Xây dựng các thử nghiệm miễn dịch phát hiện protein e7 của human papilloamvirus type 18

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN BÙI HOÀNG BẢO NGỌC XÂY DỰNG CÁC THỬ NGHIỆM MIỄN DỊCH PHÁT HIỆN PROTEIN E7 CỦA HUMAN PAPILLOMAVIRUS TYPE 18 CHUYÊN NGÀNH: DI TRUYỀN MÃ SỐ: 60 42 70 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS HỒ HUỲNH THÙY DƯƠNG THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – NĂM 2011 Lời cám ơn LỜI CÁM ƠN Đầu tiên, xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Hồ Huỳnh Thùy Dương, người tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện cho tơi hồn thành đề tài Tôi chân thành cám ơn anh Trần Lê Sơn, chị Nguyễn Thái Hoàng Tâm, anh Trần Quốc Vũ, bạn Nguyễn Thị Mỹ Nương, em Phạm Trần Đăng Thức Phịng thí nghiệm Sinh học phân tử - Bộ môn Di truyền – Khoa sinh học – Đại học Khoa học tự nhiên ủng hộ, giúp đỡ suốt thời gian thực đề tài Cám ơn bạn Diễm Trang, Thanh Minh, Ngọc Thùy, Mỹ Anh, Thu Trang bên cạnh tơi lúc tơi gặp khó khăn q trình thực đề tài Và tất cả, xin cám ơn ba mẹ gia đình ln yêu thương, tạo điều kiện cho học tập sống Bùi Hoàng Bảo Ngọc Lời mở đầu LỜI MỞ ĐẦU Nếu phút có người giới chết ung thư phổi phút có phụ nữ chết ung thư cổ tử cung Ở Mỹ, năm 2009 ước tính có khoảng 12.000 phụ nữ mắc ung thư cổ tử cung Với tỉ lệ 26 ca 100.000 phụ nữ, ung thư cổ tử cung trở thành nguyên nhân ung thư gây tử vong hàng đầu cho phụ nữ Việt Nam nước phát triển Khuyến cáo ung thư cổ tử cung năm 2009 xác định phòng ngừa chìa khóa then chốt chiến chống bệnh Do đó, phương pháp tầm sốt hiệu bệnh giúp ngăn ngừa giảm tỉ lệ tử vong gây Khoảng 95 % trường hợp ung thư cổ tử cung có liên quan đến Human papillomavirus (HPV) Nhiều nghiên cứu cho thấy có mối liên hệ mật thiết việc nhiễm lâu dài số chủng “có nguy cao”, đặc biệt HPV type 16 HPV type 18, với khả phát triển bệnh ung thư cổ tử cung Do đó, dựa vào mối quan hệ này, ta phát triển phương pháp chẩn đốn để phát sớm khả gây ung thư HPV, từ đưa phương pháp điều trị hiệu Từ thực tế trên, tiến hành xây dựng công cụ miễn dịch dựa kháng thể đơn dòng nhằm phát protein E7 HPV 18, protein gây ung thư (oncoprotein) đóng vai trị quan trọng chế phát sinh ung thư HPV Các cơng cụ chẩn đốn góp phần hồn thiện cơng tác phịng ngừa điều trị ung thư cổ tử cung Việt Nam giới viii Danh mục bảng DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1 Kết realtime immuno-PCR với protein E7 HPV 18 tái tổ hợp .62  Bảng 3.2 Kết phân tích đường cong nóng chảy 63  Bảng 3.3 Kết ELISA với protein E7 HPV 18 tái tổ hợp 63  Bảng 3.4 Kết realtime immuno-PCR protein E7 HPV 18/16/11/6 65  vii Danh mục chữ viết tắt DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AP : Alkaline phosphatase CHO : Chinese hamster ovary CR : Consensus region E’MEM : Eagle’s minimum essential media EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid EGFP : Enhanced green fluorescent protein ELISA : Enzyme-linked immunosorbent assay FBS : Fetal bovine serum KTĐD : Kháng thể đơn dòng HEPES : 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid HPV : Human papillomavirus LCR : Long control region mAb : Monoclonal antibody OD : Optical density PBS : Phosphate buffered saline PCR : Polymerase chain reaction PFA : Paraformaldehyde PLL : Poly – L – lysine pRB : Retinoblastoma tumor suppressor protein STD : Standard deviation URR : Upstream regulatory region UTCTC : Ung thư cổ tử cung iv Danh mục hình đồ thị DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ Trang Hình 1.1 Cấu trúc gene HPV 3  Hình 1.2 Cấu trúc protein E7 .5  Hình 1.3 Tác động protein E7 lên trình nội bào .6  Hình 1.4 Hệ thống phát trực tiếp 13  Hình 1.5 Hệ thống avidin-biotin 13  Hình 1.6 Hệ thống polymer – kháng thể thứ cấp – enzyme 14  Hình 1.7 ELISA immuno PCR Nguyên lý độ nhạy hai phương pháp 15  Hình 1.8 Immuno-PCR cổ điển, sử dụng protein lai protein A streptavidin 17  Hình 1.9 Immuno-PCR phổ biến 18  Hình 1.10 Sơ đồ mô tả đoạn DNA marker gắn cộng hợp vào kháng thể 19  Hình 1.11 Immuno-PCR trực tiếp .20  Hình 1.12 Immuno-PCR sử dụng hạt từ phủ kháng thể 21  Hình 1.13 Immuno-PCR sử dụng “bio-barcode” .21  Hình 1.14 Immuno-PCR sử dụng LG protein hệ thống phát Tus-Ter .22  Hình 2.1 Buồng đếm hồng cầu .31  Hình 2.2 Sơ đồ phương pháp ELISA .38  Hình 2.3 Sơ đồ phương pháp checkerboard .38  Hình 2.4 Sơ đồ phương pháp immuno-PCR 39  Hình 3.1 Mơ hình phương pháp lai hóa tế bào miễn dịch sử dụng đề tài 41  Hình 3.2 Lai hóa tế bào miễn dịch sử dụng KTĐD 1D5 dòng tế bào HeLa C33A với nồng độ kháng thể 10 µg/ml (A1, A2), µg/ml (B1, B2), 2,5 µg/ml (C1, C2) 42  Hình 3.3 Lai hóa tế bào miễn dịch sử dụng KTĐD 4H5 dòng tế bào HeLa C33A với nồng độ kháng thể 10 µg/ml (A1, A2), µg/ml (B1, B2), 2,5 µg/ml (C1, C2) 43  v Danh mục hình đồ thị Hình 3.4 Lai hóa tế bào miễn dịch sử dụng kháng thể 1D5 (10 µg/ml) dịng tế bào HeLa (A), C33A (B), CHO-K1 chuyển vector pEGFP-E7HPV18 (C), CHOK1 chuyển vector pEGFP-C2 (D), CaSki (E) 44  Hình 3.5 Lai hóa tế bào miễn dịch sử dụng kháng thể 4H5 (10 µg/ml) dịng tế bào HeLa (A), C33A (B), CHO-K1 chuyển vector pEGFP-E7HPV18 (C), CHOK1 chuyển vector pEGFP-C2 (D), CaSki (E) 45  Hình 3.6 Lai hóa tế bào miễn dịch dòng tế bào HeLa với kháng thể 1D5 (10 µg/ml), sử dụng tác nhân bộc lộ kháng nguyên citrate pH 10 mM (A), EDTA pH mM (B), không xử lý với tác nhân bộc lộ kháng nguyên (C) 46  Hình 3.7 Lai hóa tế bào miễn dịch mẫu tế bào HeLa (A), CaSki (B), C33A (C) xử lý theo phương pháp ly tâm trải lên 47  Hình 3.8 Lai hóa tế bào miễn dịch mẫu tế bào dịch phết cổ tử cung 49  Hình 3.9 Mơ hình kĩ thuật immuno-PCR ELISA sử dụng đề tài 50  Hình 3.10 Đồ thị xác định số lực KTĐD 4H5-biotin với kháng nguyên E7 HPV 18 tái tổ hợp tinh 53  Hình 3.11 PCR tạo DNA đánh dấu biotin 54  Hình 3.12 Đồ thị khảo sát nồng độ kháng thể “bắt giữ” 1D5 55  Hình 3.13 Đồ thị khảo sát nồng độ kháng thể “phát hiện” 4H5-biotin 56  Hình 3.14 Đồ thị khảo sát nồng độ STV-AP 57  Hình 3.15 Tối ưu hóa nồng độ DNA đánh dấu biotin sử dụng cho immuno-PCR .58  Hình 3.16 Tối ưu hóa nồng độ streptavidin sử dụng cho immuno-PCR 59  Hình 3.17 Tối ưu hóa tác nhân khóa giếng 60  Hình 3.18 Kết immuno-PCR với protein E7 HPV 18 tái tổ hợp 61  vi Phần 1: Tổng quan tài liệu TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 UNG THƯ CỔ TỬ CUNG VÀ HUMAN PAPILLOMAVIRUS 1.1.1 Ung thư cổ tử cung Trên giới, ung thư cổ tử cung (UTCTC) chiếm khoảng 12 % ca ung thư phụ nữ, trở thành bệnh phổ biến thứ hai phụ nữ sau ung thư vú phổ biến nước phát triển, có Việt Nam [67] Theo thống kê tổ chức Y tế giới (WHO), năm 2005 tồn cầu có khoảng 260.000 phụ nữ chết bệnh này, 95 % số nước phát triển [68] Tỉ lệ mắc bệnh cao vùng cận Sahara Châu Phi, quần đảo Melanesia, Mỹ Latinh, Caribê, Nam Á Đông Nam Á [49] Việt Nam nước phát triển nên tỉ lệ mắc UTCTC thuộc vào loại cao giới (chiếm 13,03 % loại ung thư – năm 2002) Tần suất ung thư có chênh lệch lớn hai miền Nam - Bắc, thành phố Hồ Chí Minh 28,8 100.000 dân miền Bắc tần suất 6,8 [63] Ung thư cổ tử cung phát triển tế bào cổ tử cung bắt đầu tăng sinh khơng kiểm sốt sau xâm lấn đến mô lân cận lan rộng khắp thể Thông thường, UTCTC phát triển chậm triệu chứng rõ rệt vài trường hợp định tăng sinh lan rộng nhanh [22] Ung thư cổ tử cung mô tả dựa vào nguồn gốc loại tế bào phát sinh nên Dạng phổ biến UTCTC ung thư biểu mô tế bào vảy (chiếm khoảng 80 % dạng UTCTC) Dạng phổ biến thứ hai ung thư biểu mơ tuyến Có khoảng 3-5 % trường hợp UTCTC mắc phải hai dạng Ngoài vài dạng gặp khác [22], [72] Một nguyên nhân chủ yếu dẫn đến UTCTC nhiễm lâu dài loại virus phổ biến dễ lây nhiễm Human papillomavirus (HPV) [26] Tuy nhiên, vài type HPV có khả gây nên ung thư Thông thường, việc nhiễm HPV không gây triệu chứng xuất tổn thương tiền ung thư cổ tử cung Ngồi cịn có nhiều yếu tố nguy khác Phần 1: Tổng quan tài liệu có nhiều bạn tình, quan hệ tình dục sớm, hút thuốc … góp phần làm gia tăng khả mắc bệnh [22] 1.1.2 Human papillomavirus (HPV) 1.1.2.2 Phân loại HPV Human papillomavirus (HPV) thuộc họ Papillomaviridae, nhóm virus gây nhiều dạng tổn thương biểu mơ khác người Hiện có 200 type HPV xác định dựa phân tích trình tự DNA Trong có 96 type giải trình tự đầy đủ 100 type giải trình tự phần [23], [31] Dựa vào liên quan type HPV với mức độ tổn thương cổ tử cung khả phát triển thành ung thư người ta chia type xâm nhiễm vào biểu mơ cổ tử cung thành ba nhóm nhỏ [14], [62], [69]: - Nhóm “có nguy thấp” (low risk HPV): gồm type 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81, 89; phổ biến HPV HPV 11 Nhóm HPV có nguy thấp thường liên quan tới mụn nhọt sinh dục tổn thương biểu mô tế bào vảy mức độ nhẹ, gây ung thư xâm lấn - Nhóm “có nguy cao” (high risk HPV): gồm type 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59; lây truyền qua đường tiếp xúc tình dục Nếu nhiễm lâu dài type HPV thuộc nhóm có nguy mắc UTCTC cao HPV 16 HPV 18 chịu trách nhiệm cho 70 % ca UTCTC tồn giới - Nhóm “có nguy trung gian” (intermediate HPV): gồm type 26, 53, 66, 68, 73, 82 Nhóm có liên quan đến tổn thương biểu mơ mức độ cao tìm thấy trường hợp ung thư xâm lấn Trường hợp HPV 53 lại thường xuyên tìm thấy phụ nữ không mắc ung thư 1.1.2.3 Đặc điểm HPV HPV dạng virus cổ, khơng có màng bao, đường kính khoảng 55 nm, có DNA mạch đơi dạng vịng, kích thước khoảng 8.000 cặp base HPV có gene – khung đọc mở (open reading frame – ORF) – mã hóa cho protein chức Phần 1: Tổng quan tài liệu virus Bộ gene HPV chia thành phần: vùng gene sớm, vùng gene muộn vùng điều hòa dài Vùng gene sớm (early gene): nằm phía vùng điều hịa dài; có chiều dài khoảng 4.500 cặp base; chứa gene cần thiết cho trình mã gene virus, q trình điều hịa nhân tố phiên mã hoạt động biến đổi tế bào gây ung thư, đồng thời có vai trị tăng sinh khơng kiểm sốt tế bào Gồm ORF mã hóa cho protein sớm E1, E2, E4, E5, E6, E7 Vùng gene muộn (late gene): dài khoảng 2.500 cặp base, gồm ORF mã hóa cho protein cấu trúc protein vỏ capsid (L1) protein vỏ capsid phụ (L2), tạo giai đoạn muộn chu trình sống virus, dùng để đóng gói virion Vùng điều hịa dài (long control region – LCR) hay gọi vùng điều hòa thượng nguồn (upstream regulatory region – URR): nằm kế bên vị trí khởi đầu mã virus, dài khoảng 1.000 cặp base, khơng mã hóa cho protein, gồm nhiều vị trí gắn chồng lấp nhân tố điều hịa phiên mã NF-1, AP1, KRF-1, Oct-l, SP-1, YY-1 thụ thể glucocorticoid Vùng URR điều hòa trình mã, phiên mã gene sớm, gene muộn trình xâm nhiễm virus [11], [14], [43], [71] Hình 1.1 Cấu trúc gene HPV [43] Phần 3: Kết - Thảo luận Chúng tơi đồng thời thực thí nghiệm xác định giới hạn phát phương pháp ELISA tương ứng (hình 3.9b) để so sánh Quy trình ELISA sử dụng nồng độ kháng thể 1D5, 4H5-biotin, E7 HPV 18 tương tự quy trình immuno-PCR; khác chỗ sử dụng STV-AP (độ pha loãng 1:1000) để phát phức hợp miễn dịch Kết trình bày bảng 3.2 Giới hạn phát ELISA xác định giá trị nồng độ kháng ngun thấp mà cho tín hiệu OD cao “giá trị cut off” Giá trị “cut off” tính theo cơng thức: Giá trị cut off = ODtrung bình mẫu âm + 3* STD mẫu âm (2) [21] Dựa vào công thức (2), tính “giá trị cut off” ELISA 0,131 Như vậy, giới hạn phát phương pháp ELISA ng/ml (tương ứng với 50 pg E7 HPV 18/mẫu) (bảng 3.2) So với ELISA truyền thống, quy trình realtime immuno-PCR chúng tơi có độ nhạy tăng 10 lần Điều tương đồng với công bố Niemeyer cộng (2007) tiến hành xây dựng quy trình immuno-PCR phát IL-6, nhóm tác giả cho thấy với dạng immuno-PCR phổ biến (hình 3.9a) mà chúng tơi sử dụng có độ nhạy tăng 10 lần so với ELISA Để tăng hiệu phát lên 1.000 lần so với ELISA truyền thống, nhóm tác giả sử dụng dạng immuno-PCR trực tiếp với DNA marker gắn trực tiếp lên kháng thể “phát hiện” thông qua tương tác hóa học [45] Tuy nhiên, độ nhạy quy trình immuno-PCR chúng tơi tăng 10 lần so với ELISA khơng cao, địi hỏi kĩ thuật phức tạp khả ngoại nhiễm cao Có nhiều nghiên cứu cho thấy độ nhạy immuno-PCR tăng từ 100 đến 10.000 lần so với ELISA truyền thống [9], [18], [37] Vì vậy, quy trình cần tối ưu thêm để đạt hiệu phát tốt có khả ứng dụng rộng rãi 3.2.6 Độ đặc hiệu kĩ thuật quy trình immuno-PCR Chúng tơi tiến hành kiểm tra độ đặc hiệu quy trình immuno-PCR phát protein E7 HPV 18 với protein E7 type HPV khác, gồm HPV 16, HPV 11 HPV 6, để xem có phản ứng chéo xảy hay khơng 64 Phần 3: Kết - Thảo luận Bảng 3.4 Kết realtime immuno-PCR protein E7 HPV 18/16/11/6 Protein Ct mục tiêu (1000 ng/ml) CtTB Lần Lần STD Lần E7 HPV 18 20,32 21,56 20,02 20,63 0,816 E7 HPV 16 29,47 29,33 29,28 29,36 0,098 E7 HPV 11 29,82 28,76 28,95 29,18 0,565 E7 HPV 29,16 28,3 27,54 28,33 0,811 Chứng âm 28,97 27,63 28,05 28,22 0,685 Kết bảng 3.4 cho thấy quy trình phát protein E7 HPV 18 mà không cho phản ứng chéo với protein E7 type HPV khác nồng độ Như vậy, quy trình immuno-PCR cho phép phát đặc hiệu protein E7 HPV 18 65 Phần 4: Kết luận – Đề nghị KẾT LUẬN Trong nghiên cứu này, đạt kết sau: Xây dựng quy trình hóa tế bào miễn dịch phát protein E7 HPV 18: - Chuẩn bị tế bào dịch phết phương pháp ly tâm trải lên lame kính - Kháng thể sơ cấp sử dụng KTĐD 1D5 với nồng độ 10 µg/ml - Tác nhân bộc lộ kháng nguyên citrate pH 10 mM - Áp dụng quy trình 12 mẫu dịch phết cổ tử cung: cho kết dương tính mẫu nhiễm HPV 18, âm tính mẫu nhiễm HPV 16, HPV 51+52 mẫu khơng nhiễm HPV Có phản ứng chéo với mẫu nhiễm HPV 35 Xây dựng quy trình immuno-PCR phát protein E7 HPV 18: - Nồng độ kháng thể “bắt giữ” 1D5 20 µg/ml - Nồng độ kháng thể “phát hiện” 4H5 µg/ml - Nồng độ DNA-biotin 25 pg/ml, streptavidin 10 µg/ml - Tác nhân khóa giếng sữa gầy %, có bổ sung 0,1 mg/ml DNA tinh trùng cá hồi - Sử dụng realtime immuno-PCR để ghi nhận tín hiệu nhân - Realtime immuno-PCR E7 HPV 18 tái tổ hợp đạt độ nhạy 0,1 ng/ml (tương đương pg/mẫu); khơng có phản ứng chéo với protein E7 HPV 16/11/6 66 Phần 4: Kết luận – Đề nghị ĐỀ NGHỊ - Tiến hành thử nghiệm quy trình hóa tế bào miễn dịch xây dựng số lượng mẫu bệnh phẩm UTCTC lớn để xác định độ nhạy độ đặc hiệu quy trình - Tối ưu thêm yếu tố thành phần phản ứng PCR, thay đổi dạng immuno-PCR phổ biến sang dạng immuno-PCR có DNA marker gắn trực tiếp lên kháng thể “phát hiện” nhằm tăng độ nhạy đồng thời giảm bớt thời gian thực độ phức tạp quy trình Thử nghiệm quy trình mẫu bệnh phẩm UTCTC 67 Phụ lục PHỤ LỤC Phụ lục 1: Kết ELISA xác định nồng độ kháng thể “bắt giữ” tối ưu Nồng độ 1D5 (µg/ml) 40 20 10 2.5 1.25 0.625 µg/ml OD 405 trung STD binh 2.921 0.136 2.862 0.036 2.650 0.212 2.453 0.080 2.036 0.023 0.466 0.165 0.096 0.001 0.064 0.001 Nồng độ E7 HPV 18 2.5 µg/ml 1.25 µg/ml 0.625 µg/ml 0.375 µg/ml OD 405 OD 405 OD 405 OD 405 trung STD trung STD trung STD trung STD binh binh binh binh 2.813 0.065 2.543 0.049 2.209 0.045 1.127 1.530 2.745 0.033 2.482 0.042 2.183 0.086 1.135 1.483 2.618 0.099 2.335 0.078 1.917 0.163 1.040 1.241 2.383 0.037 2.134 0.025 1.829 0.064 0.946 1.248 1.801 0.052 1.552 0.085 1.132 0.115 0.623 0.719 0.516 0.108 0.448 0.210 0.235 0.097 0.166 0.097 0.085 0.003 0.089 0.002 0.076 0.006 0.041 0.049 0.073 0.020 0.058 0.001 0.059 0.005 0.032 0.038 76 Phụ lục Phụ lục 2: Kết ELISA xác định nồng độ kháng thể “phát hiện” tối ưu Nồng độ 4H5-biotin (µg/ml) 20 10 2.5 1.25 0.625 0.3125 1/1000 OD 405 trung STD binh 3.051 0.076 3.048 0.065 2.965 0.069 2.719 0.088 2.051 0.081 1.244 0.169 0.581 0.075 0.056 0.001 Độ pha loãng streptavidin - alkaline phosphatase 1/2000 1/4000 1/8000 OD 405 OD 405 OD 405 trung STD trung STD trung STD binh binh binh 2.195 0.047 0.224 0.008 0.087 0.006 2.148 0.070 0.256 0.045 0.089 0.007 2.129 0.091 0.250 0.021 0.086 0.006 1.887 0.004 0.243 0.026 0.081 0.005 1.607 0.007 0.187 0.045 0.074 0.001 1.147 0.026 0.138 0.022 0.067 0.000 0.683 0.023 0.100 0.022 0.064 0.005 0.057 0.003 0.055 0.002 0.058 0.005 77 1/16000 OD 405 trung STD binh 0.068 0.002 0.069 0.004 0.069 0.001 0.065 0.001 0.066 0.004 0.062 0.003 0.062 0.004 0.057 0.001 Phụ lục Phụ lục 3: Kết ELISA xác định nồng độ STV-AP tối ưu Độ pha loãng STV-AP 1/1000 1/2000 1/4000 1/8000 1/16000 20 (µg/ml) OD 405 trung STD binh 3.051 0.076 2.195 0.047 0.224 0.008 0.087 0.006 0.068 0.002 0.057 0.001 Nồng độ kháng thể 4H5-biotin (µg/ml) 10 (µg/ml) (µg/ml) 2.5 (µg/ml) 1.25 (µg/ml) OD 405 OD 405 OD 405 OD 405 trung STD trung STD trung STD trung STD binh binh binh binh 3.048 0.065 2.965 0.069 2.719 0.088 2.051 0.081 2.148 0.070 2.129 0.091 1.887 0.004 1.607 0.007 0.256 0.045 0.250 0.021 0.243 0.026 0.187 0.045 0.089 0.007 0.086 0.006 0.081 0.005 0.074 0.001 0.069 0.004 0.069 0.001 0.065 0.001 0.066 0.004 0.058 0.001 0.058 0.001 0.060 0.004 0.057 0.000 78 Tài liệu tham khảo TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT [1] Ngô Thái Bích Vân, Bùi Hồng Bảo Ngọc, Nguyễn Vũ Trung Kiên, Trần Lê Sơn, Hồ Huỳnh Thùy Dương (2010), Tạo dòng biểu protein E7 Human papillomavirus type 18, 16, 11 tế bào CHO-K1, Tạp chí Cơng nghệ sinh học, 8(3A), pp 673-678 [2] Nguyễn Vũ Trung Kiên, Cao Minh Thư, Hồ Huỳnh Thùy Dương (2008), Tạo dòng biểu protein E7 từ papillomavirus 18 người, Hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ IV, pp 707-710 [3] Trần Lê Sơn, Nguyễn Vũ Trung Kiên, Ngô Thái Bích Vân, Bùi Hồng Bảo Ngọc, Trần Đặng Ngọc Linh, Phạm Xuân Dũng, Nguyễn Chấn Hùng, Jean-Luc Teillaud, Hồ Huỳnh Thùy Dương (2010), Tạo kháng thể đơn dòng kháng protein E7 virus gây u nhú (Human papillomavirus) type 18, Tạp chí Cơng nghệ sinh học, 8(4), pp 1793-1800 TÀI LIỆU TIẾNG ANH [4] Adler M (2005), Immuno-PCR as a clinical laboratory tool, Advances in Clinical Chemistry, 39, pp 239-292 [5] Adler M and Spengler M (2009), Novel strategies and tools for enhanced sensitivity in routine biomolecule analytics, Current Pharmaceutical Analysis, 5(4), pp 390-407 [6] Allen R.C., Rogelj S., Cordova S.E., Kieft T.L (2006), An immuno-PCR method for detecting Bacillus thuringiensis Cry1Ac toxin, Journal of immunological methods, 308(1-2), pp 109-15 [7] Anderson E.R (2005), Medical malpractice: A physician’s sourse book Humana Press 68 Tài liệu tham khảo [8] Babu D., Muriana P.M (2011), Immunomagnetic bead-based recovery and real time quantitative PCR (RT iq-PCR) for sensitvie quantification of aflatoxin B1, Journal of microbiological methods, 86(2), pp 188-94 [9] Barletta J.M., Edelman D.C., Constantine N.T (2004), Lowering the detection limits of HIV-1 viral load using realtime immuno-PCR for HIV-1 p24 antigen, American journal of clinical pathology, 122(1), pp 20-7 [10] Beatty J.D., Beatty B.G., Vlahos W.G (1987), Measurement of monoclonal antibody affinity by non-competitive enzyme immunoassay, Journal of immunological methods, 100(1-2), pp 173-9 [11] Beutner K.R., Tyring S (1997), Human papillomavirus and Human disease The American Journal of Medicine, 102 (5A), pp 9–15 [12] Boenicsh T (2001), Immunochemical staining handbook 3rd edition, Dako [13] Boulet G., Horvath C., Broeck D.V., Sahebali S., Bogers J (2007), Human papillomavirus: E6 and E7 oncogenes The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 39, pp 2006–2011 [14] Bristow E R., Montz F.J (1998), Human papillomavirus: Molecular biology and screening applications in cervical neoplasia—A primer forprimary care physicians, Primary Care Update Ob/Gyn, 5, pp 238–246 [15] Burd E.M (2007), Human Papillomavirus detection and ultility of testing Clinical Microbiology Newsletter, 29 (21), pp 159-167 [16] Burry R.W (2009), Immunocytochemistry: A practical guide for biomedical research Springer [17] Case M.C., Burt A.D., Hughes J., Palmer J.M., Collier J.D., Bassendine M.F., Yeaman S.J., Hughes M.A., Major G.N (1999), Enhanced ultrasensitive detection of structurally diverse antigens using a single immuno-PCR assay protocol, Journal of immunological methods, 223(1), pp 93-106 [18] Chao H.Y., Wang Y.C., Tang S.S., Liu H.W (2004), A highly sensitive immuno-polymerase chain reaction assay for Clostridium botulinum neurotoxin type A, Toxicon, 43(1), pp 27-34 69 Tài liệu tham khảo [19] Crowther J.R (2001), The ELISA guidebook Humana Press [20] Deng MJ, Xiao XZ, Zhang YM, Wu XH, Zhu LH, Xin XQ, Wu DL (2011), A highly sensitive immuno-PCR assay for detection of H5N1 avian influenza virus, Molecular biology reports, 38(3), pp 1941-8 [21] Di Bonito P., Grasso F., Mochi S., Accardi L (2006), Serum antibody response to Human papillomavirus (HPV) infections detected by a novel ELISA technique based on denatured recombinant HPV 16 L1, L2, E4, E6 and E7 proteins, Infectious Agents and Cancer, 1(6) [22] Dolinsky C., Hill-Kayser C (2009), Cervical cancer: the basic, Oncolink [23] Doorbar J (2006), Molecular biology of human papillomavirus infection and cervical cancer, Clinical Science, 110, pp 525–541 [24] Feilder M., Müller-Holzner E.,Viertler H-P (2004), High level HPV-16 E7 oncoprotein expression correlates with reduced pRb-levels in cervical biopsies, The FASEB Journal [25] Frazer I., Dunn L., Tindle R.W., Fernando G (1995), Immunoassay for cervical cancer, World Intellectual Property Organization [26] GlaxoSmithKline (2007), Cervical cancer key facts [27] Haugland R.P., You W.W (2008), Coupling of antibodies with biotin, Methods in molecular biology, 418, pp 13-24 [28] Hendrickson E.R., Truby T.M, Joerger R.D., Majarian W.R., and Ebersole R.C (1995), High sensitivity multianalyte immunoassay using covalent DNAlabeled antibodies and polymerase chain reaction, Nucleic acids research , 23(3), pp 522–529 [29] Herdman C., Sherris J (2000), Planning appropriate cervical cancer prevention programs, Program for Appropriate Technology in Health [30] Hirsch J.D and Haugland R.P (2005), Conjungation of antibodies to biotin, Methods in Molecular Biology, 295, pp 135-154 70 Tài liệu tham khảo [31] Hoory T., Monie A., Gravitt P., Wu T.C (2008), Molecular Epidemiology of Human Papillomavirus, Journal of the Formosan Medical Association, 107 (3), pp 198–217 [32] Jeon J.H., Shin D.M., Cho S.Y., Song K.Y., Park N.H., Kang H.S., Kim Y.D., Kim I.G (2007), Immunocytochemistry detection of HPV 16 E7 in cervical smear, Experimental & molecular medicine, 39(5), pp 621-8 [33] Joerger R.D., Truby T.M., Hendrickson E.R., Young R.M., Ebersole R.C (1995), Analyte detection with DNA-labeled antibodies and polymerase chain reaction, Clinical chemistry, 41(9), pp.1371-7 [34] Klaes R., Friedrich T., Spitkovsky D., Ridder R., Rudy W., Petry U., Dallenbach-Hellweg G., Schmidt D., von Knebel Doeberitz M (2001), Overexpression of p16ink4a as a specific marker for dysplastic and neoplastic epithelial cells of the cervix uteri, International journal of cancer, 92(2), pp 27684 [35] Kumar G.L and Rudbeck L (2008), Demasking of antigens 2nd edition, Dako [36] Liang H., Cordova S.E., Kieft T.L., Rogelj S (2003), A highly sensitive immuno-PCR assay for detecting group A Streptococcus, Journal of immunological methods , 279(1-2), pp 101-10 [37] Lind K., Kubista M (2005), Development and evaluation of three real-time immuno-PCR assemblages for quantification of PSA, Journal of immunological methods, 308(1-2), pp.109-15 [38] Malou N and Rsoult D (2011), Immuno-PCR: a promising ultrasensitive diagnostic method to detect antigens and antibodies, Trends in microbiology, 19 (6), pp 295-302 [39] McLaughlin-Drubin M and Münger K (2009), Oncogenic activities of Human papillomaviruses, Virus research, 143(2), pp 195–208 [40] McLaughlin-Drubin M.E., Münger K (2008), The human papillomavirus E7 oncoprotein, Virology, 384, pp 335–344 71 Tài liệu tham khảo [41] McNicol A.M and Richmond J.A Optimizing immunohistochemistry: antigen retrieval and signal amplification, Histopathology, 32(2), pp 97-103 [42] Moody C.A, Laimins L.A (2010), Human papillomavirus oncoproteins: pathways to transformation, Nature reviews Cancer, 10(8), pp 550-60 [43] Mũnoz N., Castellsagué X., Berrington de González A., Gissmann L (2006), HPV in the etiology of human cancer, Vaccine, 24S3, pp S3/1–S3/10 [44] Niemeyer C.M., Adler M., Wacker R (2005), Immuno-PCR: high sensitivity detection of proteins by nucleic acid amplification, Trends in biotechnology, 23(4), pp 208-16 [45] Niemeyer C.M., Adler M., Wacker R (2007), Detecting antigen by quantitative immuno-PCR, Nature protocols, 2(8), pp.1918-30 [46] Nishimura A., Nakahara T., Ueno T., Sasaki K., Yoshida S., Kyo S., Howley P.M., Sakai H (2006), Requirement of E7 oncoprotein for viability of HeLa cells, Microbes and infection, 8(4), pp 984-93 [47] Ohlson S., Strandh M., Nilshans H (1997), Detection and characterization of weak affinity antibody antigen recognition with biomolecular interaction, Journal of molecular recognition, 10(3), pp 135-8 [48] Pagliusia S.R., Garland S.M (2007), International standard reagents for HPV detection, Disease Markers, 23, pp 283–296 [49] Parkin M., Bray F., Ferlay J., Pisani P (2005), Global Cancer Statistics, A Cancer Journal for Clinicians, 55, pp 74-108 [50] Peroni L.A., Reis J.R., Coletta-Filho H.D., de Souza A.A., Machado M.A., Stach-Machado D.R (2008), Assessment of the diagnostic potential of immunocapture-PCR and immuno-PCR for Citrus Variegated Chlorosis, Journal of microbiological methods, 75(2), pp 302-7 [51] Ramos-Vara J.A (2005), Technical aspects of immunohistochemistry, Veterinary pathology, 42(4), pp 405-26 [52] Ramos-Vara J.A (2011), Principles and methods of immunohistochemistry, Methods in molecular biology, 691, pp 83-96 72 Tài liệu tham khảo [53] Ramos-Vara J.A., Kiupel M., Baszler T., Bliven L., Brodersen B., Chelack B., Czub S., Del Piero F., Dial S., Ehrhart E.J., Graham T., Manning L., Paulsen D., Valli V.E., West K (2008), Suggested guidelines for immunohistochemical techniques in veterinary diagnostic laboratories, Journal of veterinary diagnostic investigation: official publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, 20(4), pp 393-413 [54] Ressler S., Scheinden R., Dreier K (2007), High-risk Human Papillomavirus E7 Oncoprotein Detection in Cervical Squamous Cell Carcinoma Clinical Cancer Research, 13 (23), pp 7067-7072 [55] Roger B.P., Schweizer J., Weigl B (2006), A magnetic immunochromatographic strip test for detection of Human papillomavirus 16 E6 Clinical chemistry [56] Sano T., Smith C.L and Cantor C.R (1992), Immuno-PCR: very sensitive antigen detection by means of specific antibody-DNA conjugates, Science, 258, 120-122 [57] Schorge J.O., Lea J.S., Elias K.J., Rajanbabu R., Coleman R.L., Miller D.S., Ashfaq R (2004), p16 as a molecular biomarker of cervical adenocarcinoma, American journal of obstetrics and gynecology, 190(3), pp 668-73 [58] Sehr P., Muller M., Hopfl R., Widschwendter., Pawlita M (2002), HPV antibody detection by ELISA with capsid protein L1 fused to glutathione Stransferase, Journal of Virological Methods, 106, pp 61 – 70 [59] Selvey L.A., Dunn L.A., Murray B., Tindle R.W., Frazer I.H (1992), An ELISA capture assay for the E7 transforming proteins of HPV 16 and HPV 18, Journal of Virological Methods, 37, pp 119-128 [60] Sherman M.E (2003), Future Directions in Cervical Pathology, Journal of the National Cancer Institute Monographs, 31, pp 72–9 [61] Spitzer M (1996), Pap smears Medical Update for Psychiatrists, 1(3), pp 97-100 73 Tài liệu tham khảo [62] Stanley M (2008), Immunobiology of HPV and HPV vaccines, Gynecologic Oncology, 109, pp S15–S21 [63] To T.V (2005), Cervical cancer status in Vietnam, Gynecologic oncology, 99(3 Suppl 1), pp S197-8 [64] Valkova B, Ormerod M G, Moncrieff D, and Coleman D V (1984), Epithelial membrane antigen in cells from the uterine cervix: immunocytochemical staining of cervical smears, Journal of clinical pathology, 37(9), pp 984–989 [65] Wacker R., Ceyhan B., Alhorn P., Schueler D., Lang C., Niemeyer C.M (2007), Magneto immuno-PCR: a novel immunoassay based on biogenic magnetosome nanoparticles, Biochemical and biophysical research communications, 357(2), pp 391-6 [66] Walts A.E., Bose S (2009), p16, Ki-67, and BD ProExTMC immunostaining: a practical approach for diagnosis of cervical intraepithelial neoplasia, Human pathology, 40(7), pp 957-64 [67] World Health Organization (2002), Cervical cancer screening in developing countries, World Health Organization [68] World Health Organization (2006), Comprehensive cervical cancer control: A guide to essential practice, World Health Organization [69] Wright T.C.J (2006), HPV DNA Testing for Cervical Cancer Screening, International journal of gynecology & obstetrics, 95 (1), pp S239-S246 [70] Zhou H., Fisher R.J., and Papas T.S (1993), Universal immuno-PCR for ultra-sensitive target protein detection, Nucleic acids research, 21(25), pp 6038– 6039 [71] zur Hausen H (1996), Papillomavirus infections - a major cause of human cancers, Biochimica et Biophysica Acta, 1288, pp F55-F78 TÀI LIỆU INTERNET [72] http://www.cancer.gov/cancertopics/types/cervical 74 Tài liệu tham khảo [73] http://www.piercenet.com/Objects/view.cfm?type=Page&ID=9122CD3E- DB9E-49DC-AB0C-E9486F24B5F9 75 ... 3.1 XÂY DỰNG QUY TRÌNH HĨA TẾ BÀO MIỄN DỊCH PHÁT HIỆN PROTEIN E7 CỦA HPV 18 Chúng tơi xây dựng quy trình hóa tế bào miễn dịch gián tiếp, tức sử dụng kháng thể thứ cấp có đánh dấu enzyme để phát. .. (1992) xây dựng quy trình ELISA phát E7 HPV 16 18 dịng tế bào ni cấy [59], cơng trình Frazer cộng (1995) xây dựng thử nghiệm miễn dịch để phát UTCTC [25], cơng trình Roger cộng (2006) phát triển... phịng thí nghiệm, chúng tơi tạo kháng thể đơn dòng (KTĐD) 1D5 4H5 kháng protein E7 HPV type 18 Mục tiêu đề tài tiến hành xây dựng thử nghiệm miễn dịch bao gồm kĩ thuật hóa tế bào miễn dịch (immunocytochemistry)