2.1.1.1. Thu nhận sản phẩm khuếch đại chứa gen H5
Gen hemagglutinin (H5) được khuếch đại từ plasmid pHW2000-7BTV(H5) với cặp mồi đặc hiệu. Ngoài ra, đầu 5’ của mỗi mồi có chứa trình tự nhận biết của enzyme cắt giới hạn NotI và XhoI. Thành phần phản ứng gồm có: 2.5 µl 10X buffer, 2 µl dNTP 10 mM, 0.25 µl ExTaq polymerase 5U/µl, 1.5 µl mồi xuôi 10 µM, 1.5 µl mồi ngược 10 µM, 1 µl plasmid, bổ sung nước cất vô trùng cho đến thể tích cuối cùng 25 µl. Chương trình nhiệt như sau: 980C (3 phút), 980C (10 giây, 40 chu kì),
600C (1 phút, 40 chu kì), 720C (5 phút, 40 chu kì), 720C (7 phút). Các sản phẩm PCR được điện di trên TAE agarose gel 1%, nhuộm ethidium 0.5 µg/ml. Các vạch điện di (band) được quan sát dưới đèn UV (Ultraviolet) bước sóng 312 nm. Chiều dài của các đoạn DNA được so sánh với thang chuẩn (Takara).
2.1.1.2. Tinh sạch sản phẩm khuếch đại
Sản phẩm khuếch đại được tinh sạch bằng bộ Kit QIAquick Gel Extraction, theo hướng dẫn nhà sản xuất. Quy trình: cắt và thu nhận mẫu gel chứa DNA cần tinh sạch. Cân trọng lượng gel. Bổ sung ba lần thể tích Buffer QG vào một thể tích gel (100 mg ~ 100 μl), thường khoảng 600-800 μl. Ủ ở 500C trong 10 phút cho đến khi gel tan hoàn toàn, có thể vortex sau mỗi 2-3 phút trong quá trình ủ. Đặt cột lọc QIAquick vào ống ly tâm 2 ml. Cho mẫu vào cột lọc QIAquick, ly tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ dịch lọc và đặt cột lọc lại ống ly tâm ban đầu. Cho thêm 500 μl Buffer QG vào cột lọc và ly tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút. Cho 750 μl Buffer PE vào cột lọc và ly tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút. Ly tâm lại 10000 vòng/phút trong 1 phút để loại bỏ hoàn toàn dịch rửa. Chuyển cột lọc sang ống ly tâm 1.5 ml mới, sạch. Để hòa tan DNA, cho 25 μl buffer EB (10 mM Tris- Cl, pH 8.5) vào giữa màng của cột lọc. Để yên trong một phút rồi ly tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút để thu mẫu DNA tinh sạch [34].
2.1.1.3. Định lượng sản phẩm khuếch đại
DNA được định lượng tương đối bằng thiết bị GeneQuant II. Mỗi dung dịch DNA được đo ở 2 bước sóng 260 nm và 280 nm. Từ giá trị hấp phụ ở bước sóng 260 nm chúng ta xác định được nồng độ của các axít nucleic trong mẫu đồng thời xác định được độ tinh sạch của chúng thông qua tỷ lệ hấp phụở bước sóng 260 nm và 280 nm.
2.1.1.4. Chuyển gen H5 vào plasmid pFastBac1
Các enzyme cắt giới hạn được sử dụng trong đề tài gồm: NotI và XhoI. Phản ứng cắt được thực hiện trong ống ly tâm 1.5ml. Đối với sản phẩm khuếch đại mang gen H5, thành phần gồm có: 5 μl 10XSuRE/Cut Buffer H, 2μl enzyme NotI
Vật liệu và Phương pháp
Luận văn thạc sĩ 23
trùng để đạt thể tích cuối cùng 50 μl. Đối với pFastBac1 plasmid, thành phần gồm có: 5 μl 10X suRE/Cut buffer H, 2μl enzyme NotI (10 U/μl), 1 μl enzyme XhoI (40 U/μl), 4 μl pFastBac1 plasmid (0.5μg/μl) và bổ sung nước cất vô trùng để đạt thể tích cuối cùng 50 μl. Ủ hỗn hợp mỗi phản ứng ở 370C, trong 90 phút. Bất hoạt ở 650C, trong 20 phút.
Các sản phẩm sau khi phân cắt được được điện di trên TAE agarose gel 1%, nhuộm ethidium bromide 0.5 µg/ml, sau đó được tinh sạch và thực hiện phản ứng nối. Phản ứng nối được thực hiện trong ống ly tâm 0.5 ml với các thành phần: 4 µl 10X Ligase Reaction Buffer, 3µl DNA vector, 6 µl mẫu DNA, 1 µl T4 DNA Ligase (4 Weiss units) và 6 µl nước cất vô trùng. Ủ qua đêm ở 230C.
2.1.1.5. Tạo dòng plasmid tái tổ hợp pFastBac1-H5
Ly tâm kỹ ống ly tâm chứa plasmid cần biến nạp, đặt vào đá. Hút 5 μl sản phẩm nối cho vào ống ly tâm chứa tế bào khả nạp (Invitrogen), khuấy nhẹ bằng đầu côn (cone). Ủ trên đá 30 phút. Sốc nhiệt tế bào trong 30 giây, 420C, không lắc, sau đó chuyển ngay vào đá. Bổ sung 250 μl môi trường S.O.C (giữ ở nhiệt độ phòng). Lắc theo phương ngang ở 370C, khoảng 1 giờ, 225 vòng/phút. Trải khoảng 100- 200μl dịch tế bào lên đĩa thạch BHIA chứa ampicillin 100 μg/ml. Ủ qua đêm ở 370C. Kiểm tra khuẩn lạc trắng rời mọc trên đĩa thạch.
2.1.1.6. Tách chiết plasmid tái tổ hợp pFastBac1-H5
Thu nhận ít nhất 10 khuẩn lạc trắng, tăng sinh trong 3 ml môi trường BHI chứa ampicillin 100μg/ml khoảng 16 giờ, ở 370C. Plasmid tái tổ hợp được tách chiết bằng bộ Kit QIAprep spin miniprep, theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Quy trình: ly tâm 3 ml dịch E.coli TOP10 nuôi qua đêm 10000 vòng/phút trong 3 phút để thu cặn tế bào. Tái huyền phù cặn tế bào trong 250 μl Buffer P1 và chuyển dịch sau khi huyền phù vào ống ly tâm 2 ml. Thêm 250 μl Buffer P2 và đảo 4-6 lần. Thêm 350μl Buffer N3 và đảo 4-6 lần. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút. Thu nhận dịch nổi và cho vào cột lọc (QIAprep spin column). Ly tâm để loại bỏ dịch nước thải (13000 vòng/phút trong 30-60 giây). Rửa cột lọc bằng cách bổ sung 0.75 ml Buffer PE và ly tâm 13000 vòng/phút, trong 1 phút. Tiếp tục ly tâm 13000 vòng/phút trong
1 phút để loại hoàn toàn dung dịch đệm còn lại. Để rửa giải DNA, đặt cột lọc trong ống ly tâm 1.5 ml, cho 50 μl đệm EB vào giữa cột lọc, để yên trong 1 phút, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút [33].
Sản phẩm plasmid tái tổ hợp tách chiết được định lượng bằng thiết bị GeneQuant II (nhưđã trình bày ở phần trên).
2.1.1.7. Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pFastBac1-H5
Plasmid tái tổ hợp được kiểm tra bằng: (1) phương pháp PCR với cặp mồi chuyên biệt trên plasmid pFastbac1; và (2) phương pháp giải trình tự với các cặp mồi đặc hiệu trên pFastBac1 và trên gen H5.
Đối với phương pháp PCR, thành phần phản ứng gồm có: 5 µl 5X GoTaq buffer, 2 µl MgCl2 25 mM, 2 µl dNTP mix 10 mM, 1.5 µl mồi xuôi 10 µM, 1.5 µl mồi ngược 10 µM, 1.5 µl plasmid, 0.25 µl GoTaq polymerase 5 U/µl, bổ sung nước cất vô trùng cho đến thể tích cuối cùng 25 µl. Chương trình nhiệt như sau: 950C (2 phút), 950C (45 giây, 35 chu kì), 550C (1 phút, 35 chu kì), 720C (4 phút, 35 chu kì), 720 C (7 phút). Các sản phẩm PCR được điện di trên TAE agarose gel 1%, nhuộm ethidium 0.5 µg/ml. Các vạch điện di (band) được quan sát dưới đèn UV (Ultraviolet) bước sóng 312 nm. Chiều dài của các đoạn DNA được so sánh với vạch chuẩn đã biết kích thước.
Đối với phương pháp giải trình tự, hệ thống CEQTM 8000 được dùng để giải trình tự dựa trên nguyên tắc Sanger. Các bước được tiến hành như sau: (1) Thực hiện phản ứng khuếch đại PCR nhằm đánh dấu plasmid tái tổ hợp cần giải trình tự[4]: phản ứng sử dụng bộ Kit DTCS Quick Start. Thành phần cho mỗi phản ứng như sau (mỗi phản ứng tương ứng với mỗi mồi): 2 μl plasmid, 2 μl mồi 1 μM, 4 μl DTCS Quick Start Master Mix và bổ sung nước cất vô trùng đến thể tích cuối cùng 10 μl. Chương trình đánh dấu: 40 chu kỳ cho 960C trong 2 phút, 500C trong 20 giây và 500C trong 4 phút, kết thúc giữ lạnh ở 40C. (2) Xử lý mẫu DNA và nạp mẫu vào máy CEQTM 8000 [4]: chuyển sản phẩm đánh dấu vào eppendorf 1,5 ml. Bổ sung 5 μl hỗn hợp Stop Solution/Glycogen bao gồm 2 μl Sodium Acetate 3 M, 2 μl
Vật liệu và Phương pháp
Luận văn thạc sĩ 25
Na2-EDTA 100 mM, và 1 μl Glycogen 20 mg/ml, trộn đều. Cho 60 μl Ethanol 95% (v/v) vào, trộn nhẹ, ly tâm 14000 vòng/phút ở 40C trong 15 phút. Cẩn thận hút bỏ dịch nổi, rửa 2 lần bằng 200 μl ethanol 70%, ly tâm 14000 vòng/phút ít nhất 2 phút ở 40C. Hút bỏ dịch nổi, làm khô cặn còn lại bằng máy ly tâm chân không trong 10 phút. Bổ sung 40 μl dung dịch nạp mẫu (Sample Loading Solution) vào mỗi mẫu. Chuyển mẫu DNA vào các giếng, bổ sung một giọt dầu khoáng (mineral oil) lên bề mặt. Lập chương trình và chạy máy.
2.2.2. Thu nhận bacmid tái tổ hợp mang gen H5 2.2.2.1. Tạo dòng bacmid-H5 tái tổ hợp 2.2.2.1. Tạo dòng bacmid-H5 tái tổ hợp
Ly tâm kỹ ống ly tâm chứa plasmid cần biến nạp, đặt vào đá. Hút 5 μl sản phẩm plasmid cho vào ống ly tâm chứa tế bào khả nạp (Invitrogen), khuấy nhẹ bằng đầu côn. Ủ trên đá 30 phút. Sốc nhiệt tế bào trong 30 giây, 420C, không lắc, sau đó chuyển ngay vào đá. Bổ sung 250 μl môi trường S.O.C (giữở nhiệt độ phòng). Lắc theo phương ngang ở 370C, khoảng 4 giờ, 225 vòng/phút. Trải khoảng 100-200 μl dịch tế bào lên đĩa thạch BHIA chứa kanamycine 50μg/ml và gentamicin 7μg/ml, tetracycline 10 μg/ml, X-gal 50 μg/ml, IPTG 40 μg/ml (đối với tế bào được biến nạp bởi pFastBac1-H5 và pFastBac1-Gus) và môi trường chỉ chứa một yếu tố sàng lọc ampicillin 100 μg/ml (đối với tế bào được biến nạp bởi plasmid pUC19). Ủ 370C trong 48 giờ (pFastBac1-H5 và pFastBac1-Gus) và 24 giờ (đối với plasmid pUC19). Kiểm tra khuẩn lạc trắng rời mọc trên đĩa thạch.
2.2.2.2. Tách chiết bacmid-H5 tái tổ hợp (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Thu nhận ít nhất 10 khuẩn lạc trắng, tăng sinh trong 3 ml môi trường BHI chứa các kháng sinh kanamycine 50 μg/ml và gentamicin 7 μg/ml, tetracycline 10 μg/ml khoảng 16-18 giờ, ở 370C. Tiếp tục tăng sinh dịch vi khuẩn nuôi cấy qua đêm trong 50 ml môi trường BHI chứa kháng sinh như trên ở 370C, lắc 225 vòng/phút, khoảng 4 giờ. Tái tổ hợp được tách chiết sử dụng bộ Kit QIAfilter Midi, theo hướng dẫn cảu nhà sản xuất. Quy trình được thực hiện như sau: ly tâm để thu sinh khối vi khuẩn ở 6000xg trong 15 phút, 40C. Hòa cặn trong 4ml dung dịch P1. Bổ sung 4ml dung dịch P2, trộn đều bằng cách đảo 4-6 lần và ủ ở nhiệt độ phòng
trong 5 phút. Bổ sung 4 ml dung dịch P3 đã được làm lạnh, trộn đều hỗn hợp bằng cách đảo 4-6 lần. Chuyển dịch ly giải vào trong ống của cartridge và ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Cân bằng QIAGEN tip 100 bằng cách cho 4 ml QBT vào và để chảy tự do. Mở nắp QIAfilter cartridge, nhẹ nhàng đưa pittông vào QIAfilter cartridge và lọc dịch ly giải tế bào trong QIAGEN tip. Cho dịch ly giải đã được làm sạch vào resin bằng dòng trọng lực. Rửa QIAGEN tip với 20 ml dung dịch QC. Dung giải DNA với 5 ml QF. Tủa DNA bằng cách bổ sung 3.5 ml isopropanol (giữ ở nhiệt độ phòng) và trộn đều. Ly tâm 16000 vòng/phút trong 30 phút, 40C. Cẩn thận loại bỏ dịch nổi. Rửa cặn DNA với 2ml ethanol 70% (giữở nhiệt độ phòng) và ly tâm 16000 vòng/phút trong 10 phút, 40C. Cẩn thận loại bỏ dịch nổi. Cặn được làm khô trong 5-10 phút và tái hòa tan trong dung dịch đệm TE [32].
Sản phẩm bacmid tái tổ hợp tách chiết được định lượng bằng thiết bị GeneQuant II (nhưđã trình bày ở phần trên).
2.2.2.3. Kiểm tra bacmid-H5 tái tổ hợp
Bacmid tái tổ hợp được kiểm tra bằng phương pháp PCR với cặp mồi chuyên biệt pUC/M13F, pUC/M13R đối với bacmid. Thành phần phản ứng gồm có: 5µl 5X GoTaq buffer, 2 µl MgCl2 25 mM, 2 µl dNTP mix 10 mM, 1.5 µl mồi xuôi 10 µM, 1.5 µl mồi ngược 10 µM, 1.5 µl bacmid tái tổ hợp, 0.25 µl GoTaq polymerase 5 U/µl, bổ sung nước cất vô trùng cho đến thể tích cuối cùng 25 µl. Chương trình nhiệt như sau: 950 C (2 phút), 950 C (45 giây, 35 chu kì), 550 C (1 phút, 35 chu kì), 720 C (6 phút, 35 chu kì), 720 C (7 phút). Các sản phẩm PCR được điện di trên TAE agarose gel 1%, nhuộm ethidium 0.5 µg/ml. Các vạch điện di (band) được quan sát dưới đèn UV (Ultraviolet) bước sóng 312 nm. Chiều dài của các đoạn DNA được so sánh với thang chuẩn (Invitrogen).
2.2.3. Biểu hiện protein hemagglutinin
2.2.3.1. Chuyển nhiễm bacmid-H5 tái tổ hợp vào tế bào côn trùng Sf9
Nuôi tế bào Sf9 đến pha tăng trưởng (1.5-2.5x106 tế bào/ml), với hơn 95% tế bào sống. Bổ sung 0.8ml môi trường Sf900 II SFM (không có huyết thanh và kháng sinh) vào mỗi giếng của đĩa 12 giếng. Chuyển 3.2x105 tế bào vào mỗi giếng
Vật liệu và Phương pháp
Luận văn thạc sĩ 27
trên. Để yên trong 15 phút ở nhiệt độ phòng trong tủ thao tác để tế bào bám vào bề mặt giếng. Chuẩn bị các hỗn hợp sau: (1) pha hỗn hợp gồm: 3.5 µl Cellfectin II với 40 µl môi trường Sf900 II (không kháng sinh và không huyết thanh). Vortex nhanh. (2) pha loãng lần lượt 0.5 µl, 1µl, 1.5 µl bacmid-H5 trong 40 µl môi trường Sf900 II không kháng sinh và không huyết thanh, trộn nhẹ. Kết hợp hai hỗn hợp chuẩn bị từ bước 1 và bước 2 ở trên, trộn nhẹ và ủ ở nhiệt độ phòng 15-30 phút. Chuyển hỗn hợp vừa tạo, bằng cách nhỏ giọt, vào tế bào đã chuẩn bị ở bước trên. Ủ tế bào ở 280C trong 4 giờ. Hút bỏ môi trường chuyển nhiễm, và thay bằng 0.8ml môi trường tăng trưởng Sf900 II 10%FBS, có chứa kháng sinh. Ủ tế bào ở 280C trong 72 giờ hoặc cho đến khi thấy dấu hiệu tế bào bị virus xâm nhiễm.
Song song với quá trình chuyển nhiễm bacmid-H5 vào tế bào côn trùng Sf9, chúng tôi cũng chuyển nhiễm bacmid-Gus (0.5µl) vào tế bào này với mục đích làm chứng dương cho quá trình chuyển nhiễm tạo baculovirus tái tổ hợp. Quy trình được thực hiện tương tự nhưđối với bacmid-H5.
2.2.3.2. Thu nhận và bảo quản baculovirus tái tổ hợp
Thu nhận và chuyển môi trường nuôi cấy từ mỗi giếng vào ống ly tâm 15 ml, ly tâm 500xg trong 5 phút. Loại bỏ tế bào và các mảnh vỡ lớn. Chuyển phần dịch lỏng sang ống ly tấm 15 ml khác. Bảo quảndịch virus P1 này ở 40C, tránh ánh sáng. Trong trường hợp bảo quản lâu dài, có thể giữở -800C.
2.2.3.3. Nhân bản baculovirus tái tổ hợp
Nhân bản baculovirus trong đĩa 6 giếng. Chuẩn bị huyền phù tế bào Sf9 và trải với nồng độ 2x106 tế bào/ giếng. Ủ tế bào ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ cho đến khi tế bào đã bám dính bề mặt các giếng. Bổ sung thể tích dịch virus thích hợp vào mỗi giếng với liều gây nhiễm 0.01 pfu/tế bào. Ủ tế bào 96 giờ, ở 280C. Sau 96 giờ, hút 2ml môi trường nuôi chứa dịch tế bào vào ống ly tâm 15ml. Ly tâm 500xg, trong 5 phút. Loại bỏ cặn và mảnh vỡ lớn để thu được dịch baculovirus. Chuyển dịch nổi chứa virus vào ống ly tâm 15 ml khác. Bảo quản dịch virus P2 ở 40C, tránh ánh sáng. Để bảo quản lâu dài, nên giữ stock P2 ở -800C, tránh ánh sáng. Tương tự, dịch virus P2 tiếp tục được nhân bản thành thế hệ P3.
2.2.3.4. Biểu hiện protein hemagglutinin
Cấy 6x105 tế bào Sf9 trên mỗi giếng trong đĩa 24 giếng. Để tế bào bám bề mặt ít nhất 30 phút. Hút bỏ môi trường và rửa tế bào một lần với môi trường tăng trưởng sạch. Bổ sung 300µl môi trường sạch. Cho baculovirus P3 vào mỗi giếng với liều gây nhiễm 0.5, 1, 2, 3 pfu/tế bào. Trong thí nghiệm, chúng tôi ước lượng nồng độ baculovirus là 5x106 pfu/ml. Ủ tế bào 280C trong tủ ấm. Thu nhận tế bào sau 72 giờ và bảo quản ở -200C [7].
2.2.3.5. Thu nhận protein hemagglutinin
Huyền phù6x105 tế bào côn trùng Sf9 sau khi xâm nhiễm 72 giờ trong 60µl dung dịch PBS (pH 7.2). Sau đó, các tế bào Sf9 được phá vỡ bằng sóng siêu âm với bước sóng 37 kHz ở 40C trong 10 giây và quá trình được thực hiện 5 lần [41]. Ly tâm hỗn hợp 14000 vòng/phút, 15 phút, 40C [23]. Thu nhận phần dịch (supernatant) và phần cặn (pellet) gồm các mảnh vỡ tế bào. Bảo quản ở 40C.
2.2.3.6. Phản ứng ngưng kết hồng cầu
Phần dịch tế bào Sf9 và môi trường nuôi cấy tế bào Sf9 được thu nhận để kiểm tra khả năng ngưng kết hồng cầu. Phản ứng này dựa trên nguyên tắc gắn kết giữa các phân tử HA với các thụ thể trên bề mặt hồng cầu, từ đó hình thành mạng lưới liên kết giữa các virus và hồng cầu, giữ cho hồng cầu không tụ trong dung dịch.
a. Chuẩn bị hồng cầu gà
Lọc qua miếng gạc y tế khoảng 5 ml máu gà vào ống ly tâm 50 ml hình nón. Ly tâm 1200 vòng/phút trong 10 phút, gạn bỏ dịch nổi. Rửa hồng cầu hai lần bằng cách bổ sung 50 ml PBS, trộn nhẹ nhàng, ly tâm 1200 vòng/phút trong 5 phút, gạn bỏ dịch nổi. Pha loãng cặn tế bào trong một thể tích dung dịch PBS (pH 7.2) thích hợp, đếm số lượng hồng cầu trên một trong bốn ô vuông (corner square)của buồng