Xây dựng các thử nghiệm miễn dịch phát hiện protein e7 của human papilloamvirus type 18

Khái niệm Kĩ thuật hóa tế bào miễn dịch là sự kết hợp giữa phản ứng miễn dịch của kháng nguyên – kháng thể và phản ứng hóa học để phát hiện một protein mục tiêu in situ trong tế bào bằn

[\

BÙI HOÀNG BẢO NGỌC

XÂY DỰNG CÁC THỬ NGHIỆM MIỄN DỊCH

PHÁT HIỆN PROTEIN E7 CỦA HUMAN PAPILLOMAVIRUS TYPE 18

CHUYÊN NGÀNH: DI TRUYỀN

MÃ SỐ: 60 42 70

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS TS HỒ HUỲNH THÙY DƯƠNG

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – NĂM 2011

LỜI CÁM ƠN

Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Hồ Huỳnh Thùy Dương, người đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành đề tài này

Tôi chân thành cám ơn anh Trần Lê Sơn, chị Nguyễn Thái Hoàng Tâm, anh Trần Quốc Vũ, bạn Nguyễn Thị Mỹ Nương, em Phạm Trần Đăng Thức ở Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử - Bộ môn Di truyền – Khoa sinh học – Đại học Khoa học

tự nhiên đã luôn ủng hộ, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài này

Cám ơn các bạn Diễm Trang, Thanh Minh, Ngọc Thùy, Mỹ Anh, Thu Trang

đã luôn ở bên cạnh tôi những lúc tôi gặp khó khăn trong quá trình thực hiện đề tài

Và trên tất cả, con xin cám ơn ba mẹ và gia đình đã luôn yêu thương, tạo mọi điều kiện cho con trong học tập cũng như trong cuộc sống

Bùi Hoàng Bảo Ngọc

viii

LỜI MỞ ĐẦU

Nếu như cứ mỗi 3 phút có 1 người trên thế giới chết vì ung thư phổi thì cứ mỗi 2 phút có 1 phụ nữ chết vì ung thư cổ tử cung Ở Mỹ, trong năm 2009 ước tính

có khoảng 12.000 phụ nữ mắc ung thư cổ tử cung Với tỉ lệ 26 ca trên 100.000 phụ

nữ, ung thư cổ tử cung đã trở thành nguyên nhân ung thư gây tử vong hàng đầu cho phụ nữ ở Việt Nam cũng như các nước đang phát triển

Khuyến cáo ung thư cổ tử cung năm 2009 đã xác định phòng ngừa là chìa khóa then chốt trong cuộc chiến chống căn bệnh này Do đó, một phương pháp tầm soát hiệu quả căn bệnh này sẽ giúp ngăn ngừa và giảm tỉ lệ tử vong do nó gây ra

Khoảng 95 % các trường hợp ung thư cổ tử cung là có liên quan đến Human papillomavirus (HPV) Nhiều nghiên cứu đã cho thấy có mối liên hệ mật thiết giữa

việc nhiễm lâu dài một số chủng “có nguy cơ cao”, đặc biệt là HPV type 16 và HPV type 18, với khả năng phát triển bệnh ung thư cổ tử cung Do đó, dựa vào mối quan

hệ này, ta có thể phát triển các phương pháp chẩn đoán để phát hiện sớm khả năng gây ung thư của HPV, từ đó đưa ra các phương pháp điều trị hiệu quả

Từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành xây dựng các công cụ miễn dịch dựa trên kháng thể đơn dòng nhằm phát hiện protein E7 HPV 18, là một protein gây ung thư (oncoprotein) đóng vai trò quan trọng trong cơ chế phát sinh ung thư của HPV Các công cụ chẩn đoán này sẽ góp phần hoàn thiện công tác phòng ngừa và điều trị ung thư cổ tử cung ở Việt Nam và trên thế giới

vii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 3.1 Kết quả realtime immuno-PCR với protein E7 HPV 18 tái tổ hợp 62 

Bảng 3.2 Kết quả phân tích đường cong nóng chảy 63 

Bảng 3.3 Kết quả ELISA với protein E7 HPV 18 tái tổ hợp 63 

Bảng 3.4 Kết quả realtime immuno-PCR trên protein E7 HPV 18/16/11/6 65 

E’MEM : Eagle’s minimum essential media

EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid

EGFP : Enhanced green fluorescent protein

ELISA : Enzyme-linked immunosorbent assay

FBS : Fetal bovine serum

KTĐD : Kháng thể đơn dòng

HEPES : 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid

HPV : Human papillomavirus

LCR : Long control region

mAb : Monoclonal antibody

OD : Optical density

PBS : Phosphate buffered saline

PCR : Polymerase chain reaction

PFA : Paraformaldehyde

PLL : Poly – L – lysine

pRB : Retinoblastoma tumor suppressor protein

STD : Standard deviation

URR : Upstream regulatory region

UTCTC : Ung thư cổ tử cung

v

DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ

Trang

Hình 1.1 Cấu trúc bộ gene của HPV 3 

Hình 1.2 Cấu trúc của protein E7 5 

Hình 1.3 Tác động của protein E7 lên các quá trình nội bào 6 

Hình 1.4 Hệ thống phát hiện trực tiếp 13 

Hình 1.5 Hệ thống avidin-biotin 13 

Hình 1.6 Hệ thống polymer – kháng thể thứ cấp – enzyme 14 

Hình 1.7 ELISA và immuno PCR Nguyên lý và độ nhạy của hai phương pháp 15 

Hình 1.8 Immuno-PCR cổ điển, sử dụng protein lai giữa protein A và streptavidin 17 

Hình 1.9 Immuno-PCR phổ biến 18 

Hình 1.10 Sơ đồ mô tả đoạn DNA marker được gắn cộng hợp vào kháng thể 19 

Hình 1.11 Immuno-PCR trực tiếp 20 

Hình 1.12 Immuno-PCR sử dụng các hạt từ phủ kháng thể 21 

Hình 1.13 Immuno-PCR sử dụng “bio-barcode” 21 

Hình 1.14 Immuno-PCR sử dụng LG protein và hệ thống phát hiện Tus-Ter 22 

Hình 2.1 Buồng đếm hồng cầu 31 

Hình 2.2 Sơ đồ phương pháp ELISA 38 

Hình 2.3 Sơ đồ phương pháp checkerboard 38 

Hình 2.4 Sơ đồ phương pháp immuno-PCR 39 

Hình 3.1 Mô hình phương pháp lai hóa tế bào miễn dịch sử dụng trong đề tài 41 

Hình 3.2 Lai hóa tế bào miễn dịch sử dụng KTĐD 1D5 trên dòng tế bào HeLa và C33A với các nồng độ kháng thể 10 µg/ml (A1, A2), 5 µg/ml (B1, B2), 2,5 µg/ml (C1, C2) 42 

Hình 3.3 Lai hóa tế bào miễn dịch sử dụng KTĐD 4H5 trên dòng tế bào HeLa và C33A với các nồng độ kháng thể 10 µg/ml (A1, A2), 5 µg/ml (B1, B2), 2,5 µg/ml (C1, C2) 43 

vi

Hình 3.4 Lai hóa tế bào miễn dịch sử dụng kháng thể 1D5 (10 µg/ml) trên các dòng

tế bào HeLa (A), C33A (B), K1 chuyển vector pEGFP-E7HPV18 (C),

CHO-K1 chuyển vector pEGFP-C2 (D), CaSki (E) 44 

Hình 3.5 Lai hóa tế bào miễn dịch sử dụng kháng thể 4H5 (10 µg/ml) trên các dòng tế bào HeLa (A), C33A (B), K1 chuyển vector pEGFP-E7HPV18 (C), CHO-K1 chuyển vector pEGFP-C2 (D), CaSki (E) 45 

Hình 3.6 Lai hóa tế bào miễn dịch trên dòng tế bào HeLa với kháng thể 1D5 (10 µg/ml), sử dụng tác nhân bộc lộ kháng nguyên là citrate pH 6 10 mM (A), EDTA pH 8 1 mM (B), không xử lý với tác nhân bộc lộ kháng nguyên (C) 46 

Hình 3.7 Lai hóa tế bào miễn dịch trên mẫu tế bào HeLa (A), CaSki (B), C33A (C) xử lý theo phương pháp ly tâm và trải lên 47 

Hình 3.8 Lai hóa tế bào miễn dịch trên các mẫu tế bào dịch phết cổ tử cung 49 

Hình 3.9 Mô hình kĩ thuật immuno-PCR và ELISA sử dụng trong đề tài 50 

Hình 3.10 Đồ thị xác định hằng số ái lực của KTĐD 4H5-biotin với kháng nguyên E7 HPV 18 tái tổ hợp tinh sạch 53 

Hình 3.11 PCR tạo DNA đánh dấu biotin 54 

Hình 3.12 Đồ thị khảo sát nồng độ kháng thể “bắt giữ” 1D5 55 

Hình 3.13 Đồ thị khảo sát nồng độ kháng thể “phát hiện” 4H5-biotin 56 

Hình 3.14 Đồ thị khảo sát nồng độ STV-AP 57 

Hình 3.15 Tối ưu hóa nồng độ DNA đánh dấu biotin sử dụng cho immuno-PCR 58 

Hình 3.16 Tối ưu hóa nồng độ streptavidin sử dụng cho immuno-PCR 59 

Hình 3.17 Tối ưu hóa tác nhân khóa giếng 60 

Hình 3.18 Kết quả immuno-PCR với protein E7 HPV 18 tái tổ hợp 61 

1

1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 UNG THƯ CỔ TỬ CUNG VÀ HUMAN PAPILLOMAVIRUS

1.1.1 Ung thư cổ tử cung

Trên thế giới, ung thư cổ tử cung (UTCTC) chiếm khoảng 12 % các ca ung thư ở phụ nữ, trở thành căn bệnh phổ biến thứ hai ở phụ nữ sau ung thư vú và phổ biến nhất ở các nước đang phát triển, trong đó có Việt Nam [67] Theo thống kê của

tổ chức Y tế thế giới (WHO), năm 2005 toàn cầu có khoảng 260.000 phụ nữ chết vì căn bệnh này, 95 % trong số đó là ở các nước đang phát triển [68] Tỉ lệ mắc bệnh cao nhất là ở các vùng cận Sahara Châu Phi, quần đảo Melanesia, Mỹ Latinh, Caribê, Nam Á và Đông Nam Á [49] Việt Nam là một nước đang phát triển nên tỉ

lệ mắc UTCTC thuộc vào loại cao trên thế giới (chiếm 13,03 % các loại ung thư – năm 2002) Tần suất ung thư có sự chênh lệch lớn giữa hai miền Nam - Bắc, ở thành phố Hồ Chí Minh là 28,8 trên 100.000 dân trong khi ở miền Bắc tần suất đó

là 6,8 [63]

Ung thư cổ tử cung phát triển khi các tế bào trong cổ tử cung bắt đầu tăng sinh không kiểm soát và sau đó có thể xâm lấn đến các mô lân cận hoặc lan rộng khắp cơ thể Thông thường, UTCTC phát triển chậm và không có triệu chứng rõ rệt mặc dù trong vài trường hợp nhất định nó có thể tăng sinh và lan rộng rất nhanh [22]

Ung thư cổ tử cung được mô tả dựa vào nguồn gốc loại tế bào phát sinh nên

nó Dạng phổ biến nhất của UTCTC là ung thư biểu mô tế bào vảy (chiếm khoảng

80 % các dạng UTCTC) Dạng phổ biến thứ hai là ung thư biểu mô tuyến Có khoảng 3-5 % các trường hợp UTCTC mắc phải cả hai dạng trên Ngoài ra còn một vài dạng hiếm gặp khác [22], [72]

Một trong những nguyên nhân chủ yếu dẫn đến UTCTC là do nhiễm lâu dài

một loại virus rất phổ biến và dễ lây nhiễm là Human papillomavirus (HPV) [26]

Tuy nhiên, chỉ một vài type HPV là có khả năng gây nên ung thư Thông thường, việc nhiễm HPV không hề gây ra bất cứ triệu chứng nào cho đến khi xuất hiện các tổn thương tiền ung thư ở cổ tử cung Ngoài ra còn có rất nhiều yếu tố nguy cơ khác

Human papillomavirus (HPV) thuộc họ Papillomaviridae, là nhóm virus gây

ra nhiều dạng tổn thương biểu mô khác nhau ở người Hiện đã có hơn 200 type HPV được xác định dựa trên phân tích trình tự DNA Trong đó có hơn 96 type đã được giải trình tự đầy đủ và ít nhất 100 type được giải trình tự một phần [23], [31]

Dựa vào sự liên quan của type HPV với mức độ tổn thương cổ tử cung và khả năng phát triển thành ung thư người ta chia các type xâm nhiễm vào biểu mô cổ

tử cung thành ba nhóm nhỏ [14], [62], [69]:

- Nhóm “có nguy cơ thấp” (low risk HPV): gồm các type 6, 11, 40, 42, 43, 44,

54, 61, 70, 72, 81, 89; trong đó phổ biến nhất là HPV 6 và HPV 11 Nhóm HPV có nguy cơ thấp thường liên quan tới các mụn nhọt sinh dục hoặc các tổn thương biểu

mô tế bào vảy mức độ nhẹ, nhưng hiếm khi gây ra ung thư xâm lấn

- Nhóm “có nguy cơ cao” (high risk HPV): gồm các type 16, 18, 31, 33, 35,

39, 45, 51, 52, 56, 58, 59; lây truyền qua đường tiếp xúc tình dục Nếu nhiễm lâu dài các type HPV thuộc nhóm này sẽ có nguy cơ mắc UTCTC rất cao HPV 16 và HPV 18 chịu trách nhiệm cho hơn 70 % các ca UTCTC trên toàn thế giới

- Nhóm “có nguy cơ trung gian” (intermediate HPV): gồm các type 26, 53, 66,

68, 73, 82 Nhóm này có liên quan đến các tổn thương biểu mô mức độ cao nhưng hiếm khi tìm thấy trong các trường hợp ung thư xâm lấn Trường hợp HPV 53 lại thường xuyên được tìm thấy trong các phụ nữ không mắc ung thư

Vùng gene muộn (late gene): dài khoảng 2.500 cặp base, gồm 2 ORF mã hóa cho 2 protein cấu trúc là protein vỏ capsid chính (L1) và protein vỏ capsid phụ (L2), được tạo ra trong giai đoạn muộn của chu trình sống của virus, dùng để đóng gói virion

Vùng điều hòa dài (long control region – LCR) hay còn gọi là vùng điều hòa thượng nguồn (upstream regulatory region – URR): nằm kế bên vị trí khởi đầu sao

mã của virus, dài khoảng 1.000 cặp base, không mã hóa cho protein, gồm nhiều vị trí gắn chồng lấp của các nhân tố điều hòa phiên mã như NF-1, AP1, KRF-1, Oct-l, SP-1, YY-1 và thụ thể của glucocorticoid Vùng URR này điều hòa quá trình sao

mã, phiên mã của các gene sớm, gene muộn cũng như quá trình xâm nhiễm của virus [11], [14], [43], [71]

Hình 1.1 Cấu trúc bộ gene của HPV [43]

4

1.1.2.4 Cơ chế gây ung thư của HPV

Tất cả các type HPV đều phân chia trong nhân của tế bào chủ Đối với nhóm HPV chỉ gây ra các tổn thương lành tính thì DNA bộ gene của virus tồn tại độc lập với DNA của tế bào chủ và nhân đôi như dạng episome hoặc plasmid Ngược lại, trong các tổn thương ác tính liên quan tới HPV 16 và HPV 18 thì DNA virus lại thường sát nhập vào bộ gene của tế bào chủ

Để có thể sáp nhập vào bộ gene tế bào chủ thì phải xảy ra một sự đứt gãy trên bộ gene virus, thường là ở vùng E1/E2 Sự đứt gãy này dẫn tới việc mất chức năng của gene E1 và E2, từ đó mất kiểm soát sự biểu hiện của E6 và E7, làm cho tế bào bị biến đổi Vị trí sát nhập vào bộ gene tế bào chủ khá ngẫu nhiên và dường như không có vai trò nhiều trong quá trình phát sinh ung thư

Hoạt tính gây ung thư của E6 và E7 chủ yếu là do khả năng tương tác với các protein nội bào có vai trò điều hòa kiểm soát chu trình tế bào như p53 và pRB Hai protein này được biết như là các protein ức chế khối u vì nó ức chế sự phân chia và tăng trưởng của tế bào Việc E6 gắn lên p53 và E7 gắn lên pRB dẫn đến sự phân hủy hai protein này, làm mất chức năng kiểm soát sự tăng trưởng tế bào của chúng

và gây phát sinh ung thư [11]

1.2 PROTEIN E7 CỦA HPV VÀ UTCTC

5

Leu-X-Cys-X-Glu (LXCXE) cần cho sự gắn kết giữa E7 và pRB Kế motif

LXCXE là một vị trí phosphoryl hóa của kinase casein II (CK II) cần cho hoạt động biến đổi tế bào của E7 Vùng CR3 chứa một cấu trúc gắn kẽm gồm hai motif

nào cho thấy rằng E7 tồn tại in vivo hay in vitro ở dạng dimer cũng như dạng dimer này là cần thiết cho hoạt tính sinh học của E7 Cấu trúc motif này tương tự như protein E6 của HPV, từ đó có thể suy ra hai protein này có một tổ tiên chung

Các nghiên cứu cấu trúc của E7 chứng minh là vùng CR1 và CR2 của E7 không gấp cuộn trong khi vùng CR3 gấp cuộn thành dạng cấu trúc gắn kẽm đặc trưng [40]

1.2.2 Vai trò của protein E7 trong UTCTC

Bên cạnh protein E6, E7 cũng là một nhân tố gây ung thư chính của các type HPV có nguy cơ cao E6 và E7 là hai protein virus duy trì sự biểu hiện và hoạt tính của chúng trong suốt chu trình sống của virus cũng như quá trình phát sinh ung thư E7 có vai trò quan trọng trong hoạt động làm bất tử hóa, chuyển dạng tế bào, cảm ứng sự hình thành khối u ở các tế bào biểu mô thông qua 3 cơ chế chính

1.2.2.1 Tác động lên sự tăng trưởng và phân chia của tế bào

Theo một số nghiên cứu, protein E7 được tìm thấy chủ yếu trong nhân, nơi

mà nó liên kết với pRB cũng như các protein thuộc họ “pocket protein” như p107

CR3

Hình 1.2 Cấu trúc của protein E7 [40]

6

và p130 thông qua motif LXCLE trên CR2, để kích thích tế bào tiến vào pha S Trong tế bào bình thường, các pRB được phosphoryl hóa vào giai đoạn sớm của pha G1 và gắn với nhân tố phiên mã E2F - một tác nhân điều hòa quan trọng cho quá trình tế bào thóat khỏi pha G1 và tiến vào pha S – hình thành một phức hợp ức chế phiên mã Bằng cách gắn vào và cảm ứng sự phân hủy pRB thông qua cơ chế hình thành các phức hợp ly giải protein (proteosomal), E7 ngăn cản pRB liên kết với E2F E2F tự do sẽ hoạt động như một nhân tố tăng cường phiên mã, kích thích tế bào vượt qua pha G1 và tiến vào pha S, từ đó tăng sinh một cách không kiểm soát

Protein E7 của các type HPV có nguy cơ thấp có khả năng gắn với pRB giảm gấp

10 lần so với E7 của các type HPV có nguy cơ cao Điều này là do sai khác một amino acid (ví dụ như aspartate ở vị trí thứ 21 trên E7 HPV 16 thay vì glycine ở vị trí 22 trên E7 HPV 6) và amino acid này là vị trí quyết định cho việc gắn pRB và khả năng làm biến đổi tế bào của E7 [13], [40]

Ngoài khả năng gắn và phân hủy pRB, các protein E7 của các type HPV có nguy cơ cao còn can thiệp vào chu trình phân bào bình thường bằng nhiều cơ chế khác như tương tác và làm dừng hoạt tính ức chế tăng trưởng của các chất ức chế kinase phụ thuộc cyclin (cyclin-dependent kinase inhibitors – CKI) p21 và p27 Các tương tác này làm gia tăng lượng cyclin E và A, từ đó dẫn đến tình trạng duy trì tổng hợp DNA trong các tế bào biểu mô đã biệt hóa [40]

Hình 1.3 Tác động của protein E7 lên các quá trình nội bào [42]

7

1.2.2.2 Ức chế apoptosis

Protein E7 của HPV còn có khả năng kích thích tăng sinh tế bào thông qua các cơ chế ức chế apoptosis Việc protein pRB bị bất hoạt bởi E7 sẽ cảm ứng con đường apoptosis phụ thuộc p53 Tuy nhiên, p53 lại là mục tiêu của E6, bị E6 cảm ứng phân hủy theo con đường phụ thuộc ubiquitin

Bên cạnh đó, HPV còn ức chế anoikis, một trong những con đường apoptosis chính, được cảm ứng khi tế bào cố tiến vào pha S dù đã mất tính bám dính tế bào Việc kháng lại anoikis được xem như dấu ấn quan trọng cho sự chuyển dạng của tế bào Protein E7 ngăn chặn anoikis thông qua tương tác với protein p600, là một protein ubiquitin ligase trong tế bào chất, liên kết với pRB Các thí nghiệm cho thấy tương tác giữ E7 và p600 có thể ức chế anoikis và bảo vệ các tế bào mất tính bám khỏi apoptosis

Ngoài ra, các protein E7 còn can thiệp vào tác động của rất nhiều cytokine

ức chế tăng trưởng như TGF-β và TNF-α TGF-β là một chất ức chế quan trọng lên

sự tăng trưởng của tế bào biểu mô và sự kháng lại hoạt tính của TGF- β là dấu hiệu của sự hình thành khối u ở biểu mô Quá trình kháng lại TGF- β ở các tế bào nhiễm HPV là một quá trình nhiều bước Thêm vào đó, các tế bào UTCTC nhiễm HPV cũng có khả năng kháng lại TNF-α, một chất cảm ứng quan trọng do tế bào T độc tiết ra đáp ứng lại sự nhiễm virus

Interferon (IFN) là chất được tiết ra để đáp ứng lại sự nhiễm virus Sự biểu hiện các gene IFN được cảm ứng bởi các nhân tố điều hòa IFN (IRF) Protein E7 đã cho thấy có khả năng tương tác và ức chế hoạt tính tăng cường phiên mã của nhân

tố IRF-1 Protein E6 cũng có thể gắn và ức chế hoạt động của nhân tố IRF-3 Ngoài

ra, protein E6 và E7 còn ức chế hoạt tính của STAT1, một nhân tố điều hòa phiên

mã quan trọng cho các gene IFN [39], [40], [42]

1.2.2.3 Gây mất tính ổn định của bộ gene

Việc biểu hiện E7 trong tế bào chủ làm cho bộ gene bị mất tính bền vững Bằng cách gia tăng lượng trung thể, E7 còn gây ra tình trạng số nhiễm sắc thể của tế

từ đó tăng khả năng chuyển dạng tế bào và phát sinh ung thư [42]

1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN UTCTC

1.3.1 Các phương pháp dựa trên cơ sở tế bào học

1.3.1.1 Xét nghiệm Pap (Pap smear)

Xét nghiệm Pap, hay còn được gọi là phết tế bào âm đạo - cổ tử cung, được phát triển từ những năm 1930 bởi một bác sĩ người Hy Lạp là George Papanicolaou Đây là một xét nghiệm tế bào học dùng để phát hiện các bất thường trong tế bào cổ

tử cung [29]

Phương pháp này hiện nay vẫn là phương pháp đầu tiên dùng để phát hiện ung thư có liên quan đến các type HPV có nguy cơ cao Các chương trình tầm soát dựa trên phương pháp này đã góp phần làm giảm một nửa đến hai phần ba tỉ lệ mắc UTCTC và tử vong do bệnh này và thậm chí giảm tới 90 % ở những nơi có các chương trình tầm soát tốt [15]

Tuy nhiên, do tính chủ quan của các tiêu chuẩn xét nghiệm nên phương pháp này vẫn còn nhiều hạn chế như:

- Kết quả phụ thuộc nhiều vào chất lượng thu và đọc mẫu tế bào [15]

- Cho tỉ lệ âm tính giả cao (15-25 %) do chưa đủ độ nhạy trong việc phát hiện hết các bất thường tế bào, do đó cần kiểm tra lại nhiều lần [7], [49]

- Đòi hỏi thời gian, kĩ thuật viên có tay nghề cao, không thể tiến hành với số lượng mẫu lớn [61]

9

1.3.1.2 Phương pháp Liquid based cytology

Phương pháp này còn gọi là phương pháp tế bào học bằng dung dịch được phát triển dựa trên xét nghiệm Pap, sử dụng một bàn chải cổ tử cung để thu mẫu Sau đó mẫu sẽ được cố định trong một dung dịch bảo quản và sau đó được đem đi phân tích Mẫu chuẩn bị theo phương pháp này dễ đọc và phân tích hơn vì nó có dạng lớp đơn tế bào nên hạn chế được trường hợp độ dày mẫu không đều, không có dịch nhầy, protein, hồng cầu, nấm men và vi khuẩn Hơn nữa, với phương pháp này

sẽ giúp thu hoàn toàn lượng tế bào bong ra [15], [60]

1.3.2 Các nghiên cứu phát hiện HPV dựa trên tương tác miễn dịch

1.3.2.1 Phát hiện kháng thể kháng HPV

Có rất nhiều thử nghiệm huyết thanh học để phát hiện kháng thể kháng HPV

đã được nghiên cứu như ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay), RIA (Radio immuno assay), ELISA cạnh tranh … Trên thực tế, kháng thể kháng HPV chỉ được

tìm thấy trong huyết thanh của 50 – 60 % những người có mang DNA HPV Ngoài huyết thanh, kháng thể kháng HPV còn có thể được tìm thấy trong dịch âm đạo hoặc buồng trứng

Các phương pháp phát hiện kháng thể thường nhắm vào kháng thể kháng protein vỏ capsid L1 như các nghiên cứu của Sehr và cộng sự (2002) [58] Tuy nhiên, thử nghiệm ELISA dựa trên VLP để phát hiện kháng thể kháng L1 không thể giúp phân biệt được việc nhiễm HPV là hiện tại hay trong quá khứ Các thử nghiệm nhằm phát hiện kháng thể kháng E6 và E7 cũng đang được phát triển [48]

1.3.2.2 Phát hiện các protein virus

Các protein gây ung thư của HPV hầu hết đều đã được phát hiện bằng phương pháp nhuộm miễn dịch mẫu tế bào hoặc mẫu mô bệnh phẩm bằng các kháng thể đơn dòng và đa dòng Các phương pháp hóa tế bào và hóa mô miễn dịch dùng để phát hiện E6 và E7 trong giai đoạn đầu của ung thư đang được nghiên cứu phát triển để trở thành các xét nghiệm nhanh dùng trong chẩn đoán [48] Ngoài ra,

10

có các công trình như của Selvey và cộng sự (1992) xây dựng quy trình ELISA phát hiện E7 HPV 16 và 18 trong các dòng tế bào nuôi cấy [59], công trình của Frazer và cộng sự (1995) xây dựng các thử nghiệm miễn dịch để phát hiện UTCTC [25], công trình của Roger và cộng sự (2006) phát triển một que thử miễn dịch để phát hiện E6 HPV 16 [55]

1.4 KĨ THUẬT HÓA TẾ BÀO MIỄN DỊCH (IMMUNOCYTOCHEMISTRY) 1.4.1 Khái niệm

Kĩ thuật hóa tế bào miễn dịch là sự kết hợp giữa phản ứng miễn dịch của kháng nguyên – kháng thể và phản ứng hóa học để phát hiện một protein mục tiêu

in situ trong tế bào bằng cách tạo ra một tín hiệu màu ghi nhận được khi quan sát

dưới kính hiển vi quang học [16]

Về cơ bản, kĩ thuật hóa tế bào miễn dịch có thể chia thành 4 bước chính:

- Toàn bộ các bước tiền xử lý trước khi ủ mẫu với kháng thể sơ cấp, bao gồm:

cố định mẫu, khóa các vị trí không đặc hiệu, khóa tín hiệu enzyme nội sinh, bộc lộ kháng nguyên

- Toàn bộ các phản ứng miễn dịch xảy ra giữa kháng thể và kháng nguyên mục tiêu trong mẫu, bao gồm: ủ kháng thể sơ cấp và kháng thể thứ cấp

- Phát hiện tương tác giữa kháng nguyên – kháng thể thông qua phản ứng hiện màu bằng cơ chất của eznyme

11

Có hai phương pháp cố định mẫu chủ yếu là phương pháp biến tính (denaturing) và phương pháp tạo liên kết chéo (cross linking) Phương pháp biến tính sử dụng nhiệt hoặc các dung môi hữu cơ Dạng cố định này phá hủy cấu trúc bậc 3 của protein bằng các phá vỡ các liên kết kị nước, làm cho các thành phần tế bào bị rửa trôi trong suốt quá trình cố định Phương pháp tạo liên kết chéo là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất hiện nay Tác nhân hóa học sử dụng để cố định sẽ tạo các liên kết chéo với các gốc hoạt động trên protein, lipid, giữ chúng ở nguyên vị trí ban đầu trong tế bào Tuy nhiên, quá trình cố định quá mức sẽ tạo nên một mạng lưới liên kết phân tử, ngăn chặn sự thâm nhập của kháng thể vào tế bào Tác nhân cố định chủ yếu sử dụng nhất trong lĩnh vực mô học hiện nay là paraformaldehyde [16]

Đối với các mẫu dịch phết tế bào, tác nhân cố định thường được sử dụng là ethanol 95 % Ethanol cho hiệu quả cố định tốt đối với hầu hết các loại kháng nguyên khác nhau [12]

1.4.2.2 Bộc lộ kháng nguyên (Antigen retrieval)

Quá trình cố định mẫu làm thay đổi cấu trúc bậc bốn của kháng nguyên, có thể làm mất đi khả năng nhận biết đặc hiệu của kháng thể đối với kháng nguyên Quá trình bộc lộ kháng nguyên cho phép hồi phục lại các biến đổi xảy ra trong quá trình cố định, giúp trả lại cấu hình ban đầu của kháng nguyên Sự cần thiết của việc tiến hành bộc lộ kháng nguyên không chỉ phụ thuộc vào loại kháng nguyên mục tiêu mà còn phụ thuộc vào kháng thể sử dụng Các kháng thể đa dòng thường vẫn duy trì được khả năng nhận biết kháng nguyên mục tiêu mà không cần xử lý bộc lộ kháng nguyên [51]

Có nhiều phương pháp bộc lộ kháng nguyên khác nhau:

- Sử dụng enzyme phân giải: các protease thường được sử dụng là trypsin, proteinase K, pronase, ficin và pepsin Phương pháp này làm phân giải các protein, tuy nhiên hoạt tính này là không đặc hiệu và có thể làm ảnh hưởng tới kháng

có thể khôi phục lại cấu hình của các protein sau quá trình cố định Có nhiều dung dịch và cách thức khác nhau được sử dụng để bộc lộ kháng nguyên ở nhiệt độ cao

từ 95oC đến 100oC Các dung dịch thường dùng nhất là citrate 10 mM pH 6, Tris-HCl 10 mM pH 1-10, EDTA pH 8 Có thể gia nhiệt bằng bể nước, lò vi sóng, nồi áp suất, nồi hấp… Đây là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất và cho hiệu quả tốt nhất đối với hầu hết các loại kháng nguyên

- Sử dụng chất tẩy: các chất tẩy như triton X100, tween 20, saponin cũng có thể được dùng để bộc lộ kháng nguyên [12], [35], [51], [53]

và peroxydase Có hai loại hệ thống phát hiện là phát hiện trực tiếp và phát hiện gián tiếp

™ Hệ thống phát hiện trực tiếp

Đây là dạng phát hiện đơn giản nhất được ứng dụng trong hóa tế bào miễn dịch Trong hệ thống phát hiện này, phân tử đánh dấu được gắn trực tiếp lên kháng thể sơ cấp, phản ứng chỉ xảy ra một bước Phương pháp này tiến hành nhanh chóng nhưng độ nhạy không cao

13

Hình 1.4 Hệ thống phát hiện trực tiếp [12]

™ Hệ thống phát hiện gián tiếp

Hệ thống này cho phép tăng độ nhạy của phương pháp phát hiện, sử dụng kháng thể sơ cấp không đánh dấu và kháng thể thứ cấp kháng kháng thể sơ cấp đánh dấu Có nhiều dạng biến đổi khác nhau của hệ thống gián tiếp:

- Hệ thống avidin – biotin: tận dụng tương tác đặc hiệu giữa avidin/streptavidin và biotin Có hai hệ thống phổ biến nhất đang được sử dụng là

hệ thống ABC và LAB hoặc LSAB Trong hệ thống ABC, kháng thể thứ cấp được đánh dấu biotin và sẽ được phát hiện bởi avidin và phức hợp biotin gắn cộng hợp với enzyme Còn với hệ thống LAB hay LSAB thì kháng thể thứ cấp đánh dấu biotin sẽ được phát hiện bởi phức hợp avidin/streptavidin gắn cộng hợp với enzyme

Hệ phát hiện này cho phép tăng độ nhạy của phản ứng nhưng lại có tín hiệu nền cao

Hình 1.5 Hệ thống avidin-biotin (a) ABC, (b) LAB hoặc LSAB [12]

16 trong dịch phết cổ tử cung [32] Valkova và cộng sự (1984) cũng tiến hành phát hiện các kháng nguyên màng của tế bào biểu mô trong dịch phết cổ tử cung [64] Các nghiên cứu của Fiedler và cộng sự (2004), Ressler và cộng sự (2007) tiến hành phát hiện protein E7 của HPV 16 trong mẫu sinh thiết cổ tử cung bằng phương pháp hóa mô miễn dịch [24], [54] Bên cạnh đó còn có rất nhiều công trình phát hiện

Kĩ thuật immuo-PCR được giới thiệu đầu tiên bởi Sano và cộng sự vào năm

1992 [56] Đây là kĩ thuật kết hợp giữa ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) và PCR (Polymerase chain reaction), tận dụng độ đặc hiệu của tương tác kháng nguyên – kháng thể trong ELISA và độ nhạy của phản ứng PCR để tạo ra một công cụ cho phép phát hiện các protein hiện diện ở nồng độ rất thấp trong mẫu

Immuno-PCR có độ nhạy so với ELISA truyền thống hơn từ 100 – 10.000 lần Từ khi ra đời đến nay, immuno-PCR ngày càng được phát triển thành một công

cụ có khả năng ứng dụng rộng rãi trong các nghiên cứu miễn dịch cơ bản cũng như ứng dụng [38], [44]

Hình 1.7 ELISA và immuno PCR Nguyên lý và độ nhạy của hai phương pháp [44]

1.5.2 Nguyên lý

Immuno-PCR gồm 2 bước cơ bản:

- Phản ứng miễn dịch: cho phép phát hiện protein mục tiêu trong mẫu thông qua tương tác kháng nguyên – kháng thể Bước này tương tự như ELISA, có thể là dạng trực tiếp (mẫu có kháng nguyên mục tiêu được phủ trực tiếp lên giếng) hoặc

1.5.3 Các dạng immuno-PCR

Sự phát triển của các dạng immuno-PCR phụ thuộc vào hai yếu tố quan trọng: (1) công nghệ gắn đoạn DNA marker vào kháng thể “phát hiện” sao cho tạo được phức hợp bền vững đồng thời giảm công sức chuẩn bị cũng như thời gian thực hiện; (2) sử dụng phương pháp phát hiện tín hiệu khuếch đại thông qua điện di hay realtime PCR

Hiện nay, có rất nhiều dạng immuno-PCR đã được phát triển và ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều lĩnh vực nghiên cứu khác nhau Nhưng nhìn chung có thể chia thành 4 dạng chính: immuno-PCR cổ điển (original immuno-PCR), immuno-PCR phổ biến (universal immuno-PCR), immuno-PCR trực tiếp (direct immuno-PCR) và immuno-PCR kết hợp với các kĩ thuật hiện đại (advanced immuno-PCR) [38]

17

Tuy nhiên, phương pháp này bộc lộ một số nhược điểm: do khả năng tương tác không đặc hiệu với tất cả kháng thể của protein A nên không thể ứng dụng trong các dạng immuno-PCR “kẹp chả” sử dụng thêm một kháng thể “bắt giữ” phủ sẵn trên giếng Đồng thời, protein lai protein A – STV này không dễ dàng chế tạo được nên rất khó được ứng dụng rộng rãi [4], [38]

Hình 1.8 Immuno-PCR cổ điển, sử dụng protein lai giữa protein A và streptavidin [4]

1.5.3.2 Immuno-PCR phổ biến

Đây là dạng immuno-PCR được ứng dụng rộng rãi nhất trong các nghiên cứu, được mô tả đầu tiên bởi Zhou và cộng sự (1993) [70], dựa trên khả năng tự hình thành phức hợp giữa DNA đánh dấu biotin, STV và phức hợp kháng thể đánh dấu biotin – kháng nguyên mục tiêu

Dạng immuno-PCR này cho phép ứng dụng trong phát hiện trực tiếp và gián tiếp Các thành phần trong phản ứng có thể tiếp cận dễ dàng STV đã được chứng minh là ít có ái lực không đặc hiệu với các protein ngoại lai hơn so với avidin, giúp giảm tín hiệu nền của phản ứng Các kháng thể đánh dấu biotin được thương mại hóa khá nhiều, và cũng có thể được tự chuẩn bị một cách dễ dàng tại phòng thí nghiệm bằng cách sử dụng các kit biotin hóa Đoạn DNA marker đánh đánh dấu biotin được tạo ra bằng phương pháp PCR đơn giản với cặp mồi có đánh dấu sẵn

18

biotin ở một đầu hoặc sử dụng phương pháp đánh dấu bằng đoạn Klenow hay Sequenase polymerase Một ưu điểm nữa của dạng immuno-PCR này là STV có thể được thay thế bởi STV cộng hợp với enzyme để ứng dụng trong phương pháp ELISA tương ứng, cho phép ELISA và immuno-PCR được thực hiện đồng thời Tất

cả các ưu điểm này đã giúp cho immuno-PCR phổ biến trở thành dạng được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong các nghiên cứu ứng dụng kĩ thuật immuno-PCR

Hình 1.9 Immuno-PCR phổ biến (i) gián tiếp, (ii) trực tiếp [38]

Tuy nhiên, dạng immuno-PCR này cũng có một số nhược điểm Thứ nhất, dạng này đòi hỏi nhiều bước ủ và rửa, làm gia tăng thời gian thực hiện cũng như khả năng ngoại nhiễm, đồng thời cũng làm giảm hiệu quả phát hiện Thứ hai, dạng immuno-PCR này không cho phép phát hiện đồng thời nhiều kháng nguyên mục tiêu hiện diện trong mẫu [4], [38]

1.5.3.3 Immuno-PCR trực tiếp

Immuno-PCR trực tiếp là dùng để mô tả việc đoạn DNA marker được gắn trực tiếp vào kháng thể “phát hiện” bằng liên kết hóa học, không thông qua tương tác giữa STV và biotin Phương pháp này được đề nghị bởi Joerger và cộng sự (1995) Đoạn DNA gắn vào kháng thể có thể là mạch đơn hoặc mạch đôi Tuy

Một nhược điểm quan trọng của phương pháp này là ở giai đoạn tạo ra phức hợp DNA – kháng thể Quá trình này là một quá trình phức tạp, đòi hỏi nhiều bước, cần một quy trình đánh dấu đáng tin cậy cũng như rất nhiều thiết bị, hóa chất để thu nhận được phức hợp DNA – kháng thể tinh sạch Hơn nữa, phản ứng hóa học dùng

để liên kết DNA vào kháng thể cũng như quá trình tinh sạch qua nhiều bước rất khắc nghiệt, có thể ảnh hưởng đến sự ổn định và hoạt tính của kháng thể sau này [4], [38]

20

Hình 1.11 Immuno-PCR trực tiếp (i) dạng “kẹp chả”, (ii) dạng kháng nguyên

cố định trực tiếp lên giếng, (iii)dạng multiplex [38], [5]

1.5.3.4 Immuno-PCR kết hợp với công nghệ hiện đại

Để hạn chế nhược điểm của các dạng immuno-PCR truyền thống, phát triển immuno-PCR thành một công cụ chẩn đoán hiệu quả, nhiều công nghệ mới đã được tích hợp vào immuno-PCR truyền thống Bao gồm sử dụng các hạt từ tính, các hạt nano vàng hay hệ thống protein LG – protein Tus – trình tự Ter

Các hạt từ tính (magnetic bead) phủ kháng thể “bắt giữ” được sử dụng thay cho phương pháp cố định kháng thể “bắt giữ” lên bề mặt giếng Các hạt từ tính này

sẽ được giữ lại trên các đĩa từ Cải tiến này cho phép giảm các tương tác không đặc hiệu xảy ra giữa các thành phần được bổ sung vào giếng và bề mặt có ái lực cao của các giếng sử dụng trong các thử nghiệm miễn dịch Hơn nữa, diện tích bề mặt của các hạt từ lớn hơn so với bề mặt giếng, giúp tăng khả năng bắt giữ kháng nguyên mục tiêu của kháng thể [38] Wacker và cộng sự (2007) đã sử dụng các hạt từ phủ kháng thể để phát hiện kháng nguyên bề mặt tái tổ hợp của Hepatitis B virus (HbsAg) với giới hạn phát hiện đạt được là 320 pg/ml HbsAg [65] Babu và Muriana (2011) cũng xây dựng quy trình realtime immuno-PCR dùng các hạt từ có phủ protein G để phát hiện aflatoxin B1 trong thực phẩm, đưa giới hạn phát hiện aflatoxin B1 từ 100 ppb xuống 0,1 ppb [8]

21

Hình 1.12 Immuno-PCR sử dụng các hạt từ phủ kháng thể [38]

Năm 2002, công nghệ “bio-barcode” được ứng dụng để phát hiện các protein kháng nguyên Bio-barcode là kĩ thuật sử dụng các hạt nano vàng làm giá thể mang các kháng thể “phát hiện” và DNA Như vậy, tín hiệu từ một kháng thể phát hiện được nhân lên bằng nhiều phân tử DNA marker; góp phần làm tăng độ nhạy của phương pháp Tuy nhiên, các phương pháp sử dụng hạt từ hay hạt nano này có thể ảnh hưởng đến phản ứng PCR, làm gia tăng tần số sai sót [38]

Hình 1.13 Immuno-PCR sử dụng “bio-barcode” [38]

Để phát hiện kháng thể trong huyết thanh, một phương pháp mới cũng đã được áp dụng Phương pháp này được đề xuất bởi Morin và cộng sự (2010), sử

dụng protein LG, một protein lai từ protein L của Peptostreptococcus magnus có ái

lực với chuỗi nhẹ của phân tử kháng thể và protein G có ái lực với vùng Fc của IgG,

để phủ lên bề mặt giếng, có vai trò bắt giữ các kháng thể trong huyết thanh Phức

22

hợp này được phát hiện bởi một kháng thể kháng kháng thể mục tiêu gắn cộng gộp

với protein Tus, một protein gắn đặc hiệu với một trình tự Ter ở E.coli

Hình 1.14 Immuno-PCR sử dụng LG protein và hệ thống phát hiện Tus-Ter [38]

1.5.4 Ưu và nhược điểm của immuno-PCR

1.5.4.1 Ưu điểm

- Cho phép phát hiện các phân tử protein mục tiêu hiện diện ở nồng độ rất thấp trong mẫu, có độ nhạy hơn ELISA truyền thống khoảng 100 – 10.000 lần, giảm lượng mẫu cần sử dụng

- Do có độ nhạy cao nên có thể sử dụng các phân tử scFv vốn có độ đặc hiệu rất cao nhưng lại có ái lực yếu với kháng nguyên mục tiêu Do đó, tăng được độ đặc hiệu mà vẫn đảm bảo độ nhạy của phương pháp phát hiện

- Có khả năng phát hiện đồng thời nhiều phân tử mục tiêu trong mẫu nhờ vào khả năng tự do lựa chọn đoạn DNA đánh dấu và khả năng nhân bản cùng lúc nhiều loại DNA khác nhau trong cùng một mẫu của phản ứng PCR

- Tính đa dạng cao, khả năng kết hợp với nhiều công nghệ tiên tiến cho phép immuno-PCR được ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều lĩnh vực khác nhau từ chẩn đoán y sinh đến công nghệ thực phẩm và dược phẩm [5], [44]

1.5.4.2 Nhược điểm

- Phức tạp, quy trình gồm nhiều bước, thời gian thực hiện kéo dài, đòi hỏi thành thạo cả hai kĩ thuật ELISA và PCR

1.5.5.1 Phát hiện kháng nguyên virus, vi khuẩn

Nhiều nghiên cứu ứng dụng kĩ thuật immuno-PCR trong phát hiện các protein kháng nguyên của virus, vi khuẩn, đặc biệt là các protein hiện diện ở nồng

độ rất thấp trong gian đoạn đầu xâm nhiễm [38] Liang và cộng sự (2003) đã sử

dụng immuno-PCR và ELISA để phát hiện Streptococcus nhóm A với độ nhạy lên

tới 10 tế bào khi sử dụng dạng immuno-PCR có DNA gắn trực tiếp vào kháng thể [36] Peroni và cộng sự (2009) cũng đạt được độ nhạy 10 tế bào, nhạy hơn 1000 lần

so với ELISA, khi phát hiện vi khuẩn Xylella fastidiosa bằng immuno-PCR [50]

Phương pháp phát hiện virus chủ yếu hiện giờ là sử dụng PCR Tuy nhiên, độc lực của virus liên quan nhiều đến protein hơn là nucleic acid của nó Do đó, có nhiều nghiên cứu đã đưa immuno-PCR vào chẩn đoán các tác nhân virus Nghiên cứu của Barletta và cộng sự (2004) sử dụng realtime immuno-PCR để phát hiện protein kháng nguyên p24 của HIV-1 với độ nhạy tương đương 40 attogram/phản ứng, cao gấp 10.000 lần so với ELISA và 25 lần so với RT-PCR [9] Ngoài ra, các protein kháng nguyên của Hepatitis B virus và H5N1 avian influenza virus cũng được nghiên cứu phát hiện bằng immuno-PCR [18], [65]

Immuno-PCR cũng được ứng dụng trong phát hiện các độc tố vi khuẩn như

Cry1Ac của Bacillus thuringiensis, hay neurotoxin type A của Clostridium botulinum [6], [18]

1.5.5.2 Phát hiện các protein khối u

Các protein marker của khối u là những phân tử chủ yếu mà immuno-PCR nhắm tới trong tương lai Lind và cộng sự (2005) đã phát triển 3 dạng immuno-

24

PCR khác nhau để phát hiện PSA Dạng nhạy nhất có khả năng phát hiện được 4,8x105 phân tử PSA [37] Ngoài ra, một số công trình nghiên cứu cũng đã ứng dụng immuno-PCR nhằm phát hiện các phân tử có liên quan đến khối u và bệnh như VEGF, MG7-Ag, TNF-α… [4]

1.5.5.3 Ứng dụng trong dược phẩm

Trong lĩnh vực sinh dược phẩm và thiết kế hợp chất, immuno-PCR được ứng dụng để xác định tương tác giữa các đại phân tử như enzyme – cơ chất, kháng nguyên – kháng thể, thụ thể - ligand, protein – DNA Immuno-PCR còn được sử dụng trong xác định động học độc lực và động học dược lực của một hợp chất, giúp cho quá trình đánh giá chuyển hóa của thuốc Ngoài ra, immuno-PCR còn được dùng để phát hiện các thuốc điều trị ung thư [5]

1.6 MỤC TIÊU VÀ NỘI DUNG ĐỀ TÀI

Trong điều kiện phòng thí nghiệm, chúng tôi đã tạo được 2 kháng thể đơn dòng (KTĐD) 1D5 và 4H5 kháng protein E7 HPV type 18 Mục tiêu của đề tài này là tiến hành xây dựng các thử nghiệm miễn dịch bao gồm kĩ thuật hóa tế bào miễn dịch (immunocytochemistry) và kĩ thuật immuno-PCR sử dụng 2 KTĐD 1D5 và 4H5 nhằm phát triển các công cụ chẩn đoán mới cho phép chẩn đoán chính xác và hiệu quả sự hiện diện của protein E7 HPV type 18 trong mẫu bệnh; giúp hoàn thiện công tác chẩn đoán, theo dõi diễn biến của UTCTC ở người bệnh Nội dung của đề tài bao gồm:

- Xây dựng quy trình hóa tế bào miễn dịch trên dòng tế bào ung thư cổ tử cung HeLa

- Xây dựng quy trình immuno-PCR trên protein E7 HPV 18 tái tổ hợp

- Đĩa ELISA (Maxisorp - Nunc)

- Đĩa nuôi cấy tế bào 6 giếng

- Lame kính phủ silane (Dako)

2.1.1.2 Thiết bị

- Tủ cấy vô trùng

- Tủ ấm 37oC, 5 % CO2 (Sanyo)

- Máy đọc ELISA (Biotek)

- Kính hiển vi soi ngược

(CFX Bể ổn nhiệt khô (Techne)

- Bể ổn nhiệt nước (Memmert)

- Máy chụp ảnh gel (Biorad)

- Máy đo quang phổ (Biorad)

- Máy nanophotometer (Implen)

2.1.2 Hóa chất – Môi trường

- Dung dịch khóa: sữa gầy 5 % (PBS 1X + sữa gầy (Merck) 5 %)

- Dung dịch rửa: PBS – Tween 0,1 % (PBS 1X + Tween (Merck) 0,1 %)

- Dung dịch khóa peroxidase nội sinh: H2O2 3 %

- Kháng thể thứ cấp: hệ thống polymer gồm kháng thể kháng IgG chuột cộng gộp horseradish peroxidase (HRP) (Envision-Dako)

- Cơ chất của HRP: DAB (2,4-Diaminobutyric Acid - Sigma)

- Glycerol

G Hóa chất dùng trong lai hóa miễn dịch tế bào trên lame

- Dung dịch cố định: ethanol 95 %, ethanol 50 %

- Dung dịch bộc lộ kháng nguyên: citrate (Merck) pH 6 10 mM

- Dung dịch khóa peroxydase nội sinh: H2O2 3 %

- Kháng thể thứ cấp: hệ thống polymer gồm kháng thể kháng IgG chuột cộng gộp horseradish peroxidase (HRP) (Envision-Dako)

- Cơ chất của HRP: DAB (2,4-Diaminobutyric Acid - Sigma)

- Chất nhuộm nhân: Hematoxylin (Merck)

- Glycerol

G Hóa chất xử lý bệnh phẩm

Ethanol 30 %, PBS 1X

G Hóa chất biotin hóa kháng thể

NaHCO3 (Merck) 0,1 M pH 9.5, NHS-D-Biotin (Sigma), DMSO (Merck), PBS 1X, HABA/Avidin (Sigma)

G Hóa chất tạo đoạn DNA đánh dấu biotin

- Gotaq Master Mix (Promega)

- Kit tinh sạch sản phẩm PCR (Fermentas)

- Đoạn DNA khuôn:

27

5’CTTTCGGTCGTGTCGGCCATCCTCGCCATCACTGCTGTGATTGCTGTATTTATTGTGATTTTTAGTATCACAACACTGTGACCAAGACCATCGAAACCCACACAGGCAAATCGAGACAAACATGGATGAAAACCTCCGCATTCCTGTGACTGCTGAGGTTGTTAACCCATCAAAGGCCTTTGTCGGTAGCTCCAACAC3’

5’GTGTTGGAGCTACCGACAAAGGCCTTTGATGGGTTAACAACCTAGCAGTCACAGGAATGCGGAGGTTTTCATCCATGTTTGTCTCGATTTGCCTGTGTGGTTTCGATGGTCTTGGTCACAGTGTTGTGATACCTAAAATCACAATAAATACAGCAATCACAGCAGTGATGGCGAGGATGCCGACACGACCGAAAG3’

- Mồi xuôi (pf-biotin): 5’ biotin-GGT CGT GTC GGC CAT CCT C 3’

- Mồi ngược (pr): 5’ GGA GCT ACC GAC AAA GGC CT 3’

G Hóa chất cho ELISA

PBS 1X, sữa gầy 5 %, PBS – Tween 0,1 %, phức hợp streptavidin – alkaline phosphatase (Invitrogen), cơ chất của enzyme alkaline phosphatase (dung dịch pha

cơ chất pH 9,8: diethanolamine (Merck) 48,5 ml, MgCl2 (Merck) 4M 62,5 µl, nước cất 2 lần (ddH2O) 500 ml; viên cơ chất (Sigma): cho một viên cơ chất vào 5 ml dung dịch pha cơ chất, lắc đến tan, giữ tránh sáng)

G Hóa chất cho immuno-PCR

- PBS 1X, sữa gầy 5 % có bổ sung 0,1 mg/ml DNA tinh trùng cá hồi (Promega), sữa gầy 0,5 %, PBS-Tween 0,1 %, streptavidin (Sigma), Gotaq Green Master mix (Promega), Gotaq master mix (Promega), Evagreen (Biotum), gel agarose (Biorad)

- Mồi xuôi (pf): 5’ GGT CGT GTC GGC CAT CCT C 3’

- Mồi ngược (pr): 5’ GGA GCT ACC GAC AAA GGC CT 3’

- Thang DNA 100 bp và 1 kb (Fermentas):

28

Thang 1 kb Thang 100 bp

2.1.2.2 Môi trường

- Môi trường Ham’s Nutrient Mixture F12 (Sigma) nuôi cấy tế bào CHO-K1

có bổ sung huyết thanh (fetal bovine serum – FBS, Sigma) 10 %, Penicilin –

Streptomicin (Gibco) 1 %, HEPES (Gibco) 1 %

- Môi trường E’MEM (Eagle's Minimum Essential Media) nuôi cấy tế bào

HeLa, C33A: Bột môi trường E’MEM (Sigma), Phenol đỏ (Sigma) 0,4 %, L-glutamine (Sigma) 2 mM, NaHCO3 (Merck) 0,1125 %, HEPES (Merck) 20 mM,

Amphotericin-B (Sigma) 0,025 µg/ml, Penicillin G (Sigma) 100 UI/ml, Streptomycin (Sigma) 100 µg/ml, huyết thanh (Sigma) 10 %, ddH2O

- Môi trường RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 glutamax (Gibco)

nuôi cấy tế bào CaSki có bổ sung huyết thanh (Sigma) 10 %, Penicilin –

Streptomicin (Gibco) 1 %, HEPES (Gibco) 1 %

- Môi trường Opti-MEM (Invitrogen): là dạng biến đổi của môi trường

E’MEM với lượng huyết thanh bổ sung giảm một nửa

2.1.3 Vật liệu

2.1.3.1 Protein E7 HPV tái tổ hợp

Protein E7 HPV 18/16/11/6 được biểu hiện và tinh sạch tại phòng thí nghiệm

Sinh học phân tử thuộc bộ môn Di truyền – khoa Sinh học – trường Đại học Khoa

29

học Tự Nhiên – Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh Protein E7 HPV 18 đã được khẳng định chính là E7 HPV18 bằng phương pháp western blot với kháng thể đặc hiệu cho E7 HPV18 [2], các protein E7 HPV 16/11/6 cũng đã được chứng minh

là protein E7 HPV 16/11/6 trong các nghiên cứu trước đây của chúng tôi (kết quả không trình bày)

2.1.3.2 Kháng thể đơn dòng kháng E7 HPV 18

Kháng thể đơn dòng chuột 1D5 và 4H5 kháng E7 HPV 18 được tạo ra tại phòng thí nghiệm Sinh học phân tử thuộc bộ môn Di truyền – khoa Sinh học – trường Đại học Khoa học Tự Nhiên – Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh [3]

2.1.3.3 Dòng tế bào

- Tế bào HeLa, C33A, CaSki do ATCC (American Type Culture Collection) cung cấp, được nuôi cấy và bảo quản tại phòng thí nghiệm Sinh học phân tử - bộ môn Di Truyền – khoa Sinh Học – trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh

- Tế bào CHO–K1 được nhận từ Phòng thí nghiệm Tế bào gốc – ĐHQG TP.HCM, nuôi cấy và bảo quản tại phòng thí nghiệm Sinh học phân tử thuộc bộ môn Di truyền – khoa Sinh học – trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên – Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh

2.1.3.4 Plasmid

Vector pEGFP-C2 (BD Bioscience Clontech) gắn chèn gene E7 HPV 18 được tạo dòng và bảo quản tại phòng thí nghiệm Sinh học phân tử thuộc bộ môn Di truyền – khoa Sinh học – trường Đại học Khoa học Tự Nhiên – Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh [1]

30

2.1.3.5 Bệnh phẩm ung thư cổ tử cung

Bệnh phẩm gồm mẫu dịch phết cổ tử cung lấy bằng que phết của các bệnh nhân UTCTC ở bệnh viện Ung bướu - Thành phố Hồ Chí Minh từ tháng từ tháng 4/2011 đến tháng 5/2011 Các mẫu bệnh phẩm này được gửi đi định type HPV ở công ty Công nghệ sinh học (CNSH) Khoa Thương bằng phương pháp PCR và reverse dot blot

2.1.3.6 Phần mềm

Sử dụng phần mềm tính toán Excel của Microsoft Office để xử lý số liệu, tính toán giá trị trung bình và độ lệch chuẩn giữa các lần thí nghiệm lặp lại

2.2 PHƯƠNG PHÁP

2.2.1 Phương pháp nuôi cấy tế bào động vật

- Kiểm tra chất lượng tế bào và sự ngoại nhiễm ở bình Roux bằng cách quan sát dưới kính hiển vi soi ngược

- Đổ bỏ nhẹ nhàng môi trường trong bình Roux và nhẹ nhàng rửa lớp tế bào bám ở đáy bình Roux 2 lần bằng PBS(-) 1X (3 ml PBS/1 lần)

- Thêm 1 ml hỗn hợp Trypsin/EDTA vào bình Roux, lắc nhẹ bình cho đến khi

tế bào bắt đầu tách ra khỏi bề mặt bình Roux

- Cho 1 ml môi trường vào bình Roux để ức chế hoạt động của Trypsin Dùng pipette Pasteur để huyền phù đều tế bào trong bình nuôi cấy

- Cấy dịch huyền phù tế bào sang các bình Roux mới có chứa 5 ml môi trường

- Tế bào được cấy chuyền sau 3-5 ngày nuôi cấy

2.2.2 Phương pháp đếm tế bào bằng Trypan blue

Phương pháp này sử dụng Trypan blue nhuộm tế bào để phân biệt tế bào sống và tế bào chết trong buồng đếm hồng cầu Trypan blue là một thuốc nhuộm màu xanh dương chỉ có thể đi xuyên qua màng tế bào chết Do đó, khi dịch huyền

31

phù tế bào được hòa với Trypan blue những tế bào chết, màng bị vỡ, sẽ hấp thu thuốc nhuộm nên phồng lên, lớn hơn và có màu xanh đen

Phương pháp được thực hiện như sau :

- Rửa sạch buồng đếm hồng cầu và lame bằng cồn, để khô

- Đặt lame lên buồng đếm hồng cầu

- Hòa đều 15 µl dịch tế bào trong 15 µl Trypan blue, rồi từ từ cho vào buồng đếm

- Đếm tổng số tế bào sống trong các ô A, B, C, D, E như sau:

Tổng số tế bào sống được tính như sau :

Trong đó :

N: tổng số tế bào sống có trong mẫu (số tế bào/ml) n: tổng số tế bào sống đếm trong 5 ô

a: hệ số pha loãng

2.2.3 Phương pháp chuyển gene vào tế bào động vật (transfection)

Phương pháp này sử dụng Lipofectamine 2000 - một tác nhân lipid tích điện dương, trong nước tạo thành các liposome - để tương tác với các phần tích điện âm trên DNA, tạo thành những phức hợp tích điện dương Các phức hợp này mang DNA tiến đến gần màng tế bào tích điện âm, dung hợp với màng tế bào và chuyển vào trong tế bào

a

n

N = ×104×5

E

Hình 2.1 Buồng đếm hồng cầu

- Loại bỏ PLL Rửa coverslip bằng nước cất hai lần khử trùng 3 lần

- Đặt coverslip vào đĩa 6 giếng Để khô ở nhiệt độ phòng

G Chuyển gene bằng Lipofectamine

- Tách tế bào CHO-K1 bằng Trypsin – EDTA như mục 2.1.1

- Đếm tế bào để xác định mật độ bằng phương pháp Trypan blue

- Cho 2 ml dịch huyền phù tế bào có mật độ 105 tế bào/ml vào mỗi giếng có sẵn coverslip trong đĩa 6 giếng

- Ủ ở 37oC, 5 % CO2

- Khi tế bào đạt độ phủ 90 – 95 % bề mặt coverslip thì tiến hành chuyển gene

- Thay môi trường Ham’s Nutrient Mixture bằng 1 ml môi trường Opti - MEM

- Pha loãng 6 µg vector chứa gene E7 HPV 18 trong 100 µl môi trường Opti – MEM để có 100 µl

- Huyền phù nhẹ Lipofectamine Pha loãng 15 µl Lipofectamine 2000 trong môi trường Opti – MEM để có 100 µl Để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút

- Trộn vector và dung dịch Lipofectamine Huyền phù

33

2.2.4 Phương pháp lai hóa miễn dịch tế bào trên coverslip

- Phủ 2x105 tế bào trên coverslip và ủ ở 37°C qua đêm

- Rửa coverslip 2 lần với dung dịch PBS

- Cố định tế bào trên coverslip bằng dung dịch ethanol 95 % - 15 phút ở nhiệt

độ phòng

- Làm thấm màng tế bào bằng dung dịch PBS-Triton X100 0,5 % trong 15 phút ở nhiệt độ phòng

- Rửa coverslip 2 lần với dung dịch PBS

- Ủ coverslip với H2O2 3 % trong 10 phút, nhiệt độ phòng Rửa PBS 2 lần

- Khóa coverslip bằng sữa gầy 5 % trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng

- Pha loãng kháng thể sơ cấp trong dung dịch PBS- saponin 0,05 % Ủ với

250 µl kháng thể sơ cấp qua đêm ở 4°C Rửa coverslip 4 lần (5 phút /lần) với dung dịch PBS - Tween 0,1 %

- Ủ coverslip với 250 µl kháng thể thứ cấp cộng hợp HRP trong 1 giờ ở nhiệt

độ phòng

- Rửa coverslip 3 lần (5 phút /lần) với dung dịch PBS - Tween 0,1 %

- Bổ sung 250 µl cơ cất DAB (Sigma) và cho hiện màu ở các mẫu Rửa lại bằng PBS để dừng phản ứng

- Cố định coverslip lên lame kính, quan sát dưới kính hiển vi quang học ở vật kính 20X

2.2.5 Phương pháp lai hóa tế bào miễn dịch trên lame kính

- Trải 10 µl huyền phù tế bào lên lame kính có phủ sẵn silane

- Cố định trong ethanol 95 % từ 15 phút tới 1 giờ, để khô ở nhiệt độ phòng từ

20 phút tới 1 giờ

- Ngâm trong ethanol 50 %, 10 phút Rửa H2O 3 lần

- Ủ trong dung dịch citrate 10 mM đã làm nóng lên 95oC, 10 phút

- Để nguội xuống nhiệt độ phòng khoảng 20 phút Rửa H2O 3 lần

- Ủ trong H2O2 3 % 10 phút, ở nhiệt độ phòng Rửa H2O 3 lần