaction pH Potential of Hydrogen PK15 Porcine Kidney RNA Ribonucleic Acid RT Reverse Transcriptase RT-PCR Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction SF21AE Spodoptera frugiperda STE Swine Testicular Epitheloid TCID50 50% Tissue Culture Infectious Dose TN5 Hight FIVE VNT Virus Neutralization Test vii DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Thành phần phản ứng PCR 27 Bảng 3.2 Thành phần phản ứng cắt enzyme 29 Bảng 3.3 Thành phần phản ứng Phương pháp PCR phát nhanh Baculovirus tái tổ hợp mang Protein E2 tế bào côn trùng 31 Bảng 3.4 Thành phần phản ứng Western Blot phát protein E2 tái tổ hợp 33 viii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Bản đồ tình trạng bệnh DTL nước thành viên tổ chức Thú y giới cập nhật lần cuối vào tháng năm 2018 Hình 2.2 Cấu trúc gen Flavivirus Hình 2.3 Sơ đồ nguyên lý phản ứng RT - PCR 17 Hình 4.1 Tế bào PK15a sau 24 ni cấy với độ phóng đại 20X 37 Hình 4.2 Tế bào PK15a gây nhiễm vi rút DTL với độ phóng đại 20X 38 Hình 4.3 Phổ điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR 39 Hình 4.4 Phổ điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR 40 Hình 4.5 Cấu trúc vector pFastBac/NT TOPO 41 Hình 4.6 Sáu khuẩn lạc ngẫu nhiên lựa chọn để kiểm tra khả mang véc tơ pFastBac_E2 tái tổ hợp 42 Hình 4.7 Phổ điện di sản phẩm PCR sử dụng mồi đặc hiệu gen E2 khuôn plasmid từ khuẩn lạc lựa chọn 42 Hình 4.8 Trình tự gen khung đọc gen E2 vi rút dịch tả lợn chủng VN91 tách dòng 43 Hình 4.9 Kết so sánh trình tự gen nhận diện lồi sử dụng cơng cụ Blast trình tự gen E2 vi rút Dịch tả lợn ngân hàng NCBI 44 Hình 4.10 Sơ đồ chủng biểu gen Baculovirus tái tổ hợp với hệ thống biểuhiện Bac-to-Bac Expression System hãng Invitrogen (Invitrogen, 2008) 44 Hình 4.11 Sơ đồ bước tái tổ hợp protein E2 vi rút DTL hệ thống biểu Baculovirus 45 Hình 4.12 Hình ảnh khuẩn lạc mơi trường chọn lọc chứa kháng sinh chất thi Bluo-gal khuẩn lạc dịng chứa Bacmid tái tổ hợp 45 Hình 4.13 Phổ điện di sản phẩm PCR 46 Hình 4.14 Hình ảnh tế bào côn trùng SF21AE nuôi 27oC 72 47 Hình 4.15 Kết IPMA sử dụng tế bào côn trùng Hight FIVE nhiễm Baculovirus tái tổ hợp mang gen E2 vi rút dịch tả lợn 48 Hình 4.16 Kiểm tra biểu gen E2 Baculovirus tái tổ hợp phương pháp Western Blot sử dụng kháng thể đặc hiệu kháng vi rút dịch tả lợn Viện Thú y Nhật Bản cung cấp 49 ix Kết thể hình 4.14 Hình 4.14 Hình ảnh tế bào côn trùng SF21AE nuôi 27oC 72 (A) không gây nhiễm; (B) sau gây nhiễm Bacmid Kết hình 4.14 cho thấy xuất bệnh tích tế bào (CPE) sau 72 ni cấy mẫu gây nhiễm Bacmid tái tổ hợp Mẫu đối chứng không gây nhiễm với Bacmid tái tổ hợp phát triển bình thường hồn tồn khơng thấy xuất CPE Kết cho thấy tái tổ hợp thành công Baculovirus mang gen E2 vi rút Dịch tả lợn vào tế bào côn trùng 4.4 ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA PROTEIN E2 TÁI TỔ HỢP BẰNG HỆ THỐNG BACULOVIRUS 4.4.1 Kết thực phương pháp Immuno - Peroxidase Monolayer Assay (IPMA) mẫu huyết thực địa Để đánh giá, kiểm tra hoạt tính sinh học protein E2 tái tổ hợp, tiến hành đánh giá phương pháp IPMA sử dụng tế bào trùng dịng Hight FIVE (TN5) nhằm phát có mặt Baculovirus mang protein E2 tái tổ hợp Phương pháp IPMA sử dụng tế bào côn trùng thiết lập mô tả nghiên cứu trước chúng tơi (Hồng Phong cs., 2016) Ưu điểm dịng tế bào khả biểu protein cao gấp nhiều lần dòng tế bào khác SF21AE hay SF9 Mặt khác, tế bào TN5 nuôi cấy không cần bổ sung huyết thanh, sử dụng để đánh giá hoạt tính sinh học phù hợp Kết IPMA trình bày hình 4.15 47 Hình 4.15 Kết IPMA sử dụng tế bào côn trùng Hight FIVE nhiễm Baculovirus tái tổ hợp mang gen E2 vi rút dịch tả lợn (A) huyết chuẩn âm: huyết lợn SPF (specific pathogen free pigs) âm tính với vi rút dịch tả lợn; (B) Huyết chuẩn dương: huyết lợn gây tối miễn dịch với vi rút dịch tả lợn Từ hình 4.15 cho thấy, giếng sử dụng huyết lợn âm tính với vi rút dịch tả lợn nhuộm tế bào không bị bắt màu, ngược lại giếng sử dụng huyết gây tối miễn dịch với vi rút dịch tả lợn tế bào bắt màu nâu đỏ nhuộm Từ thấy protein E2 vi rút dịch tả lợn tái tổ hợp phản ứng mạnh nhận diện kháng thể tự nhiên kháng vi rút dịch tả lợn huyết lợn, khẳng định protein E2 vi rút dịch tả lợn tái tổ hợp hệ thống baculorvirus mang hoạt tính sinh học tự nhiên Trong q trình biểu tinh khiết protein tái tổ hợp, điểm thiết yếu cần xác định protein biểu có phải xác protein mong muốn hay khơng Để khẳng định điều đó, chúng tơi sử dụng kỹ thuật lai miễn dịch Western blot với kháng thể đặc hiệu kháng vi rút dịch tả lợn Viện Thú y Nhật Bản cung cấp Tế bào côn trùng nuôi cấy tạo bệnh tích tế bào Để khẳng định diện protein E2 tái tổ hợp, thu mẫu tế bào từ bắt đầu có bệnh tích ngày kiểm tra phương pháp lai 48 miễn dịch Western Blot Kết lai miễn dịch Western Blot thể qua hình 4.16 cho thấy, đường chạy protein số 2, 3, xuất băng màu đậm, rõ nét có kích thước khoảng 37kDa đậm giếng thứ tương đương với sau ngày gây nhiễm, kích thước protein E2 vi rút dịch tả lợn dung hợp với His-tag tính tốn lý thuyết Vậy lần khẳng định protein E2 tái tổ hợp biểu hệ thống Baculovirus hồn tồn mang đặc tính sinh học tự nhiên Hình 4.16 Kiểm tra biểu gen E2 Baculovirus tái tổ hợp phương pháp Western Blot sử dụng kháng thể đặc hiệu kháng vi rút dịch tả lợn Viện Thú y Nhật Bản cung cấp M: thang chuẩn (đơn vị kDa) 49 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu đây, với sở lý luận phân tích chúng tơi đưa kết luận sau: 1) Đã nhân thành công chủng vi rút DTL VN91 kiểm tra đặc tính vi rút chủng gốc 2) Đã thiết kế thành công cặp mồi đặc hiệu khuếch đại gen E2 vi rút DTL tinh DNA 3) Tạo dòng gen mã hóa E2 vector tách dịng pFastBac, kiểm tra trình tự khung gen biểu 4) Tạo bacmid mang gen E2 vi rút DTL 5) Chúng chuyển nạp thành công bacmid vào tế bào côn trùng SF21AE, tạo Baculovirus tái tổ hợp mang protein E2 6) Tái tổ hợp thành công protein E2 vi rút dịch tả lợn hệ thống biểu Baculovirus Protein E2 tái tổ hợp hệ thống biểu Baculovirus mang đầy đủ đặc tính sinh học tự nhiên (được nhận diện kháng thể kháng vi rút DTL) 5.2 KIẾN NGHỊ Từ nghiên cứu đạt chúng tơi có đề xuất sau: 1) Tiếp tục nghiên cứu phát triển vắc xin tái tổ hợp protein E2 dùng phòng bệnh dịch tả lợn Việt Nam 2) Tiếp tục nghiên cứu ứng dụng kháng nguyên protein E2 tái tổ hợp dùng chẩn đoán phát kháng thể kháng vi rút DTL ELISA sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp (rELISA) 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu tiếng Việt: Bùi, Q A (2001) "Nghiên cứu dịch tễ học bệnh dịch tả lợn (Classical swine fever) biện pháp phòng chống số tỉnh thuộc vùng Bắc Trung Bộ." Truy cập ngày 13/11/2018f web: http://luanan.nlv.gov.vn/luanan? a=d&d= TTbFfqyuOzqS2001&e= -vi-20 img-txIN -# Dân, T T., T T B Liên, N T C Tuyền H T T Lao (2000) "Biểu lâm sàng bệnh tích DTL lợn giết thịt lị mổ." Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y (5) tr 6-10 Dat, D T., N T Dung, N D Du, D V Tien, V K Bang va T T T Lien (1985) "Ve tinh hinh dich te cua benh dich ta lon co dien o Viet Nam va van de phong chong." Khoa Hoc va Ky Thuat Thu Y Dat, D T and T T T Lien (1985) "Mot so net dac trung ve dich te hoc va benh ly lam sang benh dich ta lon co dien o Viet Nam hien nay." Khoa Hoc va Ky Thuat Thu Y Dũng, N T (1999) "Dịch tả lợn cổ điển vấn đề thời sự." Tạp chí khoa học kỹ thuật Thú y 4(2) Duyên, N T P., Đ V Khuyên and D Đ Quân (2000) "Thăm dò phát kháng nguyên kháng thể dịch tả lợn phương pháp ELISA." Tạp chí khoa học kỹ thuật Thú y 7(1) tr.6-10 Hoàng, Đ V., T Q Phong, T T Thanh Hà, N T Huyền, N T Lương, Đ T Kiều Anh, N T Duyên, N T Vinh and K Takehiro (2016) "Ứng dụng hệ thống biểu Baculovirus nhằm sản xuất protein ORF2 tái tổ hợp virus PCV2." Khoa học kỹ thuật Thú y 28(2) tr 14 Lowings, P., G Ibata, J Needham and D Paton (1996) "Classical swine fever virus diversity and evolution." Journal of General Virology 77(6) tr 1311-1321 Lương, N (1997) Dịch tễ học Thú y phần chuyên khoa Học viện Nông nghiệp, Hà Nội NXB Nông nghiệp, Hà Nội 10 Navetco (2018) "Dịch tả heo tế bào nhược độc đông khô Truy cập19/11/2018 từ: http://www.navetco.com.vn/vi/sanpham/d%E1%BB%8Bch-t%E1%BA%A3-heot%E1%BA%BF-b%C3%A0o-nh%C6%B0%E1%BB%A3c%C4%91%E1%BB%99c-%C4%91%C3%B4ng-kh%C3%B4 51 11 Nguyễn, T D., T H Hồ T L Ngô (2002) "Về miễn dịch mang trùng vi rút dịch tả lợn." Tạp chí khoa học kỹ thuật Thú y (2) tr 6-16 12 Nguyễn, T H C Đ T Trần (2005) "Xác định vai trò bệnh dịch tả heo hội chứng tiêu chảy kéo dài heo số trại chăn nuôi tập trung An Giang." Tạp chí khoa học kỹ thuật Thú y 12 (2) tr 40-45 13 Nuôi, B V (2018) "Thuốc thú y Bio – LHC chữa bệnh gì? Cho gì? Giá bán bao nhiêu? Truy cập ngày 19/11/2018, từ: https://benhvatnuoi.com/thuoc-thu-ybio-lhc-chua-benh-gi-cho-con-gi-gia-ban-bao-nhieu/ 14 Nuôi, B V (2018) "Thuốc thú y Dịch tả lợn đơng khơ chữa bệnh gì? Cho gì? Giá bán bao nhiêu? Truy cập ngày 19/11/2018, từ: ttps://benhvatnuoi.com/thuocthu-y-dich-ta-lon-dong-kho-chua-benh-gi-cho-con-gi-gia-ban-bao-nhieu/ 15 Nuôi, B V (2018) "Thuốc thú y Hog Cholera Cell Culture Live chữa bệnh gì? Cho gì? Giá bán bao nhiêu? Truy cập ngày 19/11/2018, từ: https://benhvatnuoi.com/thuoc-thu-y-hog-cholera-cell-culture-live-chua-benh-gicho-con-gi-gia-ban-bao-nhieu/ 16 Nuôi, B V (2018) "Thuốc thú y Porcilis CSF live chữa bệnh gì? Cho gì? Giá bán bao nhiêu? Truy cập ngày 19/11/2018, từ: https://benhvatnuoi.com/thuocthu-y-porcilis-csf-live-chua-benh-gi-cho-con-gi-gia-ban-bao-nhieu/ 17 Nuôi, B V (2018) "Thuốc thú y Porcilis Pesti chữa bệnh gì? Cho gì? Giá bán bao nhiêu? Truy cập ngày 19/11/2018, từ: https://benhvatnuoi.com/thuocthu-y-porcilis-pesti-chua-benh-gi-cho-con-gi-gia-ban-bao-nhieu/ 18 Nuôi, B V (2018) "Thuốc thú y Vacxin dịch tả lợn chữa bệnh gì? Cho gì? Giá bán bao nhiêu? Truy cập ngày 19/11/2018, từ:https://benhvatnuoi.com/thuocthu-y-vacxin-dich-ta-lon-chua-benh-gi-cho-con-gi-gia-ban-bao-nhieu-2/ 19 Nuôi, B V (2018) "Thuốc thú y Vacxin dịch tả lợn chữa bệnh gì? Cho gì? Giá bán bao nhiêu? Truy cập ngày 19/11/2018, từ: ttps://benhvatnuoi.com/thuocthu-y-vacxin-dich-ta-lon-chua-benh-gi-cho-con-gi-gia-ban-bao-nhieu/ 20 Phạm, H S (2005) "Tình hình cảm nhiễm dịch tả lợn giết mổ ThừaThiên Huế Tạp chí khoa học kỹ thuật Thú y 12(1) tr 6-11 21 Thanh Hà, T T., L Đ Việt, N T Huyền, N T Lương, Đ T Kiều Anh, Đ V Hoàng K Takehiro (2017) "Đánh giá ảnh hưởng tiềm interferon alpha đáp ứng miễn dịch lợn tiêm kháng nguyên GP5 tái tổ hợp virus tai xanh." Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y 24 (1) tr 52 22 Trần Anh Đào, B (2009) "Một số đặc điểm bệnh lý lợn mắc bệnh dịch tả." Tạp chí Khoa học Phát triển 7(2): 165-170 23 TRUNG, P V T Y M (2018) "Hướng dẫn sử dụng vắc xin dịch tả lợn nhược độc-đông khô Truy cập ngày 19/11/2018, từ: http://phanvienthuy.com.vn/vi/product/vac-xin-dich-ta-lon-3/ 24 Vetvaco (2018) "Vắc-xin dịch tả lợn nhược độc đông khô Truy cập ngày 19/11/2018, từ: from https://vetvaco.com.vn/vac-xin-vetvaco/vacxin-dich-ta-lon-nhuoc-doc-dongkho.html II Tài liệu tiếng Anh: 25 AMAVET, C T C P K D T T Y (2018) "BIO-LHC VX DỊCH TẢ HEO." Retrieved 19/11/2018, 2018, from: http://www.amavet.com.vn/san-pham-cho-giasuc/vaccin/bio-lhc-vx-d-ch-t-heo.html 26 Bai, B., X Lu, J Meng, Q Hu, P Mao, B Lu, Z Chen, Z Yuan and H Wang (2008) "Vaccination of mice with recombinant Baculovirus expressing spike or nucleocapsid protein of SARS-like coronavirus generates humoral and cellular immune responses." Molecular immunology 45(4) pp 868-875 27 Bhaskar, N., C Ravishankar, R Rajasekhar, K Sumod, T Sumithra, K John, M Mini, R Ravindran, S Shaji and J Aishwarya (2015) "Molecular typing and phylogenetic analysis of classical swine fever virus isolates from Kerala, India." VirusDisease 26(4) pp 260-266 28 Bian, T., Y Sun, M Hao, L Zhou, X Ge, X Guo, J Han and H Yang (2017) "A recombinant type porcine reproductive and respiratory syndrome virus between NADC30-like and a MLV-like: genetic characterization and pathogenicity for piglets." Infection, Genetics and Evolution 54 pp 279-286 29 Blome, S., I Grotha, V Moennig and I Greiser-Wilke (2010) "Classical swine fever virus in South-Eastern Europe—Retrospective analysis of the disease situation and molecular epidemiology." Veterinary microbiology 146(3-4) pp.276-284 30 Crauwels, A., M Nielen, A Elbers, J Stegeman and M Tielen (2003) "Neighbourhood infections of classical swine fever during the 1997–1998 epidemic in The Netherlands." Preventive veterinary medicine 61(4) pp.263-277 31 Dahle, J and B Liess (1992) "A review on classical swine fever infections in pigs: epizootiology, clinical disease and pathology." Comparative immunology, microbiology and infectious diseases 15(3) pp 203-211 53 32 Deng, M.-C., C.-C Huang, T.-S Huang, C.-Y Chang, Y.-J Lin, M.-S Chien and M.-H Jong (2005) "Phylogenetic analysis of classical swine fever virus isolated from Taiwan." Veterinary microbiology 106(3-4) pp 187-193 33 Desai, G., A Sharma, R Kataria, N Barman and A Tiwari (2010) "5'-UTRbased phylogenetic analysis of Classical swine fever virus isolates from India." Acta virologica 54(1) pp 79-82 34 DUNNE, H W (1975) "Hog cholera." Diseases of swine pp.189-255 35 E.P.S, E P S (2018) "HOG CHOLERA VAC." Retrieved 20/11/2018: from http://www.epsvn.com/san-pham/13/hog-cholera-vac.html 36 Floegel, G., A Wehrend, K Depner, J Fritzemeier, D Waberski and V Moennig (2000) "Detection of classical swine fever virus in semen of infected boars." Veterinary microbiology 77(1-2) pp 109-116 37 Fuchs, F (1968) "Schweinepest." Handbuch der virusinfektionen bei Tieren 3: 38 Hanson, R (1957) "Origin of hog cholera." Journal of the American Veterinary Medical Association 131(5) pp 211 39 Hanvet (2018) "Vắc xin Dịch tả lợn." Retrieved 19/11/2018, 2018, from http://hanvet.com.vn/vn/scripts/prodView.asp?idproduct=310&title=-page.html 40 Hoffmann, B., M Beer, C Schelp, H Schirrmeier and K Depner (2005) "Validation of a real-time RT-PCR assay for sensitive and specific detection of classical swine fever." Journal of virological methods 130 (1-2) pp 36-44 41 Hu, J and C Zhang (2014) "Porcine reproductive and respiratory syndrome virus vaccines: current status and strategies to a universal vaccine." Transboundary and emerging diseases 61 (2) pp.109-120 42 Hulst, M., D Westra, G Wensvoort and R Moormann (1993) "Glycoprotein E1 of hog cholera virus expressed in insect cells protects swine from hog cholera." Journal of Virology 67 (9) pp 5435-5442 43 Koenen, F., G Van Caenegem, J Vermeersch, J Vandenheede and H Deluyker (1996) "Epidemiological characteristics of an outbreak of classical swine fever in an area of high pig density." Veterinary Record 139 (15) pp.367-371 44 Koroleva, N., P Spirin, A Timokhova, P Rubtzov, S Kochetkov, V Prasolov and S Beljelarskaya (2010) "Baculovirus vectors for efficient gene delivery and expression in mammalian cells." Molecular Biology 44 (3) pp 479-487 54 45 Leifer, I., H Everett, B Hoffmann, O Sosan, H Crooke, M Beer and S Blome (2010) "Escape of classical swine fever C-strain vaccine virus from detection by C-strain specific real-time RT-PCR caused by a point mutation in the primerbinding site." Journal of virological methods 166 (1-2) pp 98-100 46 Leifer, I., B Hoffmann, D Höper, T B Rasmussen, S Blome, G Strebelow, D Höreth-Böntgen, C Staubach and M Beer (2010) "Molecular epidemiology of current classical swine fever virus isolates of wild boar in Germany." Journal of General Virology 91(11) pp 2687-2697 47 Lin, S.-Y., Y.-C Chung and Y.-C Hu (2014) "Update on Baculovirus as an expression and/or delivery vehicle for vaccine antigens." Expert Review of Vaccines 13 (12) pp 1501-1521 48 Mesplède, A and E Albina (1997) "Le point sur la peste porcine classique: épidémiologie et contrôle." POINT VETERINAIRE 28 pp 25-36 49 Meyers, G., T Rümenapf and H.-J Thiel (1989) "Molecular cloning and nucleotide sequence of the genome of hog cholera virus." Virology 171(2): 555-567 50 Meyers, G., H.-J Thiel and T Rümenapf (1996) "Classical swine fever virus: recovery of infectious viruses from cDNA constructs and generation of recombinant cytopathogenic defective interfering particles." Journal of virology 70 (3) pp 1588-1595 51 Moennig, V (2000) "Introduction to classical swine fever: virus, disease and control policy." Veterinary microbiology 73 (2-3) pp 93-102 52 Moennig, V., G Floegel-Niesmann and I Greiser-Wilke (2003) "Clinical signs and epidemiology of classical swine fever: a review of new knowledge." The Veterinary Journal 165 (1) pp 11-20 53 Oleksiewicz, M B., T B Rasmussen, P Normann and Å Uttenthal (2003) "Determination of the sequence of the complete open reading frame and the 5′ NTR of the Paderborn isolate of classical swine fever virus." Veterinary microbiology 92 (4) pp 311-325 54 Park, C., T Kim, K Choi, J Jeong, I Kang, S J Park and C Chae (2017) "Two Commercial Type Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRSV)‐Modified Live Vaccines Reduce Seminal Shedding of Type PRRSV but not Type PRRSV in Infected Boars." Transboundary and emerging diseases 64 (1) pp.194-203 55 55 Paton, D and I Greiser-Wilke (2003) "Classical swine fever–an update." Research in veterinary science 75(3) pp.169-178 56 Paton, D., A McGoldrick, I Greiser-Wilke, S Parchariyanon, J.-Y Song, P Liou, T Stadejek, J Lowings, H Björklund and S Belak (2000) "Genetic typing of classical swine fever virus." Veterinary microbiology 73 (2-3) pp 137-157 57 Pearson, J (1992) "Hog cholera diagnostic techniques." Comparative immunology, microbiology and infectious diseases 15.(3) pp 213-219 58 Postel, A., S Schmeiser, J Bernau, A Meindl-Boehmer, G Pridotkas, Z Dirbakova, M Mojzis and P Becher (2012) "Improved strategy for phylogenetic analysis of classical swine fever virus based on full-length E2 encoding sequences." Veterinary research 43 (1) pp 50 59 Sabogal, Z Y., J D Mogollón, M A Rincón and A Clavijo (2006) "Phylogenetic analysis of recent isolates of classical swine fever virus from Colombia." Virus research 115 (1) pp 99-103 60 Sakoda, Y., S.-i Ozawa, S Damrongwatanapokin, M Sato, K Ishikawa and A Fukusho (1999) "Genetic heterogeneity of porcine and ruminant pestiviruses mainly isolated in Japan." Veterinary microbiology 65(1): 75-86 61 Sarma, D K., N Mishra, S Vilcek, K Rajukumar, S P Behera, R K Nema, P Dubey and S C Dubey (2011) "Phylogenetic analysis of recent classical swine fever virus (CSFV) isolates from Assam, India." Comparative immunology, microbiology and infectious diseases 34 (1) pp 11-15 62 Singh, V K and K K Rajak (2017) "Phylogenetic analysis of Classical swine fever virus from archival formalin fixed clinical tissues reveals vietnamese origin of the isolates." VirusDisease 28 (1) pp 121-125 63 Snijder, E J., M Kikkert and Y Fang (2013) "Arterivirus molecular biology and pathogenesis." Journal of General Virology 94(10) pp 2141-2163 64 Sun, S Q., S H Yin, H C Guo, Y Jin, Y J Shang and X T Liu (2013) "Genetic typing of classical swine fever virus isolates from China." Transboundary and emerging diseases 60 (4) pp 370-375 65 Terpstra, C (1991) "Hog cholera: an update of present knowledge." British Veterinary Journal 147 (5) pp 397-406 66 van Oers, M M and J M Vlak (2007) "Baculovirus genomics." Current drug targets (10) pp 1051-1068 56 67 Van Oirschot, J (1999) Hog cholera Encyclopedia of virology 68 Van Oirschot, J (2003) "Vaccinology of classical swine fever: from lab to field." Veterinary microbiology 96 (4) pp 367-384 69 Wentink, G and C Terpstra (1999) "Congress report on progress in pestivirus virology." Veterinary quarterly 21 (4) pp 163-165 70 Wikipidia (2018) "Classical swine fever." Retrieved 14/11/2018, 2018, from https://en.wikipedia.org/wiki/Classical_swine_fever 71 Zhou, J.-X., J.-D Xue, T Yu, J.-B Zhang, Y Liu, N Jiang, Y.-L Li and R.-L Hu (2010) "Immune responses in pigs induced by recombinant canine adenovirus expressing the glycoprotein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus." Veterinary research communications 34 (4) pp 371-380 57 MỘT SỐ HÌNH ẢNH THỰC HIỆN ĐỀ TÀI Hình Hình ảnh hóa chất cho ni cấy tế bào PK15a Hình Hình ảnh bước thực ni cấy tế bào 58 Hình Hình ảnh bước nghiền mẫu, phân lập gây nhiễm vi rút 59 Hình Vật liệu, hóa chất, sinh phẩm dùng phản ứng RT-PCR Hình Các bước thực phản ứng RT-PCR 60 Hình Hình ảnh hóa chất dùng điện di Hình Các bước thực chạy điện di kiểm tra sản phẩm PCR Hình Hình ảnh thực phương pháp Immuno - Peroxidase Monolayer Assay (IPMA) mẫu huyết thực địa 61 ... “ Nghiên cứu biểu protein E2 vi rút Dịch tả lợn cổ điển hệ thống Baculovirus ” nhằm ứng dụng vào cơng tác chẩn đốn bệnh tạo tiền đề cho nghiên cứu xác định chủng, phân loại di truyền vi rút Dịch. .. (E.P.S 2018) 20 2.4 ỨNG DỤNG HỆ THỐNG BIỂU HIỆN BACULOVIRUS TRONG SẢN XUẤT PROTEIN TÁI TỔ HỢP CỦA VI RÚT Hệ thống biểu Baculovirus (Baculovirus expression system) nghiên cứu phát triển nhiều năm... Fever) hệ thống Baculovirus Chuyên ngành: Thú y Mã số: 8640101 Tên sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu: Mục tiêu đề tài nghiên cứu biểu protein E2 vi rút dịch tả lợn cổ điển