Nghiên cứu biểu hiện của arid1a (at rich interactive domain containing protein 1a) trên dòng tế bào raw 264 7 dưới tác động của thuốc artesunate (art)

BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI (TỒN VĂN) ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN CỦA ARID1A (AT-RICH INTERACTIVE DOMAIN-CONTAINING PROTEIN 1A) TRÊN DÒNG TẾ BÀO RAW 264.7 DƯỚI TÁC ĐỘNG CỦA THUỐC ARTESUNATE (ART) Mã số: Chủ nhiệm đề tài: Cử nhân Võ Văn Thành Niệm BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI (TOÀN VĂN) ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN CỦA ARID1A (AT-RICH INTERACTIVE DOMAIN-CONTAINING PROTEIN 1A) TRÊN DÒNG TẾ BÀO RAW 264.7 DƯỚI TÁC ĐỘNG CỦA THUỐC ARTESUNATE (ART) Mã số: Chủ nhiệm đề tài (ký, họ tên) Tp Hồ Chí Minh, tháng 06 năm 2019 i DANH SÁCH NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU Chức danh STT Họ tên trình thực Đơn vị công tác nhiệm vụ CN Võ Văn Thành Niệm Chủ nhiệm đề tài TS Bùi Chí Bảo Thành viên CN Nguyễn Thị Huỳnh Linh Thành viên i Trung tâm Y Sinh học Phân tử Đại học Y Dược TP.HCM Trung tâm Y Sinh học Phân tử Đại học Y Dược TP.HCM Đại học Quốc Tế - Đại học Quốc Gia TP.HCM MỤC LỤC DANH SÁCH NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC HÌNH iii DANH MỤC BẢNG iii THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU iv MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Đối tượng nghiên cứu địa điểm Đối tượng vật liệu Phương pháp thí nghiệm 3.1 Nuôi cấy tế bào 3.2 Khảo sát độc tính tế bào ART 3.3 Thiết kế mồi 3.4 Tách chiết RNA 3.5 SYBR Green Real-time RT PCR 3.6 Nhuộm Cresyl Violet kiểm tra thay đổi hình thái tế bào tác động thuốc ART 3.7 Phân tích liệu CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ Độc tính tế bào thuốc ART Hiệu chuẩn mồi Biểu mRNA gen ARID1A Sự thay đổi hình thái tế bào tác động thuốc ART CHƯƠNG 4: THẢO LUẬN 11 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN 13 Tài liệu tham khảo 14 ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ART Artesunate ARID1A AT-rich interactive domain-containing protein 1A ARID1B AT-rich interactive domain-containing protein 1B mRNA Messenger ribonucleic acid CDKN1A Cyclin Dependent Kinase Inhibitor 1A SMAD3 Mothers against decapentaplegic homolog MLH1 MutL homolog PIK3IP1 Phosphoinositide-3-kinase-interacting protein SWI / SNF SWItch/Sucrose Non-Fermentable RealTime RT-PCR Realtime reverse transcription polymerase chain reaction DANH MỤC HÌNH Hình 1: Độc tính tế bào thuốc ART Hình 2: Đồ thị tuyến tính cho độc tính tế bào thuốc ART Hình 3: Độ sáng mồi ARID1A β-actin nhiệt độ ủ khác phương pháp RTPCR A ARID1A mồi B β-actin mồi Hình 4: Biểu ARID1A Hình 5: Sự thay đổi hình thái tế bào tiếp xúc với nồng độ ART khác A: điều kiện bình thường B, C, D: tế bào ủ 3, 5, 50 μM, (40X) Hình 6: Hình thái tế bào RAW 264,7 theo nồng độ ART khác sau 48 A: RAW 264,7 tế bào điều kiện bình thường B, C, D: RAW 264,7 tế bào ủ 3, 5, 50 μM, (40X)10 DANH MỤC BẢNG Bảng Trình tự mồi cho gene ARID1A gene chứng nội iii CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc ., ngày tháng năm 200 BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC I THÔNG TIN CHUNG Tên đề tài: NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN CỦA ARID1A (AT-RICH INTERACTIVE DOMAINCONTAINING PROTEIN 1A) TRÊN DÒNG TẾ BÀO RAW 264.7 DƯỚI TÁC ĐỘNG CỦA THUỐC ARTESUNATE (ART) Chủ nhiệm nhiệm vụ: Họ tên: Võ Văn Thành Niệm Ngày, tháng, năm sinh: 26/11/1990 Nam/ Nữ: Nam Học hàm, học vị: Không Chức danh khoa học: Không Chức vụ: Nghiên cứu viên Điện thoại: Tổ chức: (+84-28) 3855 8411 Nhà riêng: Không Mobile: 0938512888 Fax: Không E-mail: thanhniem2611@ump.edu.vn Tên tổ chức công tác: Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Địa tổ chức: 217 Hồng Bàng, phường 11, quận 5, TP.HCM Địa nhà riêng: 306/20 Quốc lộ 50, thị trấn Cần Giuộc, huyện Cần Giuộc, tỉnh Long An Tổ chức chủ trì nhiệm vụ(1): Tên tổ chức chủ trì nhiệm vụ: Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Điện thoại: (+84-28) 3855 8411 Fax: (+84-28) 3855 2304 E-mail: daihocyduoc@ump.edu.vn Website: http://yds.edu.vn/yds2/ Địa chỉ: 217 Hồng Bàng, phường 11, quận 5, TP.HCM Tên Khoa Trung tâm, đơn vị - nơi quản lý trực tiếp cá nhân làm chủ nhiệm đề tài iv .hành phố Hồ Chí Minh II TÌNH HÌNH THỰC HIỆN Thời gian thực nhiệm vụ: - Theo Hợp đồng ký kết: từ tháng năm 2018 đến tháng năm 2019 - Thực tế thực hiện: từ tháng năm 2018 đến tháng năm 2019 - Được gia hạn (nếu có): Khơng Từ tháng… năm… đến tháng… năm… Kinh phí sử dụng kinh phí: a) Tổng số kinh phí thực hiện: tr.đ, đó: + Kính phí hỗ trợ từ ngân sách khoa học nhà trường: tr.đ + Kinh phí từ nguồn khác: tr.đ b) Tình hình cấp sử dụng kinh phí từ nguồn ngân sách khoa học: Thực tế đạt Theo kế hoạch Ghi Số TT Thời gian Kinh phí Thời gian Kinh phí (Số đề nghị (Tháng, năm) (Tr.đ) (Tháng, năm) (Tr.đ) toán) năm 2018 đến tháng năm 2019 5 c) Kết sử dụng kinh phí theo khoản chi: Đơn vị tính: Triệu đồng Thực tế đạt Theo kế hoạch Số Nội dung TT khoản chi Tổng NSKH Nguồn khác Tổng NSKH Nguồn khác Trả công lao động (khoa học, phổ thông) 5 5 Nguyên, vật liệu, lượng 0 0 0 Thiết bị, máy móc 0 0 0 Xây dựng, sửa chữa nhỏ 0 0 0 v Tổng cộng 5 0 0 5 - Lý thay đổi (nếu có): Tổ chức phối hợp thực nhiệm vụ: Số TT Tên tổ chức tham gia thực Tên tổ chức đăng ký theo Thuyết minh Nội dung tham gia chủ yếu Sản phẩm chủ yếu đạt Ghi chú* - Lý thay đổi (nếu có): Cá nhân tham gia thực nhiệm vụ: (Người tham gia thực đề tài thuộc tổ chức chủ trì quan phối hợp, không 10 người kể chủ nhiệm) Số TT Tên cá nhân tham gia thực Nội dung tham gia Võ Văn Thành Niệm Chủ nhiệm đề tài Tên cá nhân đăng ký theo Thuyết minh Võ Văn Thành Niệm Sản phẩm chủ yếu đạt Ghi chú* - Lý thay đổi ( có): Tình hình hợp tác quốc tế: Thực tế đạt Theo kế hoạch Số TT (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm, tên tổ chức hợp tác, số đoàn, số lượng người tham gia ) (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm, tên tổ chức hợp tác, số đoàn, số lượng người tham gia ) vi Ghi chú* Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị: Số TT Theo kế hoạch Thực tế đạt (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm ) (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm ) Ghi chú* - Lý thay đổi (nếu có): Tóm tắt nội dung, công việc chủ yếu: (Nêu mục .của đề cương, không bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra khảo sát nước nước ngoài) Thời gian Số TT Các nội dung, công việc chủ yếu (Các mốc đánh giá chủ yếu) (Bắt đầu, kết thúc - tháng … năm) Theo kế hoạch Thực tế đạt Nuôi tế bào 4-5 /2018 4-5 /2018 Độc tính tế bào 6-7 /2018 6-7 /2018 Thiết kế mồi chuyên biệt cho gene ARID1A 7-9 /2018 7-9 /2018 Tách chiết RNA 10-11 /2018 10-11 /2018 Tổng hợp cDNA 11-12 /2018 11-12 /2018 Khuếch đại gene ARID1A 1-2 /2019 1-2 /2019 Kiểm tra thay đổi hình thái 2-3/2019 2-3/2019 Viết báo cáo tiến hành nghiệm thu đề tài 3-4 /2019 3-4 /2019 - Lý thay đổi (nếu có): III SẢN PHẨM KH&CN CỦA ĐỀ TÀI vii Người, quan thực a) Sản phẩm Dạng I: Số TT Tên sản phẩm tiêu chất lượng chủ yếu Đơn vị đo Số lượng Theo kế hoạch Thực tế đạt - Lý thay đổi (nếu có): b) Sản phẩm Dạng II: Yêu cầu khoa học cần đạt Số Tên sản phẩm TT Ghi Theo kế hoạch Thực tế đạt - Lý thay đổi (nếu có): c) Sản phẩm Dạng III: Yêu cầu khoa học cần đạt Số Số lượng, nơi công bố Tên sản phẩm TT Theo Thực tế kế hoạch đạt - Lý thay đổi (nếu có): d) Kết đào tạo: viii (Tạp chí, nhà xuất bản) máu dòng tế bào khối u ống nghiệm in vivo ung thư vú, ung thư phổi, ung thư ruột kết, ung thư tuyến tụy ung thư biểu mơ tế bào gan[16, 17] Tuy nhiên, có thơng tin có sẵn tác dụng chống ung thư / khối u ART vi rút bệnh bạch cầu Abelson gây Vì vậy, nghiên cứu tôi, kiểm tra tác dụng chống ung thư / khối u ART vi rút bệnh bạch cầu Abelson gây Trong nghiên cứu này, nghiên cứu biểu ARID1A mức mRNA điều trị ART RT-qPCR Độc tính thuốc ART so sánh với tế bào đơn nhân từ máu chuột để kiểm tra xem thuốc có tác dụng chống ung thư hiệu tế bào ung thư hay khơng Ngồi ra, chúng tơi đưa giả thuyết gen ARID1A làm tăng đáng kể biểu hoạt động thuốc ART Đồng thời, chúng tơi quan sát hình thái thay đổi RAW 264.7 tế bào thông qua tăng biểu ARID1A Vì lý kết luận thuốc ART khơng khuyến khích thuốc chống ung thư hiệu mà cịn góp phần vào phân biệt tế bào RAW 264.7 tế bào biểu gen ARID1A tăng lên CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Đối tượng nghiên cứu địa điểm Nghiên cứu thực phịng thí nghiệm Thần kinh học Liệu pháp miễn dịch, Trung tâm Sinh học phân tử Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh Đối tượng vật liệu Dòng tế bào Tế bào RAW 264,7 quà tặng từ đối tác nước ngồi phịng thí nghiệm Phương pháp thí nghiệm 3.1 Ni cấy tế bào Dịng tế bào sử dụng nghiên cứu RAW 264,7 (ATCC) tăng trưởng thường xuyên mức 5% CO2-95% không khí 37oC DMEM chứa 10 mM glucose bổ sung 10% FBS, mM pyruvate, HEPES 10mM, 50μM 2-mercaptoethanol, 100U penicillin / mL 100g streptomycin / mL trước thí nghiệm 3.2 Khảo sát độc tính tế bào ART Tế bào RAW 264,7 cấy đĩa 96 giếng với mật độ 6x104 tế bào / giếng ni cấy 24h Sau đó, mơi trường nuôi cấy thay nhiều nồng độ thuốc Artesunate (ART) từ 80 μM đến1μM 24h Tiếp theo 20μL dung dịch MTS / PMS cho giếng ủ 37oC Độ hấp thụ ghi nhận bước sóng 490nm bước sóng tham chiếu 630nm sử dụng máy đọc ELISA (Biotek) Trong đó: OD490e: giá trị mật độ quang mẫu có thuốc OD490b: giá trị mật độ quang mẫu trống Tỉ lệ phần trăm tế bào sống sót thấp, độc tính tế bào mẫu thử cao 3.3 Thiết kế mồi Cặp mồi đặc hiệu cho cDNA gen ARID1A β-actin (chứng nội) thiết kế CLC Main Workbench 5.5 Độ đặc hiệu mồi kiểm tra Primer-BLAST, reverse transcription PCR (RT-PCR) xác định lại phân tích nhiệt độ nóng chảy Bảng Trình tự mồi cho gene ARID1A gene chứng nội Mồi xuôi Mồi ngược ARID1A Trình tự tham khảo NM_1080819 CCTGTGTTGAAGCAGAGAAG CCTCCTCCTCCTCCAGTTTA Độ dài sản phẩm 376 bp β-actin NM_007393 AGAGGTATCCTGACCCTGAA AGAGCATAGCCCTCGTAGAT 329 bp Gene 3.4 Tách chiết RNA RNA tổng số tách chiết từ tế bào có khơng có xử lý thuốc sử dụng hóa chất Thermo Scientific GeneJET RNA Purification Kit (Thermo Fisher Scientific, Mỹ) Nồng độ RNA đo máy đo quang phổ NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, Mỹ) Đánh giá chất lượng RNA phương pháp điện di agarose formamide với tỷ lệ formamide: RNA 1:1 3.5 SYBR Green Real-time RT PCR Mẫu cDNA chạy Real-time PCR SYBR Green I Takara kit sử dụng máy MasterCycler® RealPlex (Eppendorf, Đức) Khuếch đại theo chu trình nhiệt biến tính 10 phút 95oC, sau chảy 40 chu kỳ với biến tính giây 95oC bắt cặp/kéo dài vòng phút 58oC Kết phân tích theo phương pháp 2^-Ct Livak ΔΔCT = (CT ARID1A - CT β-actin) tế bào RAW 264.7– (CT ARID1A - CT β-actin) tế bào đơn nhân thu từ máu chuột CT: chu kỳ ngưỡng 3.6 Nhuộm Cresyl Violet kiểm tra thay đổi hình thái tế bào tác động thuốc ART Tế bào cấy vào đĩa 12 giếng với mật độ 2x105 tế bào / giếng Sau 24h, môi trường nuôi cấy thay nồng độ thuốc ART tối ưu khác 3μM, 7μM, 50μM ART Sau 24h, 48h, 72h tiếp xúc thuốc, tế bào cố định 4% paraformaldehyde (PFA) 10 phút nhiệt độ phịng, sau nhuộm cresyl violet (1%) 10 phút rửa hai lần nước cất Kiểm tra kết đưới kính hiển vi soi ngược 3.7 Phân tích liệu Tất liệu trình bày dạng trung bình ± độ lệch chuẩn giá trị trung bình (SE) ba thí nghiệm Các tính tốn thống kê thực Student’s t-test phần mềm vẽ biểu đồ liệu GraphPad Prism CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ Độc tính tế bào thuốc ART Tế bào RAW 264,7 xử lý với nồng độ khác ART sau 24 ủ với hỗn hợp MTS/PMS 37oC Tỉ lệ phần trăm tế bào sống sót sau xử lý với nồng độ ART biểu thị Hình Giá trị IC50 ART xác định 7μM đồ thị đường cong tuyến tính Hình 2, (P