Biểu hiện protein Hemagglutinin của virus cúm AH5N1 trên hệ thống Baculovirus/ tế bào côn trùng

NGUYỄN VĂN KHOA BIỂU HIỆN PROTEIN HEMAGGLUTININ CỦA VIRUS CÚM A/H5N1 TRÊN HỆ THỐNG BACULOVIRUS/TẾ BÀO CÔN TRÙNG Chuyên ngành: Sinh lý Động vật Mã số chuyên ngành: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC

NGUYỄN VĂN KHOA

BIỂU HIỆN PROTEIN HEMAGGLUTININ CỦA VIRUS CÚM A/H5N1 TRÊN HỆ THỐNG BACULOVIRUS/TẾ BÀO CÔN TRÙNG

Chuyên ngành: Sinh lý Động vật

Mã số chuyên ngành: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS CAO THỊ BẢO VÂN

Tp Hồ Chí Minh-Năm 2011

Chân thành cám ơn các anh, chị và các bạn trong Phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử, Khoa Vi sinh Miễn dịch, Viện Pasteur Tp.HCM đã hỗ trợ và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này

Tp HCM, ngày 13 tháng 11 năm 2011 Học viên

Nguyễn Văn Khoa

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

aa: axít amin (amino acid)

bp: cặp bazơ (base pair)

cDNA: DNA bổ sung (complementary DNA)

cm: centimeter

dNTP: Deoxynucleotide Triphosphate

DNA: Deoxyribonucleic acid

E.coli: Escherichia coli

EDTA: Ethylene-Di-amine-Tera-acetic acid

g: gram

HPAI: virus cúm gia cầm độc lực cao (highly pathogenic avian Influenza) LPAI: virus cúm gia cầm độc lực thấp (low pathogenic avian Influenza) kb: kilobasepairs (1000 bazơ)

ml: mililiter

mM: milimolar

mRNA: RNA thông tin (messenger RNA)

nm: nanometer

OD: mật độ quang (optical density)

PCR: Phản ứng khuếch đại chuỗi (Polymerase Chain Reaction)

pfu: đơn vị hình thành vệt hòa tan (plaque forming unit)

RNA: Ribonucleic acid

RNP: Ribonucleoprotein

UV: tia cực tím (ultraviolet)

vRNA: RNA của virus (viral RNA )

WHO: Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization) μg: microgram

μl: microliter

μM: micromolar

MỤC LỤC

Trang Trang phụ bìa

Lời cám ơn

Mục lục i

Danh mục chữ viết tắt iv

Danh mục bảng và hình vi

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Dịch tễ học phân tử virus cúm A/H5N1 3

1.1.1 Tình hình thế giới 3

1.1.2 Tình hình trong nước 5

1.2 Đại cương về virus cúm A/H5N1 6

1.2.1 Phân loại 6

1.2.2 Hình thái - cấu trúc hạt virus cúm A/H5N1 7

1.2.3 Bộ gen của virus cúm A/H5N1 7

1.2.4 Kháng nguyên hemagglutinin 9

1.2.5 Chu trình sinh sản của virus cúm A/H5N1 trong tế bào chủ 13

1.2.5.1 Bám dính, xâm nhập và tháo vỏ của virus ở tế bào chủ 13

1.2.5.2 Sinh tổng hợp mRNA và sao chép RNA của virus 13

1.2.5.3 Quá trình đóng gói và nẩy chồi 14

1.3 Hệ thống baculovirus/tế bào côn trùng 15

CHƯƠNG 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu 19

2.1.1 Hóa chất 19

2.1.2 Bộ tách chiết sử dụng 20

2.1.3 Các plasmid 20

2.1.4 Tế bào 20

Mục lục 

 

Luận văn thạc sĩ    ii 

 

2.1.5 Thiết bị 20

2.1.6 Các vật liệu khác 21

2.2 Phương pháp nghiên cứu 21

2.2.1 Thu nhận plasmid pFastBac1 tái tổ hợp chứa gen H5 21

2.2.1.1 Thu nhận sản phẩm khuếch đại chứa gen H5 21

2.2.1.2 Tinh sạch sản phẩm khuếch đại 22

2.2.1.3 Định lượng sản phẩm khuếch đại 22

2.2.1.4 Chuyển gen H5 vào plasmid pFastBac1 22

2.2.1.5 Tạo dòng plasmid tái tổ hợp pFastBac1-H5 23

2.2.1.6 Tách chiết plasmid tái tổ hợp pFastBac1-H5 23

2.2.1.7 Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pFastBac1-H5 24

2.2.2 Thu nhận bacmid tái tổ hợp mang gen H5 25

2.2.2.1 Tạo dòng bacmid-H5 tái tổ hợp 25

2.2.2.2 Tách chiết bacmid-H5 tái tổ hợp 25

2.2.2.3 Kiểm tra bacmid-H5 tái tổ hợp 26

2.2.3 Biểu hiện protein hemagglutinin 26

2.2.3.1 Chuyển nhiễm bacmid-H5 tái tổ hợp vào tế bào côn trùng Sf9 26

2.2.3.2 Thu nhận và bảo quản baculovirus tái tổ hợp 27

2.2.3.3 Nhân bản baculovirus tái tổ hợp 27

2.2.3.4 Biểu hiện protein hemagglutinin 28

2.2.3.5 Thu nhận protein hemagglutinin 28

2.2.3.6 Phản ứng ngưng kết hồng cầu 28

2.2.3.7 Điện di SDS-PAGE 30

CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Thu nhận plasmid pFastBac1 tái tổ hợp mang gen H5 32

3.1.1 Thu nhận sản phẩm khuếch đại mang gen H5 32

3.1.2 Tạo dòng plasmid pFastBac1 tái tổ hợp 33

3.1.3 Kiểm tra plasmid pFastBac1 tái tổ hợp 35

3.2 Thu nhận bacmid tái tổ hợp mang gen H5 38

3.3 Kiểm tra bacmid tái tổ hợp 40

3.4 Biểu hiện protein hemagglutinin 41

3.4.1 Biểu hiện baculovirus tái tổ hợp mang gen H5 41

3.4.2 Nhân bản baculovirus tái tổ hợp 44

3.4.3 Biểu hiện protein hemagglutinin 46

3.4.4 Xác định và kiểm tra hoạt tính của protein hemagglutinin 48

3.4.5 Xác định vị trí của protein hemagglutinin 50

CHƯƠNG 4 – KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận 53

4.2 Đề nghị 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO 54

PHỤ LỤC 62

Danh mục bảng và hình  

 

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Các phân đoạn bộ gen của virus cúm A và protein được mã hóa 8

Bảng 3.1 Hình thái tế bào côn trùng bị baculovirus xâm nhiễm 47

DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Số trường hợp nhiễm và tử vong do cúm A/H5N1 trên thế giới 5

Hình 1.2 Số trường hợp nhiễm và tử vong do cúm A/H5N1 tại Việt Nam 6

Hình 1.3 Cấu trúc hạt virus cúm A 7

Hình 1.4 Sơ đồ cấu trúc sơ cấp của protein hemagglutinin 10

Hình 1.5 Sơ đồ protein hemagglutinin (H5) dạng trimer và monomer 12

Hình 1.6 Chu trình sao chép của virus cúm A 14

Hình 1.7 Sơ đồ tạo baculovirus tái tổ hợp dùng BacPAK6 16

Hình 1.8 Sơ đồ mô tả hệ thống Bac-to-Bac® Baculovirus Expression 18

Hình 2.1 Nguyên tắc phản ứng ngưng kết hồng cầu 29

Hình 2.2 Hình minh họa phương pháp điện di SDS-PAGE 31

Hình 3.1 Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại từ plasmid tái tổ hợp pHW2000-7BTV(H5) 32

Hình 3.2 Sơ đồ plasmid tái tổi hợp pFastBac1-7BTV(H5) 33

Hình 3.3 Các khuẩn lạc E.coli TOP10 trên môi trường sàng lọc 34

Hình 3.4 Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại từ plasmid thu nhận 35

Hình 3.5 Kết quả giải trình tự plasmid thu nhận 37

Hình 3.6 Khuẩn lạc E.coli DH10Bac trên môi trường sàng lọc 49

Hình 3.7 Sơ đồ chuyển vị pFastBac1 tái tổ hợp vào bacmid 40

Hình 3.8 Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại từ bacmid thu nhận 41

Hình 3.9 Tế bào Sf9 được chuyển nhiễm 43

 

Hình 3.10 Tế bào Sf9 trước và 96 giờ sau khi bị baculovirus xâm nhiễm 45 Hình 3.11 Phản ứng ngưng kết hồng cầu 59 Hình 3.12 Kết quả điện di SDS-PAGE tế bào Sf9 51

Lời mở đầu 

 

LỜI MỞ ĐẦU

Virus cúm gia cầm H5N1 gây bệnh, làm từ vong ở người và động vật đang

là mối quan tâm, lo ngại của thế giới Năm 1997, tại Hồng Kông, virus cúm gia cầm H5N1 lần đầu tiên lây truyền sang người làm tử vong 6 người trên 18 trường hợp dương tính [2], [26] Cuối năm 2003, virus cúm H5N1 phát triển thành đại dịch trên gia cầm ở các nước Đông Nam Á, sau đó lan sang các quốc gia ở châu Âu và châu Phi Theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), tính đến ngày 22/06/2011, tổng số người tử vong trên thế giới là 329 trên 562 trường hợp dương tính với virus cúm H5N1 Riêng tại Việt Nam, số ca tử vong là 59 trên 119 trường hợp dương tính H5N1, đứng thứ hai thế giới sau Indonesia [46] Do đó, việc nghiên cứu, phòng ngừa

và ngăn chặn virus H5N1 là công việc hết sức cấp thiết

Trong số 11 hoặc 12 protein của virus cúm A/H5N1 [7], [45], hemagglutinin là một trong hai protein bề mặt quan trọng nhất mang yếu tố quyết định kháng nguyên Đến nay, nhiều công trình nghiên cứu biểu hiện protein hemagglutinin trên các hệ thống khác nhau đã được công bố như: hệ thống E.coli [11], nấm men [43], thực vật[39], côn trùng [26] và động vật [19]

Trong đề tài này, chúng tôi biểu hiện protein hemagglutinin của chủng virus cúm A/DK/Viet Nam/7B-TV/2008(H5N1) trên hệ thống baculovirus/tế bào côn trùng Sf9 bởi chúng có ưu điểm biểu hiện nhanh chóng một protein có hoạt tính sinh học Protein hemagglutinin này được ứng dụng cho những nghiên cứu sâu hơn như: tạo kháng thế đơn dòng, tạo Kit chẩn đoán hay phát triển vaccine

 

Mục tiêu của đề tài:

- Khuếch đại đoạn DNA mang gen H5 của chủng virus cúm

A/DK/VietNam/7B-TV/2008 (H5N1) từ plasmid tái tổ hợp H5(7BTV)

pHW2000 Chèn đoạn DNA mang gen H5 vào plasmid pFastBac1

- Chuyển gen H5 cùng promoter polyhedrin hoạt tính mạnh vào bacmid nhằm

tạo bacmid-H5 tái tổ hợp

- Chuyển nhiễm bacmid tái tổ hợp vào tế bào côn trùng Sf9 nhằm tạo

baculovirus tái tổ hợp mang gen H5

- Nhân bản baculovirus tái tổ hợp

- Biểu hiện protein hemagglutinin trên tế bào côn trùng Sf9

- Kiểm tra hoạt tính sinh học của protein hemagglutinin

- Xác định vị trí của protein hemagglutinin trong tế bào côn trùng Sf9

Nơi thực hiện đề tài nghiên cứu của luận văn: đề tài được thực hiện tại

phòng thí nghiệm Sinh học phân tử, Khoa Vi sinh Miễn dịch,Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh

Thời gian thực hiện: đề tài được thực hiện từ tháng 7/2010 – 11/2011

CHƯƠNG 1:

TỔNG QUAN

TÀI LIỆU

1.1 Dịch tễ học phân tử virus cúm A/H5N1

1.1.1 Tình hình thế giới

Virus cúm A/H5N1 được phát hiện đầu tiên trên loài ngỗng tại tỉnh Quảng Đông, Trung Quốc vào năm 1996, và được đặt tên A/Goose/Guandong/1/96 Chỉ trong vòng một năm, gen HA (H5) của chúng tái sắp xếp với các gen của virus H9N2 (A/Quail/HK/G1/97 [H9N2]) và H6N1(A/Teal/HK/W312/97 [H6N1]) phổ biến ở loài chim cút Ngoài ra, protein NA của chủng virus H5N1 này mất vùng thân (stalk region) liên quan đến sự thích nghi của chúng với gia cầm trên cạn Đến năm 1997, chủng virus H5N1 tái tổ hợp này lan rộng, gây nên đại dịch làm chết hơn 75% gia cầm tại Hồng Kông và truyền trực tiếp từ vật sang người làm 6 người tử vong trên 18 trường hợp dương tính[9], [25] [26], [28], [36] Tuy nhiên, chúng không có khả năng truyền từ người sang người Nhằm loại bỏ các nguồn nhiễm bệnh, hơn 1.5 triệu gia cầm tại Hồng Kông bị tiêu hủy Thế nhưng, chủng virus cúm H5N1 này và chủng virus cúm H5N1 nguyên thủy gốc Quảng Đông vẫn lưu hành, tiếp tục gây nên những trận dịch trên gia cầm và chim hoang dã ở Châu Á, làm lo lắng về sự tái xuất hiện chủng virus H5N1 trên người [36]

Kể từ năm 2000, nhiều chủng virus H5N1 mới được phát hiện ở gà, vịt và các loài gia cầm khác trên cạn do sự tái sắp xếp giữa gen H5 của chủng A/Goose/Guandong/1/96 với các gen của virus cúm ở loài chim Sự đa dạng kiểu gen của virus H5N1 được phát hiện từ các trận dịch gia cầm tại Hồng Kông vào những năm 2001-2002 [17], [28] Năm 2003-2004, virus thuộc kiểu gen Z (genotype Z) lưu hành tại miền nam Trung Quốc, sau đó lan sang các nước lân cận như Việt Nam, Thái Lan, Lào, Campuchia, Malaysia, Indonesia Trong khi đó, cũng trong thời gian này, virus xâm nhập vào Nhật Bản và Hàn Quốc (South Korea) thuộc kiểu gen V [22], [28], [31] Nguyên nhân chính cho sự lan truyền nhanh chóng này bao gồm

sự di trú của các loài chim hoang dã và sự giao thương, buôn bán gia cầm, các loài chim hoang dã giữa các quốc gia [13], [22]

Tháng 4 năm 2005, phân dòng Thanh Hải (Qinghai-like sublineage hay clade 2.2), thuộc kiểu gen Z, bắt nguồn từ một trận đại dịch trên loài chim di trú tại

Tổng quan tài liệu 

 

 

miền tây Trung Quốc, chỉ trong 7 tháng đã nhanh chóng lan sang các nước

Mongolia, Siberia, Trung Á, Trung đông, Đông Âu, Tây Âu và đến châu Phi vào năm 2006 [17], [21], [22] Từ năm 2007 – 2010, phân dòng này được phát hiện tại các nước Bangladesh, West Bengal, Nepal, Bhutan [20]

Cuối năm 2005, phân dòng Phúc Kiến (Fujian-like sublineage hay clade 2.3.4), thuộc kiểu gen V, phổ biến và thay thế hầu hết các phân dòng trước đó tại Trung Quốc Phân dòng này cũng gây nên những trận dịch trên gia cầm vào năm

2006 tại các quốc gia Lào, Việt Nam, Thái Lan, Malaysia [3], [17], [24], [42] và tiếp tục lan rộng tại các tỉnh phía bắc Việt Nam, Trung Quốc vào năm 2009 và Hồng Kông vào năm 2008

Phân dòng 2.3.2 (clade 2.3.2) cũng được phát hiện tại Trung Quốc vào năm

2007 và Hồng Kông vào năm 2006 Từ năm 2008-2010, phân dòng này lan sang các nước Nhật Bản, Lào, Nga, Hàn Quốc, Romania, Nepal Ngoài ra, phân dòng 7 (clade 7) được phát hiện trên gia cầm tại các tỉnh phía bắc Việt Nam vào năm 2008 Phân dòng này cũng lưu hành tại Trung Quốc [20]

Từ năm 2003 đến tháng 6/2011, thế giới có 63 quốc gia, lãnh thổ phải gánh chịu những thiệt hại nặng nề từ các trận dịch do virus cúm H5N1 gây nên [19] Tính đến ngày 22/06/2011, thế giới có 562 người nhiễm virus cúm H5N1 tại 15 quốc gia, trong đó số người tử vong là 329 (tỉ lệ 58,5%) [46]

1 kiểu genvong ở ng

u xảy ra trêhần lớn cá

m đã xuất h Phân dònchủ yếu tại

e 1 và thể thân dòng Ph

008 đến nă

hiễm và tử v

những quốcN1 Chủng

ừ năm 200

n Z đã gâygười [24] Từ

ên vùng ch

c trận dịchhiện thêm c

ng này thay

i các tỉnh ptái tổ hợp ghúc Kiến g

ăm 2010, m

vong do cúm

c gia chịu virus cúm

1 Tuy nhi

y nên nhữn

ừ cuối nămhâu thổ sôn

h tập trung chủng viru

y thế phânphía Bắc Tgiữa hai phgây bệnh ởmột số trận

us H5N1 m

n dòng cladTrong khi hân dòng nà

06, các trận

à sông Mê K

ng trại chămới có ngu

de 1 trước

đó, phân d

ày được ph

ợc xác nhậcầm diễn ra

[46]

nhất từ cácđược phát

ự xuất hiệncầm không

n dịch cúmKông Tuy

ăn nuôi [21].uồn gốc từ

đó và gâydòng Phúchát hiện tại

Tổng quan tài liệu 

Hình 1.2 Số trường hợp nhiễm và tử vong do cúm A/H5N1 tại Việt Nam [46]

1.2 Đại cương về virus cúm A/H5N1

1.2.1 Phân loại

Virus cúm gia cầm H5N1 là một thứ týp của chi virus cúm A, họ

Orthomyxovidae [29] Họ Orthomyxovidae gồm bốn chi: virus cúm A, B, C và

Thogotovirus được phân biệt dựa trên hai kháng nguyên, nucleoprotein (NP) và protein chất nền M1 (matrix) [14], [16] Virus cúm A lại được chia thành nhiều thứ týp dựa trên 2 kháng nguyên glycoprotein bề mặt: hemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA) Cho đến nay, đã có 16 kiểu HA (H1-H16) và 9 kiểu NA (N1-

N9) khác nhau [37] Sự kết hợp các kiểu HA và NA đã hình thành nhiều thứ týp virus cúm A khác nhau [20]

1.2.2 Hình thái - cấu trúc hạt virus cúm A/H5N1

Virion điển hình của virus cúm A/H5N1 có dạng cầu, đường kính 200nm [3] Ở cấp độ vi thể, ngoài cùng của virion là màng lipid có nguồn gốc từ màng tế bào chủ Các glycoprotein HA và NA nhô lên khỏi màng lipid Tỉ lệ HA và

100-NA khoảng 4:1 Một số lượng nhỏ kênh M2 xuyên qua màng lipid Tỉ lệ giữa M2

và HA là 1/10-1/100 Bên trong các protein xuyên màng HA, NA, và M2 là lớp chất nền được tạo thành từ các protein M1 Chất nền M1 bao bọc lõi của virion và xác định hình thái virion Phần lõi gồm:

- Protein xuất nhân NEP (Nuclear Export Protein), còn gọi protein không cấu trúc NS-2 (Nonstructural Protein 2)

- Phức hợp Ribonucleoprotein (RNP) chứa các đoạn RNA quấn quanh Nucleoprotein (NP)

- Ba loại RNA polymerase: PB1, PB2 và PA [7], [22]

Hình 1.3 Cấu trúc hạt virus cúm A (A) Sơ đồ virus cúm A [15] (B) Virus cúm dưới kính

hiển vi điện tử [13]

1.2.3 Bộ gen của virus cúm A/H5N1

Virus cúm A/H5N1 gồm 8 đoạn RNA mạch đơn (vRNA), mạch âm mã hóa

11 hoặc 12 loại protein: hemagglutinin (HA); neuraminidase (NA); protein M2 và

Tổng quan tài liệu 

Phần cuối của mỗi đoạn vRNA hình thành cấu trúc kẹp tóc (helical hairpin) Phần còn lại của vRNA được bao bọc bởi nucleoprotein thông qua tương tác giữa điện tích dương của arginine trên nucleoprotein với điện tích âm của khung phosphate trên vRNA Các đoạn vRNA đều có trình tự không mang mã (noncoding) mang tính bảo tồn cao ở cả hai đầu 3’ và 5’ Promoter, nằm trên trình tự không mang mã, chứa trình tự đặc hiệu đối với phức hợp polymerase, điều này cần thiết cho quá trình sao chép và phiên mã vRNA Ngoài ra, trình tự không mã hóa cũng chứa tín hiệu polyadenyl và một phần tín hiệu đóng gói virus [7], [28], [45]

Bảng 1.1 Các phân đoạn bộ gen của virus cúm A và protein được mã hóa [7], [45]

sialidase giúp phóng thích virus ra khỏi tế bào chủ

vRNP, điều hòa xuất RNA khỏi nhân, nẩy chồi

M2 97 Kênh ion; tháo vỏ và đóng gói

virus

8 890 NS1 230 Protein ức chế sản xuất interferon;

điều hòa biểu hiện gen của tế bào chủ

NEP/NS2 121 Xuất RNA của virus khỏi nhân

1.2.4 Kháng nguyên hemagglutinin

Hemagglutinin H5 là một protein lớn, phức tạp và trải qua quá trình biến đổi sau dịch mã như gắn đường (glycosylation) và hình thành cầu nối disulfide [13] Thật vậy, protein H5 được cấu tạo bởi ba tiểu phần (trimeric molecule), trong đó mỗi tiểu phần (monomer) gồm hai chuỗi polypeptide HA1 và HA2 liên kết với nhau bởi cầu nối disulfide [4] HA1, kết thúc bằng nhóm amino, chứa nhiều vị trí được gắn nhóm đường (glycosylation site), vị trí gắn với thụ thể trên tế bào chủ và vị trí

ế bào thôn

ủ như trypt

úc sơ cấp củ

mảnh HA1 v kết thúc với n HA1 cũng A2 chứa vùn hập vào tế bàcấp của hhần thân dạtạo thành vestigial Vα-helix): 193); hai vòn

ng qua bộtase Clara,

ủa protein h

và HA2 liên k nhóm carbox chứa các vị

ng xuyên màn

ào

hemagglutiạng sợi (fibbởi HA1,

Vị trí gắn v90-helix, a

ng (loop) g

eo H3) và

) cùng một

số theo H3)trí quan trvới liên kế

10

HA2, kết thon) và pepdưới dạng pành dạng trmáy Golg phân cắt H

emagglutini

kết với nhau xyl HA1 chứ trí có gắn nh

ng và peptid

inin gồm brous stalkchứa vị trívới thụ thểamino acidgồm: 130-l220-loop,

t số acid a) [30], [40], [48rọng Gln22

ết axít siali

húc bằng nptide dungpolypeptidrimer Sau

gi Tại bề HA0 thành

in Tiểu phần

u bởi liên kết

ứa 5 vị trí kh hóm đường

8] Đặc biệt

22 và Glyic-α 2, 3-g

nhóm carbo

g hợp màn

de HA0 ch

đó, chúngmặt tế bào

h HA1 và H

n HA được p

t disulfide H háng nguyên

và vị trí gắn

ó khả năng

phần đầu

ần đầu nằmthụ thể tế b

ồm 3 thànhtrên HA1

no acid 130

ồn khác Y9

t, H5 của vy224 (tươngalactose (S

oxyl, chứa

ng (fusionhuỗi đơn ở

g được vận

o, enzymeHA2 [40]

phân cắt bởi HA1 kết thúc (A – E) trên

n với thụ thể xuyên màng

dạng cầu

m xa màngbào chủ và

ng ứng vớiSA-α-2, 3-

Gal) trên thụ thể của tế bào chủ [4], [14], [17] Phần thân của protein H5 gần màng virus, chứa tiểu phần HA2 và hai đoạn trên tiểu phần HA1 tại vị trí acid amin 1-55

và 275-329 tạo thành các cấu trúc xoắn ốc Ngoài ra, vùng thân còn chứa vị trí phân cắt giữa HA1 và HA2 [4], [40]

Các kháng nguyên trên H5 chủ yếu nằm quanh vùng gắn với thụ thể, phần

còn lại nằm ở vùng enzyme esterase vestigial [40] Quan trọng hơn, trên H5 có 3 vị trí kháng nguyên thường xuyên đột biến nên thoát khỏi hệ miễn dịch của vật chủ (escape mutant): vị trí 1: vòng acid amin 136-141 (140-145 đánh theo H3) trên HA1; vị trí 2: acid amin 152 và 153 (156 và 157 đánh số theo H3) trên HA1; vị trí 3: acid amin 124-129 (129-133 đánh theo H3) trên HA1 (đánh số theo H3) [11], [40]

Glycosyl hóa protein có nhiều vai trò quan trọng đối với virus Oligosacharide bảo vệ virus thoát khỏi hệ miễn dịch của vật chủ Những vị trí có gắn nhóm đường có thể làm giảm hoặc mất khả năng gắn của kháng thể đơn dòng Ngược lại, vị trí mất nhóm đường có thể tạo ra kháng nguyên lạ [10], [12], [40] Trên H5

có các vị trí chứa acid amin được gắn nhóm đường (glycosylation site): 11, 23, 154,

165, 286 trên HA1 (21, 33, 158, 169, 289 trên HA1 đánh số theo H3) và vị trí bảo tồn 154 (đếm theo H3) trên HA2 (hình 2C và D) Đặc biệt, nhóm đường oligosacharide gắn với acid amin 154 trên HA1, ngoại biên của vị trí gắn thụ thể (được đánh dấu vòng 150s hình 2C), làm giảm khả năng gắn với thụ thể Nhờ đó, virus có thể dễ dàng xâm nhập giữa các loài vật chủ hay tế bào chủ khác nhau [4], [8]

Tổng quan tài liệu 

 

 

Hình 1.5 Sơ đồ protein hemagglutinin (H5) dạng trimer và monomer (A) Sơ đồ

protein H5 dạng trimer (A/Dk/Sing/97) Vùng gắn với thụ thể (màu xanh) Vùng enzyme vestigial (màu vàng) Vùng đuôi HA2 (màu đỏ), đoạn 1-52 trên HA1 (màu hồng) và đoạn 275-307 trên HA1 (màu tía) Chuỗi oligosacharide được đánh dấu bởi các vòng tròn nhỏ (B) Sơ đồ H5 dạng monomer (A/Dk/Sing/97) Xoắn ốc A, xoắn ốc B và vòng nối giữa chúng Peptide dung hợp HA2 N1 và C1 tại hai đầu HA1 N2 và C2 tại hai đầu HA2 Vị trí gắn với thụ thể và hai vòng kháng nguyên 140s và 150s Các chuỗi oligosacharide quan trọng được đánh dấu bởi các vòng tròn nhỏ Các vị trí có gắn nhóm đường bao gồm: 21, 33, 169, 289 trên HA1 và 154 trên HA2.

Vị trí phân cắt giữa HA1 và HA2 nằm ở vùng thân của HA Sự phân cắt

HA có liên quan đến độc lực của virus cúm A [14] Trình tự phân cắt R-X-R/K-R

được nhận biết bởi furin là đặc tính chung của trình tự acid amin có tính base Đối với H5, HA1 và HA2 bị phân cắt tại những trình tự mang nhiều acid amin có tính base (base sequence) được thêm vào vị trí phân cắt [9] Ngoài ra, có sự khác biệt giữa trình tự phân cắt trên H5 của chủng độc lực cao và chủng độc lực thấp Chẳng hạn, chủng H5N1 độc lực cao có trình tự phân cắt R-K-K-R, thậm chí R-R-R-K-K-

R, trong khi chủng H5N2 hay chủng H5N1 độc lực thấp có trình tự phân cắt

1.2.5 Chu trình sinh sản của virus cúm A/H5N1 trong tế bào chủ

1.2.5.1 Bám dính, xâm nhập và tháo vỏ của virus ở tế bào chủ

Khởi đầu, HA của virus gắn vào acid sialic trên thụ thể của tế bào chủ Dưới tác dụng của pH thấp trong thể nội bào (endosome) hiện diện trong tế bào chủ, cấu trúc của HA bị biến đổi, để lộ đầu N kị nước trên HA2 có vai trò dung hợp màng virus với màng endosome Tiếp theo, kênh proton M2 mở ra tạo điều kiện cho lõi của virus tiếp xúc với pH thấp Ở điều kiện này, chất nền M1 phân ly và giải phóng RNP vào tế bào chất Sau đó, nhờ vào tín hiệu hướng nhân (nuclear localization signal), RNP được vận chuyển đến nhân thông qua các lỗ màng nhân theo cơ chế phụ thuộc ATP [3], [6], [7], [14] Thời gian tính từ lúc virus bám vào tế bào cho đến khi tháo vỏ hoàn toàn là 20-30 phút [6]

1.2.5.2 Sinh tổng hợp mRNA và sao chép RNA của virus

Quá trình tổng hợp bộ gen virus được thực hiện trong nhân tế bào chủ [7] Vùng 5/cap trên mRNA của tế bào chủ bị cắt bởi enzyme PB1 của virus và được dùng làm mồi (primer) cho quá trình phiên mã bộ gen virus [3] Mồi được tạo ra có kích thước 10-13 nucleotide, gắn mũ chụp (cap) m7GpppXm, chứa trình tự 5’-GCA-3’ ở gần đầu 3’ [14] Virus sử dụng enzyme transcriptase của nó để thực hiện quá trình phiên mã này [3] RNA polymerase dùng vRNA mạch âm của virus làm mạch

u trình sao c

RNA của vribonucleot

i tiểu phần cách 15-22

à nẩy chồi

virus (vRNàng sinh chcon đường

i

NP) tổng hhất để đón

g qua trung

mRNA dùA) cần thiế

mã kết thú

ầu 5’ trên v

được vận nảy chồi vRtein Crm1

ạch gốc đểchép thành

ắt cặp giữaRNA Quá

úc khi BP1RNA [14]

chuyển raRNP đượccủa tế bào

chủ Ba protein M1, NP và NEP của virus đóng vai trò quan trọng trong quá trình này Các protein Crm1, M1, NP và NEP tương tác với nhau tạo thành phức hợp Crm1-NEP-M1-vRNP giúp vRNP thoát ra khỏi màng nhân đi vào tế bào chất Các protein vỏ HA, NA và M2 sau khi tổng hợp xong được biến đổi sau dịch mã tại hệ thống lưới nội chất-bộ máy Golgi, sau đó được vận chuyển đến vị trí tập kết [17]

Quá trình nẩy chồi xảy ra ở màng tế bào chủ, được bắt đầu bởi sự tích lũy protein chất nền M1 tại bề mặt lớp đôi lipid phía trong tế bào chất [7] Khi quá trình nảy chồi hoàn tất, các mấu gai (spike) HA tiếp tục gắn virion với acid sialic trên thụ thể tại bề mặt tế bào chủ Thông qua hoạt tính sialidase của protein NA, các thành phần của virus chủ động được phóng thích ra ngoài Protein này có khả năng phá hủy các thụ thể bằng cách cắt các thành phần liên kết với đuôi acid sialic ra khỏi glycoprotein và ganglioside trên bề mặt tế bào chủ nhằm giải phóng virus ra khỏi tế bào [7] Thời gian từ khi virus xâm nhập vào tế bào đến lúc tạo ra virus mới trung bình khoảng 6 giờ [6]

1.3 Hệ thống baculovirus/tế bào côn trùng

Hệ thống baculovirus/tế bào côn trùng là công cụ dùng để biểu hiện protein

có cấu trúc phức tạp Một trong những ưu thế của hệ thống này là cung cấp nhanh chóng protein có hoạt tính sinh học Ngoài ra, nó còn được dùng để sản xuất kháng nguyên của virus

Baculovirus là tác nhân gây bệnh ở côn trùng và không có khả năng sao chép ở động vật xương sống Bộ gen của baculovirus có dạng DNA vòng mạch đôi, kích thước khoảng 130 kb Tế bào côn trùng có khả năng biến đổi sau dịch mã như glycosyl hóa, hình thành cầu nối disulfide, phosphoryl hóa cần thiết cho hoạt tính sinh học của những protein phức tạp Tuy nhiên, sự hình thành các nhóm đường phức tạp hiếm khi xảy ra ở tế bào côn trùng Sau khi baculovirus xâm nhiễm vào tế bào côn trùng, tế bào thực hiện sao chép DNA bộ gen và biểu hiện protein baculovirus cho đến khi tế bào chết Ở hệ thống biểu hiện baculovirus, protein thường được biểu hiện dưới sự kiểm soát của promoter mạnh trên gen polyhedrin Nhìn chung, protein được sản xuất ở tế bào côn trùng có hoạt tính sinh học [13]

Tổng quan tài liệu 

tự không mã hóa ở hai đầu 5’ và 3’ Tuy nhiên, tần suất tái tổ hợp chỉ đạt 0,1% đến 1% [7], [15]

 

Hình 1.7 Sơ đồ tạo baculovirus tái tổ hợp dùng BacPAK6 (A) Gen LacZ từ E Coli trên

BacPAK6 được chèn vào vị trí của polh locus Một vị trí nhận biết của enzyme giới hạn Bsu361 nằm trên gen LacZ và hai vị trí Bsu361 khác nằm trên vùng mang mã ORF603 và ORF1629 (B)

Cắt giới hạn DNA virus dẫn đến loại bỏ gen LacZ và một phần vùng mang mã ORF1629 (một gen cần thiết cho sự sao chép của virus), từ đó hình thành DNA mạch thẳng không có khả năng xâm

nhiễm (C) Đồng chuyển nhiễm vào tế bào côn trùng DNA virus mạch thẳng và vector chứa gen

mục tiêu dẫn đến gen mục tiêu được chèn vào bộ gen của virus, phục hồi lại ORF1629 và đóng

vòng DNA virus, cho phép nhân đôi virus trong tế bào côn trùng và sản xuất virus tái tổ hợp (D)

Thu nhận virus tái tổ hợp bằng phân tích vệt tan (plaque assay) [6]

Sau đó, nhiều chiến lược phức tạp hơn dùng để thiết kế baculovirus tái tổ hợp Chẳng hạn, DNA baculovirus được làm thẳng (linearized) tại vị trí duy nhất Bsu36I trên polyhedrin locus [14] Khi đồng chuyển DNA baculovirus và plasmid

chuyển (transfer plasmid) vào tế bào côn trùng, tần suất tái tổ hợp tăng lên khoảng 25% [15] Sau đó, DNA bộ gen baculovirus được thiết kế với nhiều vị trí Bsu361 Sự

phân cắt sẽ loại bỏ một phần gen cần thiết của virus (ORF 1629) làm nó không còn khả năng xâm nhiễm tế bào côn trùng trừ khi nó được kết hợp với plasmid khảm Hiệu quả phục hồi baculovirus tái tổ hợp hơn 90% [15] Sự thay thế vùng mang mã

trên gen polh bởi gen LacZ từ E Coli tạo ra vector biểu hiện có giá trị thương mại

với tên gọi BacPAK6 (Clontech)

Để giảm thiểu công việc phân tích vệt tan khi thu nhận baculovirus tái tổ hợp, phương pháp chuyển vị (transposition) mô phỏng cơ chế của vi khuẩn trong

điều kiện in vivo ra đời Sự chuyển vị tại vị trí đặc biệt trên plasmid chứa gen mục

tiêu vào DNA baculovirus (bacmid) dẫn đến gen mục tiêu được chèn vào bộ gen

của baculovirus DNA bacmid tái tổ hợp trong E Coli mang những yếu tố kháng

kháng sinh và mất yếu tố LacZ, vì thế chúng được phân biệt và thu nhận dễ dàng DNA virus được tách chiết từ các khuẩn lạc dương tính, sau đó được chuyển vào tế bào côn trùng để biểu hiện baculovirus tái tổ hợp Hệ thống Bac-To-Bac đã được thương mại hóa dựa trên phương pháp này [15]

Cho đến nay, hệ thống baculovirus/tế bào côn trùng đã được ứng dụng nhằm biểu hiện protein hemagglutinin (H5) cho mục đích nghiên cứu với nhiều

nhóm tác giả khác nhau như: Nitar New và cộng sự (2006), Y J Lin và cộng sự

(2008),Tzyy Rong Jinn và cộng sự (2010), Yi-Shin Pan và cộng sự (2010)…Protein H5 thu được từ các nghiên cứu này có hoạt tính sinh học, có khả năng gây đáp ứng miễn dịch và kháng thể sinh ra có khả năng trung hòa virus H5N1[10], [18], [26], [27]

baculovirus

-to-Bac® Ba

smid tái tổ h helper Nhân

ới mục đích b

Expression G

c chuyển vào n7 trên plasm huyển vị từ p hợp được thu biểu hiện pro

Gen mục tiêu

o tế bào E.co

mid pFastBac plasmid help

u nhận và ch otein mục tiê

u được dòng

oli DH10Bac

c1 chuyển vị per Kết quả, huyển vào tế

ế

CHƯƠNG 2:

VẬT LIỆU

&

PHƯƠNG PHÁP

- Bộ kit tách chiết QIAGEN Plasmid Mini (Midi) Kit (QIAGEN)

- Bộ kit tách chiết QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN)

- Bromophenol blue

- Dung dịch đệm PBS (Phosphate-buffered saline 0.01M, pH 7.2 (Sigma))

- Dung dịch đệm TAE (Tris-acetate-EDTA) (pH 8.3)

- Enzyme cắt giới hạn Not I (Roche)

- Enzyme cắt giới hạn Xho I (Roche)

- Enzyme T4 DNA ligase (Invitrogen)

- Ethanol tuyệt đối (Merck)

- Glacial acetic acid

- Môi trường BHI (Bio-Rad)

- Môi trường dạng thạch BHIA (Bio-Rad)

- Môi trường S.O.C (Invitrogen)

- Thang chuẩn 500 bp (Takara)

- Thang chuẩn protein (161-0374 Biorad)

- Thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue

- Thuốc nhuộm ethidium bromide (Promega)

- Tris

- Tris-HCl

- X-Gal

2.1.2 Bộ tách chiết sử dụng

- QIAfilter Midi Kit (QIAGEN)

- QIAprep spin miniprep Kit (QIAGEN)

- QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN)

2.1.3 Các plasmid

- plasmid pFastBac 1 (Invitrogen)

2.1.4 Tế bào

- Tế bào E.coli TOP10 (Invitrogen)

- Tế bào E.coli DH10Bac (Invitrogen)

- Tế bào côn trùng Sf9 (Invitrogen)

Vật liệu và Phương pháp 

 

 

- Kính hiển vi soi ngược CKX41 (Olympus)

- Máy chụp hình gel ChemiDoc (Bio-Rad)

- Máy li tâm 5417C (Eppendorf)

- Máy luân nhiệt GeneAmp® PCR System 9700 (ABI)

- Máy ly tâm chân không JOUAN RC1010

- Máy ly tâm lạnh SIGMA 3K12

- Pippetman (Eppendorf)

- Thiết bị điện di Wide Mini-Sub® Cell BT (Bio-Rad)

- Thiết bị định lượng RNA/DNA GeneQuant II (Pharmacia Biotech)

- Tủ ấm

2.1.6 Các vật liệu khác

- Pippet nhựa 5 ml; 10 ml; 25 ml (Corning)

- Chai nuôi cấy chữ T 25 cm2 và 75 cm2 (Nunc)

- Cuvette thạch anh

- Đĩa 96 giếng đáy chữ V (Nunc)

- Đĩa nuôi tế bào 6, 12, 24 giếng

- Đĩa pettri

- Hồng cầu gà

- Ống ly tâm 15 ml, 50 ml

- Ống ly tâm các loại: 200 μl; 500 μl; 1,5 ml; 2 ml

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Thu nhận plasmid pFastBac1 tái tổ hợp chứa gen H5

2.1.1.1 Thu nhận sản phẩm khuếch đại chứa gen H5

Gen hemagglutinin (H5) được khuếch đại từ plasmid pHW2000-7BTV(H5) với cặp mồi đặc hiệu Ngoài ra, đầu 5’ của mỗi mồi có chứa trình tự nhận biết của

enzyme cắt giới hạn NotI và XhoI Thành phần phản ứng gồm có: 2.5 µl 10X buffer,

2 µl dNTP 10 mM, 0.25 µl ExTaq polymerase 5U/µl, 1.5 µl mồi xuôi 10 µM, 1.5 µl mồi ngược 10 µM, 1 µl plasmid, bổ sung nước cất vô trùng cho đến thể tích cuối cùng 25 µl Chương trình nhiệt như sau: 980C (3 phút), 980C (10 giây, 40 chu kì),

600C (1 phút, 40 chu kì), 720C (5 phút, 40 chu kì), 720C (7 phút) Các sản phẩm PCR được điện di trên TAE agarose gel 1%, nhuộm ethidium 0.5 µg/ml Các vạch điện di (band) được quan sát dưới đèn UV (Ultraviolet) bước sóng 312 nm Chiều

dài của các đoạn DNA được so sánh với thang chuẩn (Takara)

2.1.1.2 Tinh sạch sản phẩm khuếch đại

Sản phẩm khuếch đại được tinh sạch bằng bộ Kit QIAquick Gel Extraction, theo hướng dẫn nhà sản xuất Quy trình: cắt và thu nhận mẫu gel chứa DNA cần tinh sạch Cân trọng lượng gel Bổ sung ba lần thể tích Buffer QG vào một thể tích gel (100 mg ~ 100 μl), thường khoảng 600-800 μl Ủ ở 500C trong 10 phút cho đến khi gel tan hoàn toàn, có thể vortex sau mỗi 2-3 phút trong quá trình ủ Đặt cột lọc QIAquick vào ống ly tâm 2 ml Cho mẫu vào cột lọc QIAquick, ly tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút Loại bỏ dịch lọc và đặt cột lọc lại ống ly tâm ban đầu Cho thêm 500 μl Buffer QG vào cột lọc và ly tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút Cho

750 μl Buffer PE vào cột lọc và ly tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút Ly tâm lại

10000 vòng/phút trong 1 phút để loại bỏ hoàn toàn dịch rửa Chuyển cột lọc sang ống ly tâm 1.5 ml mới, sạch Để hòa tan DNA, cho 25 μl buffer EB (10 mM Tris-

Cl, pH 8.5) vào giữa màng của cột lọc Để yên trong một phút rồi ly tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút để thu mẫu DNA tinh sạch [34]

2.1.1.3 Định lượng sản phẩm khuếch đại

DNA được định lượng tương đối bằng thiết bị GeneQuant II Mỗi dung dịch DNA được đo ở 2 bước sóng 260 nm và 280 nm Từ giá trị hấp phụ ở bước sóng 260 nm chúng ta xác định được nồng độ của các axít nucleic trong mẫu đồng thời xác định được độ tinh sạch của chúng thông qua tỷ lệ hấp phụ ở bước sóng 260

nm và 280 nm

2.1.1.4 Chuyển gen H5 vào plasmid pFastBac1

Các enzyme cắt giới hạn được sử dụng trong đề tài gồm: NotI và XhoI

Phản ứng cắt được thực hiện trong ống ly tâm 1.5ml Đối với sản phẩm khuếch đại

mang gen H5, thành phần gồm có: 5 μl 10XSuRE/Cut Buffer H, 2μl enzyme NotI (10 U/μl), 1 μl enzyme XhoI (40 U/μl), 20 μl sản phẩm PCR và bổ sung nước cất vô

Vật liệu và Phương pháp 

 

 

trùng để đạt thể tích cuối cùng 50 μl Đối với pFastBac1 plasmid, thành phần gồm

có: 5 μl 10X suRE/Cut buffer H, 2μl enzyme NotI (10 U/μl), 1 μl enzyme XhoI (40

U/μl), 4 μl pFastBac1 plasmid (0.5μg/μl) và bổ sung nước cất vô trùng để đạt thể tích cuối cùng 50 μl Ủ hỗn hợp mỗi phản ứng ở 370C, trong 90 phút Bất hoạt ở

650C, trong 20 phút

Các sản phẩm sau khi phân cắt được được điện di trên TAE agarose gel 1%, nhuộm ethidium bromide 0.5 µg/ml, sau đó được tinh sạch và thực hiện phản ứng nối Phản ứng nối được thực hiện trong ống ly tâm 0.5 ml với các thành phần: 4 µl 10X Ligase Reaction Buffer, 3µl DNA vector, 6 µl mẫu DNA, 1 µl T4 DNA Ligase (4 Weiss units) và 6 µl nước cất vô trùng Ủ qua đêm ở 230C. 

2.1.1.5 Tạo dòng plasmid tái tổ hợp pFastBac1-H5

Ly tâm kỹ ống ly tâm chứa plasmid cần biến nạp, đặt vào đá Hút 5 μl sản phẩm nối cho vào ống ly tâm chứa tế bào khả nạp (Invitrogen), khuấy nhẹ bằng đầu côn (cone) Ủ trên đá 30 phút Sốc nhiệt tế bào trong 30 giây, 420C, không lắc, sau

đó chuyển ngay vào đá Bổ sung 250 μl môi trường S.O.C (giữ ở nhiệt độ phòng) Lắc theo phương ngang ở 370C, khoảng 1 giờ, 225 vòng/phút Trải khoảng 100-200μl dịch tế bào lên đĩa thạch BHIA chứa ampicillin 100 μg/ml Ủ qua đêm ở

370C Kiểm tra khuẩn lạc trắng rời mọc trên đĩa thạch

2.1.1.6 Tách chiết plasmid tái tổ hợp pFastBac1-H5

Thu nhận ít nhất 10 khuẩn lạc trắng, tăng sinh trong 3 ml môi trường BHI chứa ampicillin 100μg/ml khoảng 16 giờ, ở 370C Plasmid tái tổ hợp được tách chiết bằng bộ Kit QIAprep spin miniprep, theo hướng dẫn của nhà sản xuất Quy trình: ly

tâm 3 ml dịch E.coli TOP10 nuôi qua đêm 10000 vòng/phút trong 3 phút để thu cặn

tế bào Tái huyền phù cặn tế bào trong 250 μl Buffer P1 và chuyển dịch sau khi huyền phù vào ống ly tâm 2 ml Thêm 250 μl Buffer P2 và đảo 4-6 lần Thêm 350μl Buffer N3 và đảo 4-6 lần Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút Thu nhận dịch nổi và cho vào cột lọc (QIAprep spin column) Ly tâm để loại bỏ dịch nước thải (13000 vòng/phút trong 30-60 giây) Rửa cột lọc bằng cách bổ sung 0.75 ml Buffer

PE và ly tâm 13000 vòng/phút, trong 1 phút Tiếp tục ly tâm 13000 vòng/phút trong

1 phút để loại hoàn toàn dung dịch đệm còn lại Để rửa giải DNA, đặt cột lọc trong ống ly tâm 1.5 ml, cho 50 μl đệm EB vào giữa cột lọc, để yên trong 1 phút, ly tâm

13000 vòng/phút trong 1 phút [33]

Sản phẩm plasmid tái tổ hợp tách chiết được định lượng bằng thiết bị

GeneQuant II (như đã trình bày ở phần trên)

2.1.1.7 Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pFastBac1-H5

Plasmid tái tổ hợp được kiểm tra bằng: (1) phương pháp PCR với cặp mồi chuyên biệt trên plasmid pFastbac1; và (2) phương pháp giải trình tự với các cặp mồi đặc hiệu trên pFastBac1 và trên gen H5

Đối với phương pháp PCR, thành phần phản ứng gồm có: 5 µl 5X GoTaq buffer, 2 µl MgCl2 25 mM, 2 µl dNTP mix 10 mM, 1.5 µl mồi xuôi 10 µM, 1.5 µl mồi ngược 10 µM, 1.5 µl plasmid, 0.25 µl GoTaq polymerase 5 U/µl, bổ sung nước cất vô trùng cho đến thể tích cuối cùng 25 µl Chương trình nhiệt như sau: 950C (2 phút), 950C (45 giây, 35 chu kì), 550C (1 phút, 35 chu kì), 720C (4 phút, 35 chu kì),

720 C (7 phút) Các sản phẩm PCR được điện di trên TAE agarose gel 1%, nhuộm ethidium 0.5 µg/ml Các vạch điện di (band) được quan sát dưới đèn UV (Ultraviolet) bước sóng 312 nm Chiều dài của các đoạn DNA được so sánh với vạch chuẩn đã biết kích thước

Đối với phương pháp giải trình tự, hệ thống CEQTM 8000 được dùng để giải trình tự dựa trên nguyên tắc Sanger Các bước được tiến hành như sau: (1) Thực hiện phản ứng khuếch đại PCR nhằm đánh dấu plasmid tái tổ hợp cần giải trình tự [4] : phản ứng sử dụng bộ Kit DTCS Quick Start Thành phần cho mỗi phản

ứng như sau (mỗi phản ứng tương ứng với mỗi mồi): 2 μl plasmid, 2 μl mồi 1 μM, 4

μl DTCS Quick Start Master Mix và bổ sung nước cất vô trùng đến thể tích cuối cùng 10 μl Chương trình đánh dấu: 40 chu kỳ cho 960C trong 2 phút, 500C trong 20 giây và 500C trong 4 phút, kết thúc giữ lạnh ở 40C (2) Xử lý mẫu DNA và nạp mẫu vào máy CEQTM 8000 [4] : chuyển sản phẩm đánh dấu vào eppendorf 1,5 ml Bổ

sung 5 μl hỗn hợp Stop Solution/Glycogen bao gồm 2 μl Sodium Acetate 3 M, 2 μl

ở 40C Hút bỏ dịch nổi, làm khô cặn còn lại bằng máy ly tâm chân không trong 10 phút Bổ sung 40 μl dung dịch nạp mẫu (Sample Loading Solution) vào mỗi mẫu Chuyển mẫu DNA vào các giếng, bổ sung một giọt dầu khoáng (mineral oil) lên bề

mặt Lập chương trình và chạy máy

2.2.2 Thu nhận bacmid tái tổ hợp mang gen H5

2.2.2.1 Tạo dòng bacmid-H5 tái tổ hợp

Ly tâm kỹ ống ly tâm chứa plasmid cần biến nạp, đặt vào đá Hút 5 μl sản phẩm plasmid cho vào ống ly tâm chứa tế bào khả nạp (Invitrogen), khuấy nhẹ bằng đầu côn Ủ trên đá 30 phút Sốc nhiệt tế bào trong 30 giây, 420C, không lắc, sau đó chuyển ngay vào đá Bổ sung 250 μl môi trường S.O.C (giữ ở nhiệt độ phòng) Lắc theo phương ngang ở 370C, khoảng 4 giờ, 225 vòng/phút Trải khoảng 100-200 μl dịch tế bào lên đĩa thạch BHIA chứa kanamycine 50μg/ml và gentamicin 7μg/ml, tetracycline 10 μg/ml, X-gal 50 μg/ml, IPTG 40 μg/ml (đối với tế bào được biến nạp bởi pFastBac1-H5 và pFastBac1-Gus) và môi trường chỉ chứa một yếu tố sàng lọc ampicillin 100 μg/ml (đối với tế bào được biến nạp bởi plasmid pUC19) Ủ 370C trong 48 giờ (pFastBac1-H5 và pFastBac1-Gus) và 24 giờ (đối với plasmid pUC19)

Kiểm tra khuẩn lạc trắng rời mọc trên đĩa thạch

2.2.2.2 Tách chiết bacmid-H5 tái tổ hợp

Thu nhận ít nhất 10 khuẩn lạc trắng, tăng sinh trong 3 ml môi trường BHI chứa các kháng sinh kanamycine 50 μg/ml và gentamicin 7 μg/ml, tetracycline

10 μg/ml khoảng 16-18 giờ, ở 370C Tiếp tục tăng sinh dịch vi khuẩn nuôi cấy qua đêm trong 50 ml môi trường BHI chứa kháng sinh như trên ở 370C, lắc 225 vòng/phút, khoảng 4 giờ Tái tổ hợp được tách chiết sử dụng bộ Kit QIAfilter Midi, theo hướng dẫn cảu nhà sản xuất Quy trình được thực hiện như sau: ly tâm để thu sinh khối vi khuẩn ở 6000xg trong 15 phút, 40C Hòa cặn trong 4ml dung dịch P1

Bổ sung 4ml dung dịch P2, trộn đều bằng cách đảo 4-6 lần và ủ ở nhiệt độ phòng

trong 5 phút Bổ sung 4 ml dung dịch P3 đã được làm lạnh, trộn đều hỗn hợp bằng cách đảo 4-6 lần Chuyển dịch ly giải vào trong ống của cartridge và ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút Cân bằng QIAGEN tip 100 bằng cách cho 4 ml QBT vào và

để chảy tự do Mở nắp QIAfilter cartridge, nhẹ nhàng đưa pittông vào QIAfilter cartridge và lọc dịch ly giải tế bào trong QIAGEN tip Cho dịch ly giải đã được làm sạch vào resin bằng dòng trọng lực Rửa QIAGEN tip với 20 ml dung dịch QC Dung giải DNA với 5 ml QF Tủa DNA bằng cách bổ sung 3.5 ml isopropanol (giữ

ở nhiệt độ phòng) và trộn đều Ly tâm 16000 vòng/phút trong 30 phút, 40C Cẩn thận loại bỏ dịch nổi Rửa cặn DNA với 2ml ethanol 70% (giữ ở nhiệt độ phòng) và

ly tâm 16000 vòng/phút trong 10 phút, 40C Cẩn thận loại bỏ dịch nổi Cặn được làm khô trong 5-10 phút và tái hòa tan trong dung dịch đệm TE [32]

Sản phẩm bacmid tái tổ hợp tách chiết được định lượng bằng thiết bị

GeneQuant II (như đã trình bày ở phần trên)

2.2.2.3 Kiểm tra bacmid-H5 tái tổ hợp

Bacmid tái tổ hợp được kiểm tra bằng phương pháp PCR với cặp mồi chuyên biệt pUC/M13F, pUC/M13R đối với bacmid Thành phần phản ứng gồm có: 5µl 5X GoTaq buffer, 2 µl MgCl2 25 mM, 2 µl dNTP mix 10 mM, 1.5 µl mồi xuôi

10 µM, 1.5 µl mồi ngược 10 µM, 1.5 µl bacmid tái tổ hợp, 0.25 µl GoTaq polymerase 5 U/µl, bổ sung nước cất vô trùng cho đến thể tích cuối cùng 25 µl Chương trình nhiệt như sau: 950 C (2 phút), 950 C (45 giây, 35 chu kì), 550 C (1 phút, 35 chu kì), 720 C (6 phút, 35 chu kì), 720 C (7 phút) Các sản phẩm PCR được điện di trên TAE agarose gel 1%, nhuộm ethidium 0.5 µg/ml Các vạch điện di (band) được quan sát dưới đèn UV (Ultraviolet) bước sóng 312 nm Chiều dài của

các đoạn DNA được so sánh với thang chuẩn (Invitrogen)

2.2.3 Biểu hiện protein hemagglutinin

2.2.3.1 Chuyển nhiễm bacmid-H5 tái tổ hợp vào tế bào côn trùng Sf9

Nuôi tế bào Sf9 đến pha tăng trưởng (1.5-2.5x106 tế bào/ml), với hơn 95%

tế bào sống Bổ sung 0.8ml môi trường Sf900 II SFM (không có huyết thanh và

kháng sinh) vào mỗi giếng của đĩa 12 giếng Chuyển 3.2x105 tế bào vào mỗi giếng