Baculovirus tái tổ hợp được biểu hiện bằng phương pháp chuyển nhiễm (transfection) bacmid-H5 và bacmid-Gus (chứng dương) vào tế bào côn trùng Sf9. Tế bào côn trùng Sf9 phát triển đến pha tăng trưởng (1.5-2.5x106 tế bào/ml) trong môi trường Sf900-II 10% FBS, với số thế hệ thấp (5-20 thế hệ). Sau đó, chuyển nhiễm bacmid tái tổ hợp vào 3.2x105 tế bào/mỗi giếng trong điều kiện nuôi cấy lớp
đơn, môi trường Sf900 II, không huyết thanh, có kháng sinh. Bởi vì, môi trường có huyết thanh sẽ làm giảm hiệu quả chuyển nhiễm. Sau đó, tế bào Sf9 được quan sát dưới kính hiển vi soi ngược ở độ phóng đại 10X, 20X và 40X tại thời điểm 24, 48, 72 và 96 giờ sau chuyển nhiễm.
Kết quả và Bàn luận
Luận văn thạc sĩ 42
Theo hướng dẫn của nhà cung cấp sản phẩm Invitrogen, thời điểm từ 6-24 giờ sau khi bị xâm nhiễm, tế bào Sf9 có các dấu hiệu như: ngừng phân chia, đường kính tế bào tăng, nhân tế bào lớn hơn, tế bào tăng sản xuất bộ gen của virus và tạo virus ngoại bào (extracellular virus hay budded virus). Sau 20-36 giờ, tế bào ngừng sản xuất virus ngoại bào, bắt đầu biểu hiện sản phẩm gen tái tổ hợp nằm dưới promotor polyhedrin. Trong nuôi cấy lớp đơn, ở thời điểm này, mật độ tế bào giảm do tế bào bị chết và ly giải [7]. Thời điểm thu nhận baculovirus tái tổ hợp là 72 giờ
sau chuyển nhiễm [8].
Trong thí nghiệm này, kết quả chúng tôi thu được cũng tương tự như
khuyến cáo của nhà sản xuất. Thật vậy, 24 giờ sau chuyển nhiễm, tế bào Sf9 có dấu hiệu ngừng phân chia. Điều này được phân biệt rõ khi so sánh với chứng âm gồm tế
bào không được chuyển nhiễm (các tế bào chứng âm phủ kín bề mặt sau 24 giờ). Ngoài ra, dưới kính hiển vi soi ngược ở độ phóng đại 40X, nhân tế bào lớn hơn so với bình thường. Đến thời điểm 72 giờ, tế bào được chuyển nhiễm bắt đầu có dấu hiệu bị baculovirus xâm nhiễm. Tuy nhiên, dấu hiệu chỉ mang tính cục bộ trên một số nhóm tế bào. Dấu hiệu nhận biết tế bào bị virus xâm nhiễm bao gồm: xuất hiện các hạt nhỏ trên tế bào (hướng mũi tên trên hình 3.9), tế bào chết và bị ly giải, cùng với một số tế bào tách khỏi bề mặt đĩa nuôi cấy, dẫn đến mật độ tế bào giảm. Sau 96 giờ, mật độ tế bào bị xâm nhiễm giảm đáng kể và hầu hết các tế bào đều có dấu hiệu bị virus xâm nhiễm. Trong thí nghiệm của chúng tôi, thời gian biểu hiện của baculovirus chậm hơn so với khuyến cáo của nhà sản xuất và công trình của Nitar Nwe năm 2006. Công trình của Nitar Nwe cho biết, baculovirus tái tổ hợp được thu nhận ở thời điểm 72 giờ sau khi chuyển nhiễm bacmid tái tổ hợp vào lớp đơn tế bào côn trùng Sf9.
Hình 3.9. Tế bào Sf9 được chuyển nhiễm (độ phóng đại 20X). 1A, 1B: tế bào Sf9 trước chuyển nhiễm. 2A, 3A: tế bào Sf9 chuyển nhiễm với bacmid-H5 sau 72, 96 giờ. 2B, 3B: tế
bào Sf9 chuyển nhiễm với Bacmid-Gus (chứng dương) sau 72, 96 giờ. 1C-3C: tế bào Sf9 từ thời điểm 0, 72, 96 giờ sau khi cấy vào giếng được dùng làm chứng âm.
Thời gian biểu hiện của baculovirus tái tổ hợp khác nhau bởi nhiều nguyên nhân. Sự phát triển của tế bào, lượng bacmid tái tổ hợp chuyển nhiễm và lượng Cellfectin II (Invitrogen) là những nguyên nhân đáng lưu ý. Thật vậy, baculovirus
được biểu hiện dựa trên bộ máy di truyền của tế bào chủ Sf9, do vậy tế bào chủ phát triển mạnh là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự biểu hiện của baculovirus. Đểđạt điều này, tế bào cần được chuẩn hóa vềđiều kiện nuôi cấy trong một điều kiện nhất định. Trong trường hợp này, chúng tôi nuôi cấy tế bào lớp đơn, ở
(28±0.5)0C. Tế bào được cấy chuyền cũng như thay môi trường đúng như khuyến cáo của nhà sản xuất (Invitrogen). Các thể tích bacmid tái tổ hợp khác nhau dùng để
Kết quả và Bàn luận
Luận văn thạc sĩ 44
chuyển nhiễm nhằm xác định hiệu quả chuyển nhiễm cao nhất. Tuy nhiên, lượng Cellfectin II chúng tôi sử dụng trong quá trình này cố định. Kết quả sự biểu hiện tế
bào Sf9 tương đối như nhau theo thời gian. Như vậy, tác nhân hỗ trợ chuyển nhiễm Cellfectin II ảnh hưởng đáng kể đến hiệu quả chuyển nhiễm. Bởi vì, chúng có tác dụng hòa màng tế bào, giúp bacmid tái tổ hợp chuyển vào tế bào Sf9. Tuy nhiên, với những kết quả có được từ quan sát trên tế bào Sf9 được chuyển nhiễm bởi bacmid-H5 và so sánh với chứng âm cũng như chứng dương, chúng tôi kết luận rằng quá trình tạo baculovirus tái tổ hợp mang gen H5 đã thành công. Baculovirus tái tổ hợp này được thu nhận ở thời điểm 96 giờ sau chuyển nhiễm, bảo quản 40C trong điều kiện tránh sáng.
3.4.2. Nhân bản baculovirus tái tổ hợp
Baculovirus thu được sau chuyển nhiễm có thể được sử dụng để biểu hiện protein [8]. Tuy vậy, nhân bản virus có tác dụng làm tăng thể tích cũng như tăng nồng độ của dịch virus. Trong thí nghiệm này, baculovirus thế hệ thứ nhất (P1)
được dùng để nhân bản lên baculovirus thế hệ thứ hai (P2), sau đó P2 sẽđược nhân bản lên P3. Tế bào Sf9 được nuôi đến pha tăng trưởng (1.5-2.5x106 tế bào/ml) trong môi trường Sf900 II, 10% FBS, với số thế hệ thấp (5-20 thế hệ). Quá trình nhân bản
được thực hiện trên đĩa nuôi 6 giếng, với 2x106 tế bào/giếng, môi trường Sf900 II, 10% FBS, có kháng sinh. Các yếu tố quan trọng để thu được nồng độ baculovirus cao sau khi nhân bản gồm: sự phát triển của tế bào, lượng baculovirus gây nhiễm, thời điểm thu nhận baculovirus đã nhân bản. Trong đó, yếu tố liên quan đến lượng baculovirus đưa vào gồm nồng độ baculovirus và liều gây nhiễm (multiplicity of infection-MOI). Trong giới hạn của thí nghiệm, nồng độ P1 của baculovirus xâm nhiễm được ước lượng 1x106 pfu/ml, nằm trong khoảng khuyến cáo của nhà sản xuất (1x106 – 1x107 pfu/ml). Liều gây nhiễm được định nghĩa là số lượng virus trên một tế bào. Để nhân bản baculovirus, liều gây nhiễm thường nằm trong khoảng 0.01-0.1 pfu/tế bào [7], [8].
Trong thí nghiệm này, liều gây nhiễm được sử dụng là 0.1 pfu/tế bào, dịch baculovirus được thu nhận ở thời điểm 96 giờ sau xâm nhiễm. Tại thời điểm này, tế
bào chết khoảng 80% trong tổng số tế bào bị xâm nhiễm. Đây là thời điểm thích hợp
để thu nhận baculovirus. Vì theo khuyến cáo của nhà sản xuất, virus nên được thu nhận khi 70-80% tế bào chết [8]. Tuy nhiên, một báo cáo khác cho rằng baculovirus nên được thu nhận trước khi tế bào bị phân giải (lytic phase), nghĩa là khi hơn 90% tế bào còn sống, điều này sẽ tối thiểu các yếu tố làm giảm chất lượng baculovirus như các mảnh vỡ tế bào, sản phẩm phụ của quá trình trao đổi chất, các protease của tế bào chủ [7]. Thời điểm thu nhận baculovirus trong thí nghiệm của chúng tôi là 96 giờ sau khi xâm nhiễm, tương đối phù hợp với với khuyến cáo của nhà sản xuất (48 giờ hoặc có thể lâu hơn). Ngoài những nguyên nhân như: sự phát triển của tế bào, các điều kiện nuôi cấy tế bào (pH, độ ẩm, nhiệt độ,...), cấu trúc của baculovirus, nguyên nhân còn lại có thể do ước lượng nồng độ baculovirus P1 đưa vào chưa tối
ưu, tức là ước lượng cao hơn so với giá trị thực, có thể dẫn đến kéo dài thời gian biểu hiện của baculovirus.
Dịch baculovirus P2 được sử dụng để nhân bản thành P3 với quy trình thí nghiệm tương tự. Các dịch baculovirus này được bảo quản ở 40C, tránh ánh sáng.
Hình 3.10. Tế bào Sf9 trước và 96 giờ sau khi bị baculovirus xâm nhiễm (độ phóng
đại 20X). (A) tế bào Sf9 trước khi bị xâm nhiễm. (B) tế bào Sf9 ở thời điểm 96 giờ sau khi bị xâm nhiễm.
Kết quả và Bàn luận
Luận văn thạc sĩ 46
3.4.3. Biểu hiện protein hemagglutinin
Tế bào Sf9 được nuôi đến pha tăng trưởng trong môi trường Sf900 II, 10% FBS. Số thế hệ chúng tôi sử dụng để biểu hiện nằm trong khoảng 5-20, theo khuyến cáo của nhà sản xuất [8]. Nhằm biểu hiện protein hemagglutinin H5, baculovirus
được cho xâm nhiễm vào mỗi giếng của đĩa nuôi 24 giếng, trong đó mỗi giếng chứa 6x105 tế bào Sf9. Liều gây nhiễm tối ưu khác nhau khi áp dụng cho các dòng tế bào khác nhau. Ngoài ra, liều gây nhiễm tối ưu còn phụ thuộc vào động lực virus và chủng virus. Trong biểu hiện protein, các thông số quan trọng như chủng virus, môi trường nuôi, dụng cụ nuôi cấy, dòng tế bào có mối liên hệ với liều gây nhiễm đưa vào. Trong lần đầu biểu hiện protein, liều gây nhiễm từ 0.5-10 pfu/tế bào [7], [8].
Trong thí nghiệm này, chúng tôi dùng các liều gây nhiễm khác nhau: 0.5, 1, 2 và 3 pfu/tế bào. Tuy nhiên, Nitar Nwe dùng liều gây nhiễm 0.4 pfu/tế bào khi biểu hiện trên tế bào Sf9 trong điều kiện nuôi cấy lớp đơn và cũng đã thành công trong biểu hiện protein HA1 [26]. Tế bào Sf9 có thể được nuôi trong môi trường Sf900 II, có hoặc không có bổ sung huyết thanh. Tuy nhiên, nhằm bảo đảm sự phát triển mạnh của tế bào Sf9, chúng tôi sử dụng môi trường Sf900 II, 10% FBS, có kháng sinh.
Một yếu tố quan trọng khác là số thế hệ baculovirus cho mục đích biểu hiện protein. Theo khuyến cáo của nhà sản xuất, số thế hệ của baculovirus nằm từ thế hệ
thứ nhất (P1) đến thế hệ thứ 3 (P3). Tuy nhiên, với thể tích giới hạn ở hai thế hệ đầu, nên trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng baculovirus thế hệ thứ 3 để xâm nhiễm vào tế bào Sf9 nhằm biểu hiện protein H5. Tuy nhiên, Nitar Nwe đã sử dụng thế hệ baculovirus thứ tư (P4) cho mục đích biểu hiện và kết quả đã thu được protein HA1 mục tiêu có hoạt tính sinh học [26].
Sản phẩm protein biểu hiện có thể tiết hoặc không tiết vào môi trường nuôi cấy. Sự biểu hiện protein tối đa khi tế bào bị xâm nhiễm khoảng 30-72 giờ đối với protein tiết và 48-96 giờ đối với protein không tiết [7]. Nitar Nwe và cộng sự thu
nhận tế bào ở các thời điểm khác nhau: 63, 87, 111, 135 giờ sau khi bị virus xâm nhiễm [26]. Protein hemagglutinin H5 chúng tôi biểu hiện là protein không tiết. Do vậy, tế bào Sf9 sẽđược thu nhận ở thời điểm 72 giờ sau khi bị virus xâm nhiễm. Vả
lại, trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng các liều gây nhiễm khác nhau và cốđịnh thời gian thu nhận tế bào bởi một nguyên nhân khác. Đó là, thông thường tế bào Sf9
được thay môi trường nuôi sau 3-4 ngày nuôi cấy đểđảm bảo cung cấp đủ chất dinh dưỡng cần thiết cho tế bào phát triển bình thường. Trong trường hợp tế bào được xâm nhiễm với liều gây nhiễm thấp, dẫn đến thời gian biểu hiện dài hơn, từđó môi trường không đủ chất dinh dưỡng cho tế bào phát triển và biểu hiện protein mục tiêu.
Bảng 3.1.Hình thái tế bào côn trùng bị baculovirus xâm nhiễm (dưới kính hiển vi soi ngược ởđộ phóng đại 250-400X) [8].
Dấu hiệu bị xâm nhiễm Kiểu hình Mô tả
Giai đoạn đầu (24 giờđầu)
Tăng đường kính tế bào Đường kính tế bào tăng 20-25%
Tăng kích thước nhân Nhân chiếm phần lớn tế
bào Giai đoạn trung gian
(24-72 giờ)
Tế bào ngừng tăng trưởng Tế bào ngừng tăng trưởng so với chứng âm chỉ chứa tế bào
Xuất hiện hạt (Granular appearance)
Tín hiệu virus ngoại bào
được phóng thích; xuất hiện tiểu bào (vesicular appearance) Tách khỏi bề mặt nuôi cấy Tế bào tách khỏi bề mặt nuôi cấy Giai đoạn cuối (sau 72 giờ) Tế bào bị ly giải Tế bào bị ly giải làm giảm mật độ trên lớp đơn nuôi cấy
Kết quả và Bàn luận
Luận văn thạc sĩ 48
Tế bào sau khi được thu nhận sẽ bị phá vỡ bởi sóng siêu âm. Phần cặn (pellet) gồm các mảnh vỡ tế bào và phần dịch tế bào chất (supernatant) được thu nhận và bảo quản 40C.
3.4.4. Xác định và kiểm tra hoạt tính sinh học của protein hemagglutinin
Nhiều phương pháp khác nhau được sử dụng để kiểm tra hoạt tính sinh học của hemagglutinin như kiểm tra khả năng ngưng kết hồng cầu (Hemagglutinin Assay), khả năng kháng sự phân cắt của trypsin (trypsin digest assay), cấu trúc giống hoa thị (rosette-like structure) của hemagglutinin khi quan sát dưới kính hiển vi điện tử và phản ứng hấp thụ hồng cầu (hemadsorption assay) của tế bào côn trùng biểu hiện hemagglutinin [13]. Protein hemagglutinin có khả năng ngưng kết hồng cầu do HA1 có khả năng gắn với các thụ thể trên tế bào hồng cầu. Do vậy, để kiểm tra sự biểu hiện cũng như hoạt tính sinh học của chúng, chúng tôi chọn phương pháp ngưng kết hồng cầu để kiểm tra. Dịch tế bào chất Sf9 và môi trường nuôi cấy tế bào
được thu nhận để thực hiện phản ứng ngưng kết hồng cầu.
Kết quả kiểm tra phản ứng ngưng kết hồng cầu cho thấy tế bào Sf9 đã biểu hiện protein hemagglutinin (H5) thành công và protein này vẫn còn giữ nguyên hoạt tính sinh học. Kết quả từ quan sát giếng H (chứa môi trường nuôi cấy tế bào Sf9 bị
xâm nhiễm) cho thấy dịch nuôi cấy không có khả năng ngưng kết hồng cầu. Điều này có thể protein không được tiết vào môi trường nuôi cấy hoặc tiết với một lượng rất thấp. Theo báo cáo của Nitar Nwe khi biểu hiện protein HA1 trên tế bào Sf9, protein này chủ yếu nằm trong tế bào và rất ít được tiết vào môi trường nuôi cấy. Tuy nhiên, cũng không loại trừ khả năng một số tế bào chết bị ly giải và giải phóng lượng nhỏ protein HA1 nội bào vào môi trường nuôi cấy [26]. Yang Jing-lin biểu hiện protein H5 trên tế bào HEK293 cũng nhận thấy rằng, protein này được tiết vào môi trường nuôi rất ít. Tuy nhiên, khi được xóa đi vùng xuyên màng trên H5, protein H5 được tiết đáng kể vào môi trường nuôi [19]. Ngược lại, Nitar Nwe biểu hiện protein HA1 không chứa vùng xuyên màng nhưng protein này chủ yếu vẫn nằm trong tế bào côn trùng Sf9 [26]. Như vậy, dòng tế bào cũng đóng vai trò quan
trọng trong sự biểu hiện protein. Kết quả từ giếng A, B, C, D cho thấy hoàn toàn phù hợp với dựđoán của chúng tôi. Protein H5 được biểu hiện nằm trong tế bào côn trùng và ở dạng hòa tan trong dịch tế bào.
Hình 3.11. Phản ứng ngưng kết hồng cầu. (A) Dịch tế bào Sf9 với liều xâm nhiễm 0.5 pfu/tế bào. (B) Dịch tế bào Sf9 với liều xâm nhiễm 1 pfu/tế bào. (C) Dịch tế bào Sf9 với liều xâm nhiễm 2 pfu/tế bào. (D) Dịch tế bào Sf9 với liều xâm nhiễm 3 pfu/tế bào. (E) Dịch tế bào Sf9 (chứng âm). (F) Chứng dương HA. (G) Dung dịch đệm PBS (pH 7.2). (H) Môi trường nuôi cấy tế bào Sf9 với liều xâm nhiễm 2 pfu/tế bào.
Ngoài ra, protein hemagglutinin thu được có hoạt tính sinh học. Yang Jing-lin biểu hiện protein H5 trên tế bào HEK293 và kiểm tra chúng có hoạt tính sinh học [19].Đây chính là ưu thế khi biểu hiện protein trên tế bào côn trùng so với biểu hiện trên tế bào vi khuẩn. Thật vậy, Fang-Feng Chiu biểu hiện protein H5HA1 của virus cúm H5N1 ở tế bào E.coli. Sau đó, protein H5 phải được tái gấp cuộn trên cột chứa dung dịch đệm GSH/GSSG và L-arginine nhằm phục hồi cấu trúc không
Kết quả và Bàn luận
Luận văn thạc sĩ 50
gian của protein [11]. Ngoài ra, Q. M. Xie biểu hiện protein H5 ở tế bào E. Coli
BL21 và protein này phải được chaperon hỗ trợ gấp cuộn [47].
Từ kết quả của phản ứng ngưng kết hồng cầu cho thấy hiệu giá của protein H5 đạt 23, 24, 25 và 26 đơn vị HA/106 tế bào lần lượt đối với các liều gây nhiễm 0.5, 1, 2 và 3 pfu/tế bào. Từđó cho thấy, sau 72 giờ thu nhận với cùng số lượng tế bào Sf9, các liều gây nhiễm khác nhau dẫn đến mức độ biểu hiện protein khác nhau. Trong trường hợp này, tế bào được gây nhiễm với MOI 3 sẽ cho kết quả cao nhất (26đơn vị HA/106 tế bào). Ngược lại, đối với tế bào được gây nhiễm với MOI 0.5, ở
thời điểm này protein H5 chưa được biểu hiện mạnh. Possee thu nhận hemagglutinin ở màng tế bào côn trùng và hiệu giá HA đạt 650 đơn vị HA/106 tế
bào và được đánh giá là lúc baculovirus xâm nhiễm tối đa trên tế bào côn trùng. Nitar Nwe thu được 77µg protein HA từ tế bào chất của 106 tế bào [26]. So với nhiều nghiên cứu biểu hiện HA trong tế bào côn trùng, lượng protein H5 trong thí nghiệm