Nghiên cứu biểu hiện protein tái tổ hợp miraculin trong dòng tế bào BY2, rễ tơ thuốc lá và cây cà chua chuyển gen

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LA VIỆT HỒNG NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP MIRACULIN TRONG DÒNG TẾ BÀO BY2, RỄ TƠ THUỐC LÁ VÀ CÂY CÀ CHUA

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LA VIỆT HỒNG

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP MIRACULIN TRONG DÒNG TẾ BÀO BY2, RỄ TƠ THUỐC LÁ

VÀ CÂY CÀ CHUA CHUYỂN GEN

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI, 2015

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LA VIỆT HỒNG

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP MIRACULIN TRONG DÒNG TẾ BÀO BY2, RỄ TƠ THUỐC LÁ

VÀ CÂY CÀ CHUA CHUYỂN GEN

Chuyên ngành : Sinh lý học thực vật

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Chu Hoàng Hà

Viện Công nghệ sinh học

HÀ NỘI, 2015

Tôi cũng xin cảm ơn Ban Giám Hiệu, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh-KTNN, Phòng Tổ chức cán bộ, Phòng Khoa học Công nghệ trường ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi về mọi mặt trong suốt quá trình thực hiện nghiên cứu này

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới TS Phạm Bích Ngọc-Phòng Công nghệ tế bào thực vật, PGS.TS Lê Văn Sơn-Phòng Công nghệ ADN ứng dụng, Viện Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện giúp đỡ và đóng góp những ý kiến quý báu

để tôi hoàn thành đề tài này Trong thời gian thực hiện đề tài tôi cũng nhận được sự giúp đỡ tận tình của tập thể cán bộ Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Phòng Công nghệ ADN ứng dụng Nhân dịp này tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, người thân, các bạn đồng nghiệp, những người đã luôn động viên và góp ý cho tôi trong thời gian qua

Hà Nội, tháng 6 năm 2015

Nghiên cứu sinh

La Việt Hồng

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác;

Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án này là trung thực, một phần đã công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả;

Phần còn lại chƣa đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Hà Nội, ngày 19 tháng 6 năm 2015

Tác giả

La Việt Hồng

Mục lục

Lời cảm ơn i

Lời cam đoan ii

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH vii

DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT ix

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Ý nghĩa lý luận và ý nghĩa thực tiễn 3

4.1 Ý nghĩa lý luận 3

4.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

5 Đóng góp mới của luận án 3

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 PROTEIN NGỌT, PROTEIN TẠO CẢM GIÁC NGỌT VÀ MIRACULIN 4

1.1.1 Protein ngọt và protein tạo cảm giác ngọt 4

1.1.2 Đặc điểm sinh học của cây thần kỳ và miraculin 6

1.2 TĂNG CƯỜNG SỰ BIỂU HIỆN CỦA PROTEIN TÁI TỔ HỢP TRONG THỰC VẬT 14

1.2.1 Lựa chọn hệ thống biểu hiện 14

1.2.2.Lựa chọn promoter (trình tự khởi đầu phiên mã) 15

1.2.3 Ảnh hưởng terminator đến sự biểu hiện của gen chuyển 20

1.2.4 Thay đổi mã di truyền của gen đích cho phù hợp với hệ thống biểu hiện 20

1.3 NGHIÊN CỨU VỀ CHUYỂN GEN TRONG DÒNG TẾ BÀO BY2, RỄ TƠ VÀ CÂY CÀ CHUA 22

1.3.1 Dòng tế bào thuốc lá BY2 (Nicotiana tabacum Bright Yellow 2) 22

1.3.2 Hệ thống nuôi cấy rễ tơ thực vật 24

1.3.3 Cây cà chua chuyển gen 25

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30

2.1 VẬT LIỆU 30

2.1.1 Vật liệu thực vật 30

2.1.2 Vector và chủng vi khuẩn 30

2.1.3 Hóa chất và thiết bị máy móc 31

2.1.4 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 31

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31

2.2.1 Thay đổi mã di truyền gen miraculin cho phù hợp với hệ thống biểu hiện ở cây họ cà 33

2.2.2 Thiết kế mồi 34

2.2.3 Phân lập promoter và terminator 34

2.2.4 Thiết kế vector chuyển gen mang gen miraculin 38

2.2.5 Phương pháp tạo dòng tế bào BY2, rễ tơ thuốc lá và cây cà chua chuyển gen 41

2.2.6 Phân tích các chỉ tiêu sinh lý của dòng chuyển gen 43

2.2.7 Phân tích các dòng chuyển gen bằng kỹ thuật sinh học phân tử 44

2.2.8 Phân tích sự biểu hiện gen trong các dòng chuyển gen 47

2.2.9 Phân tích thống kê kết quả thực nghiệm 48

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 49

3.1 THAY ĐỔI MÃ DI TRUYỀN CỦA GEN MIRACULIN PHÙ HỢP VỚI HỆ BIỂU HIỆN Ở CÂY HỌ CÀ PHÂN LẬP PROMOTER E8, PROMOTER VÀ TERMINATOR HSP 18.2 49

3.1.1 Thay đổi mã di truyền của gen miraculin phù hợp với hệ biểu hiện ở cây họ cà 49

3.1.2 Phân lập và tách dòng promoter E8 từ cà chua, promoter và terminator HSP 18.2 từ Arabidopsis 51

3.2 THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MIRACULIN VÀO DÒNG TẾ BÀO BY2, RỄ TƠ THUỐC LÁ VÀ CÂY CÀ CHUA 58

3.2.1 Thiết kế vector chuyển gen pBI121/35S-pro/Mir/NOS-ter 58

3.2.2 Thiết kế vector chuyển gen pBI121/35S-pro/Mir/HSP-ter 60

3.2.3 Thiết kế vector chuyển gen pBI121/E8-pro/Mir/HSP-ter 62

3.2.4 Thiết kế vector chuyển gen pBI121/HSP-pro/Mir/HSP-ter 63

3.2.5 Biến nạp vector chuyển gen mang gen miraculin vào Agrobacterium 65

3.3 BIỂU HIỆN PROTEIN MIRACULIN TÁI TỔ HỢP TRONG DÒNG TẾ BÀO BY2 VÀ HỆ THỐNG RỄ TƠ THUỐC LÁ 66

3.3.1 Biểu hiện protein miraculin tái tổ hợp trong dòng tế bào BY2 66

3.3.2 Biểu hiện protein miraculin tái tổ hợp trong rễ tơ thuốc lá 71

3.4 BIỂU HIỆN PROTEIN MIRACULIN TÁI TỔ HỢP TRONG CÂY CÀ CHUA 79

3.4.1 Tạo dòng cà chua chuyển gen miraculin 79

3.4.2 Kiểm tra sự có mặt của gen miraculin trong các dòng cà chua bằng kỹ thuật PCR 83

3.4.3 Phân tích sự biểu hiện ở mức mRNA của gen miraculin trong một số dòng cà chua chuyển gen 84

3.4.4 Xác định số bản copy trong dòng cà chua chuyển gen bằng kỹ thuật Southern 85

3.4.5 Đánh giá một số chỉ tiêu sinh trưởng của một số dòng cà chua chuyển gen 86

Chương 4 THẢO LUẬN 91

4.1 Tăng cường sự biểu hiện của protein tái tổ hợp trong thực vật 91

4.2 Biểu hiện miraculin tái tổ hợp trong dòng tế bào BY2 và rễ tơ thuốc lá 94

4.3 Biểu hiện miraculin tái tổ hợp trong cây cà chua chuyển gen 99

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 104

NHỮNG CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 105

SUMMARY 106

1 Overview: 106

2 Objectives: 107

3 Contents: 107

4 Results: 107

5 Discussion: 108

TÀI LIỆU THAM KHẢO 112

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Một số đặc tính của protein ngọt và tạo cảm giác ngọt 4

Bảng 1.2 So sánh ưu nhược điểm giữa các hệ thống biểu hiện protein tái

Bảng 2.1 Trình tự nucleotide của các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu 34

Bảng 3.1 So sánh trình tự promoter E8 phân lập với trình tự promoter E8

Bảng 3.2 So sánh trình tự nucleotide của promoter HSP 18.2 phân lập được

với các trình tự gen/promoter HSP 18.2 đã công bố 56

Bảng 3.3 Kết quả tạo và chọn lọc các dòng tế bào BY2 mang gen chuyển

Bảng 3.4 Khối lượng tươi và khối lượng khô của một số dòng tế bào BY2

Bảng 3.6 Khối lượng tươi và khối lượng khô của một số dòng rễ tơ

Bảng 3.9 Một số chỉ tiêu sinh trưởng và hình thái của năm dòng cà chua

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.2 Miraculin tự nhiên được tích lũy trong phần thịt quả cây thần kỳ 8

Hình 1.3 Mô hình cấu trúc 3D của protein miraculin dạng homodimer 9

Hình 1.4 Mô hình thụ thể T1R2+T1R3 liên kết với protein cảm giác ngọt 10

Hình 3.1 Trình tự gen miraculin trước (AB512278.1) và sau khi thay đổi

Hình 3.2 Hình ảnh điện di sản phẩm phân lập và nhân dòng promoter E8 52

Hình 3.3 Hình ảnh điện di sản phẩm phân lập và nhân dòng promoter

Hình 3.4 Hình ảnh điện di sản phẩm phân lập và nhân dòng terminator

Hình 3.5 Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pBI121/35S-pro/Mir/NOS-ter 58

Hình 3.6 Hình ảnh điện di các sản phẩm cắt ghép tạo vector chuyển gen

Hình 3.7 Hình ảnh điện di các sản phẩm cắt ghép tạo vector chuyển gen

Hình 3.8 Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pBI121/E8-pro/Mir/HSP-ter 62

Hình 3.9 Hình ảnh điện di các sản phẩm cắt ghép tạo vector chuyển gen

Hình 3.10 Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pBI121/HSP-pro/Mir/HSP-ter 63

Hình 3.11 Hình ảnh điện di các sản phẩm cắt ghép tạo vector chuyển gen

Hình 3.12 Hình ảnh điện di các sản phẩm cắt vector chuyển gen thu từ

Hình 3.13 Quá trình tạo dòng tế bào thuốc lá BY2 mang gen miraculin 67

Hình 3.14 Hình ảnh điện di kiểm tra sự có mặt của gen miraculin trong

Hình 3.15 Hình ảnh phân tích sự biểu hiện của protein miraculin trong

Hình 3.16 Hàm lƣợng miraculin tái tổ hợp trong một số dòng BY2

Hình 3.19 Hình ảnh chiều dài của một số dòng rễ tơ thuốc lá chuyển gen 74

Hình 3.20 Hình ảnh phân tích sự biểu hiện của protein miraculintrong

Hình 3.21 Hàm lƣợng miraculin tái tổ hợp trong một số dòng rễ tơ

Hình 3.22 Quá trình tạo và sàng lọc cà chua chuyển gen miraculin 82

Hình 3.23 Hình ảnh điện di kiểm tra sự có mặt của gen miraculin trong

Hình 3.24 Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR kiểm tra sự biểu hiện

mRNA của gen chuyển miraculin trong các dòng cà chua 84

Hình 3.25 Hình ảnh xác định số bản copy trong các dòng cà chua chuyển

Hình 3.28 Hàm lƣợng miraculin tái tổ hợp ở vỏ ngoài quả cà chua chuyển

LB Biên trái (left T-DNA border)

mg/l hoặc mg/ml miligam/lít hoặc miligam/mililít

NOS-ter Terminator nopaline synthase gene

SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel

electrophoresis

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Hiện nay, các chất làm ngọt nhân tạo như saccharin, aspartame, sucralose và acesulfame-K được con người sử dụng phổ biến như những chất làm ngọt ít năng lượng, nhằm giảm nguy cơ mắc các bệnh mạn tính liên quan đến đường như béo phì, đái tháo đường Tuy nhiên, một số hợp chất này có thể gây ung thư (Kant 2005)

Trong tự nhiên, có rất nhiều loại protein ngọt và protein tạo cảm giác ngọt đã được phát hiện bao gồm thaumatin, monellin, mabinlin, pentadin, brazzein, neoculin (curculin) và miraculin Các protein này có thể được sử dụng để thay thế các chất làm ngọt nhân tạo bởi vì chúng tạo vị ngọt cho người sử dụng, an toàn do

có nguồn gốc tự nhiên và ít sinh năng lượng Tuy nhiên, sản lượng tự nhiên của các protein này bị hạn chế do hầu hết các protein này thu được từ cây sống ở vùng nhiệt đới, nơi có điều kiện khí hậu khắc nghiệt (Kant 2005)

Gần đây, các nhà khoa học đã nghiên cứu biểu hiện thành công một số protein ngọt và tạo vị ngọt như thaumatin, monellin, brazzein và miraculin ở quy

mô phòng thí nghiệm trong một số hệ thống biểu hiện như vi khuẩn, nấm men, nấm,

tế bào BY2, hệ thống nuôi cấy rễ tơ và cây trồng chuyển gen (Masuda, Kitabatake

2006, Pham Bich Ngoc 2009) Tuy nhiên, mức độ tích lũy của các protein tái tổ hợp này khá thấp, dẫn đến các nghiên cứu về protein ngọt và protein tạo vị ngọt đều chưa thể sản xuất thương mại các sản phẩm tái tổ hợp

Miraculin là một trong số các protein tạo vị ngọt, có trong quả của cây thần

kỳ (Richadella dulcifica), có đặc tính tạo ra cảm giác ngọt để thay đổi từ vị chua

thành cảm giác ngọt mà bản chất của miraculin là không ngọt Tính chất độc đáo này của miraculin rất có ích cho con người nhằm ngăn ngừa các căn bệnh hiện đại

do các chất làm ngọt nhân tạo gây ra Miraculin cũng là chất ít sinh năng lượng Do

vậy, có thể sử dụng miraculin để thay thế đường, giúp người sử dụng tránh được các nguy cơ mắc bệnh béo phì Với tính chất độc đáo như vậy, xong sản lượng của miraculin trong tự nhiên bị hạn chế do cây thần kỳ sinh trưởng chậm ở nơi khí hậu khắc nghiệt của Tây Phi

Gần đây các nhà khoa học đã nghiên cứu nhằm sản xuất miraculin tái tổ hợp trên một số đối tượng khác nhau Tuy nhiên, mức độ tích lũy của miraculin tái tổ hợp trong hệ thống biểu hiện vẫn chưa được như kỳ vọng Xuất phát từ lý do trên,

chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu biểu hiện protein tái tổ hợp miraculin

trong dòng tế bào BY2, rễ tơ thuốc lá và cây cà chua chuyển gen”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Thay đổi mã di truyền gen miraculin của cây thần kỳ, thiết kế vector chuyển gen cùng với các promoter đặc hiệu và promoter cảm ứng để chuyển vào dòng tế bào BY2, rễ tơ thuốc lá và cây cà chua nhằm thu được các dòng chuyển gen có khả năng biểu hiện miraculin tái tổ hợp

3 Nội dung nghiên cứu

1) Thay đổi mã di truyền của gen miraculin cho phù hợp với hệ thống biểu hiện

ở cây họ cà Phân lập, nhân dòng promoter E8 từ cà chua, promoter HSP 18.2 và terminator HSP 18.2 từ Arabidopsis thaliana

2) Thiết kế vector biểu hiện miraculin trong dòng tế bào BY2, rễ tơ thuốc lá và cây cà chua

3) Biểu hiện protein tái tổ hợp miraculin trong dòng tế bào BY2 và rễ tơ thuốc

lá

4) Biểu hiện protein tái tổ hợp miraculin trong cây cà chua

4 Ý nghĩa lý luận và ý nghĩa thực tiễn

4.1 Ý nghĩa lý luận

Đề tài cung cấp cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tăng cường mức độ biểu hiện của gen chuyển ở thực vật bằng cách thay đổi mã di truyền, promoter, terminator và hệ thống biểu hiện thực vật

5 Đóng góp mới của luận án

1) Protein tái tổ hợp miraculin đã được biểu hiện thành công trong dòng tế bào BY2 với hàm lượng từ 1,13-3,10 ng/µg protein tan tổng số; biểu hiện trong

hệ thống rễ tơ thuốc lá, hàm lượng tự 13,7-19,97 ng/µg protein tan tổng số 2) Miraculin tái tổ hợp đã được biểu hiện thành công trong cà chua, trong đó gồm 5 dòng mang bản đơn copy của gen chuyển, hàm lượng cao ở các dòng

cà chua được chuyển cấu trúc biểu hiện đặc hiệu ở quả, đạt 118,0 ng/µg protein tan tổng số, cao gấp hơn 4 lần so với các dòng được chuyển cấu trúc mang promoter 35S

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 PROTEIN NGỌT, PROTEIN TẠO CẢM GIÁC NGỌT VÀ MIRACULIN

1.1.1 Protein ngọt và protein tạo cảm giác ngọt

Hiện nay, các nghiên cứu trên thế giới đã xác định được 7 loại protein ngọt

và protein tạo cảm giác ngọt từ tự nhiên Theo đặc tính có thể chia thành 3 nhóm: (i) các protein ngọt (thaumatin, monellin, mabinlin, pentadin và brazzein), (ii) protein cảm ứng độ ngọt (miraculin) và (iii) protein có đủ đặc tính của hai nhóm trên (neoculin) Các thuộc tính và tính chất chất của các protein này được trình bày ở bảng 1.1

Bảng 1.1 Một số đặc tính của protein ngọt và tạo cảm giác ngọt (Kant 2005)

Phân bố Tây Phi Tây Phi Trung Quốc Tây Phi Tây Phi Malaysia Tây Phi

Biến thể I, II, a, b, c - I, II-a, III,

72 (Chuỗi B)

(*) độ ngọt được tính dựa theo khối lượng phân tử, (1)

: heterodimer, (2): homodimer, (3): tetramer

Trong số các protein kể trên, monellin có độ ngọt là 100.000 lần, sau đó là brazzein và thaumatin lần lượt là khoảng 500 lần và 3000 lần so với sucrose (dựa theo nồng độ mol/lít) Tất cả các protein này đều được phân lập từ cây sống trong rừng mưa nhiệt đới Các protein này có tiềm năng ứng dụng trong công nghiệp để

thay thế chất làm ngọt nhân tạo mà ít sinh năng lượng và an toàn cho người sử dụng

Brazzein

Brazzein là protein nhỏ nhất thuộc nhóm protein tạo vị ngọt, protein này chứa 54 acid amin Brazzein rất bền với nhiệt độ và độ pH, có độ ngọt vào khoảng 500-2000 lần so với sucrose (dựa theo khối lượng phân tử) và rất có tiềm năng sử dụng như chất làm ngọt với năng lượng thấp Brazzein được phân lập từ quả

Pentadiplandra brazzeana Baillon, một loại cây sống ở Châu Phi Với đặc tính bền

nhiệt và bền với pH của brazzein giúp các nhà khoa học có thể sử dụng brazzein để nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ và độ pH đến hoạt tính tạo cảm giác ngọt của

các protein ngọt nói chung (Izawa et al., 1996)

Thaumatim

Thaumatin thuộc nhóm protein tạo vị ngọt được phân lập từ cây vùng nhiệt

đới Thaumatococcus danielli Thaumatin có 207 acid amin với 8 cầu liên kết disulfide và không chứa cystein tự do Khi nhiệt độ trên 70oC và pH 7,0 thì thaumatin có xu hướng kết dính lại và mất hoạt tính tạo vị ngọt (Kaneko, Kitabatake 1999) Thaumatin có độ ngọt khoảng 10.000 lần so với sucrose (dựa theo nồng độ mol/lít), protein này được sử dụng ở nhiều quốc gia theo hướng tạo cảm giác ngọt hoặc tăng cường độ ngọt (Zemanek, Wasserman 1995)

Monellin

Monellin là một protein ngọt chứa 2 chuỗi peptide, chuỗi A có 44 acid amin

và chuỗi B chứa 50 acid amin (Ota et al., 1999) Protein này được tinh sạch từ quả cây Dioscoreophyllum cumminsii sống ở Tây Phi Độ ngọt của monellin là khoảng

100.000 lần so với đường sucrose và khoảng vài trăm lần dựa theo nồng độ mol/lít

và khối lượng Chuỗi đơn của monellin có 94 acid amin đã được chứng minh là có

độ ngọt tương tự như hai chuỗi monellin trong tự nhiên, dạng chuỗi đơn cũng bền

với nhiệt độ và độ acid so với monellin tự nhiên (Lee et al., 1999) Các nghiên cứu

gần đây cũng xác định các vị trí liên kết của monellin với thụ thể vị giác của người,

các vị trí đó gồm AsnA16, AsnA22, GlnA25 và AsnA26 có hoạt tính tạo cảm giác ngọt lần lượt là 7500, 750, 2500 và 5500 lần so với sucrose (dựa theo khối lượng phân

tử) (Kohmura et al., 1992)

Curculin

Curculin được thu nhận từ cây Curculigo latifolia, curculin có hoạt tính như

chất làm ngọt ít sinh năng lượng Độ ngọt tối đa của curculin tương đương với dung dịch sucrose 0,35 M Nó có khả năng tạo ra vị ngọt đối với nước và các chất chua sau khi sử dụng curculin Hoạt tính tạo vị ngọt của curculin không thay đổi sau khi được xử lý ở nhiệt độ 50oC trong 1 giờ với pH từ 3-9

Mabinlin

Mabinlin là một protein ngọt rất bền với nhiệt độ, được bắt nguồn từ cây

Capparis masaikai, có độ ngọt khoảng 400 lần so với sucrose (dựa theo khối lượng

phân tử) Protein này có chứa hai chuỗi, chuỗi A có 33 acid amin và chuỗi B có 72 acid amin, trong chuỗi B có chứa hai liên kết disulfide và chuỗi B liên kết với chuỗi

A thông qua ba liên kết disulfide (Kohmura et al., 1992) Độ ngọt của mabinlin-2

không thay đổi sau xử lý 48 giờ ở điểm sôi, đối với mabinlin-3 và mabinlin-4 vẫn giữ được hoạt tính sau khi xử lý ở 80oC trong 1 giờ (Nirasawa et al., 1994)

Pentadin

Pentadin là một loại protein ngọt được tách chiết từ cây Pentadiplandra

brazzeana, đây là một loại cây bụi được phát hiện ở rừng nhiệt đới của một số quốc gia Châu Phi Độ ngọt của nó bằng khoảng 500 lần so với sucrose (dựa theo khối lượng phân tử), trong phân tử cũng chứa hai tiểu phần liên kết với nhau qua cầu

disulfide Đến nay cũng chưa có nhiều thông tin về protein này (van der Wel et al.,

1989)

1.1.2 Đặc điểm sinh học của cây thần kỳ và miraculin

1.1.2.1 Đặc điểm sinh học của cây thần kỳ

Cây thần kỳ (Richadella dulcifica) thuộc họ Hồng xiêm (Sapotaceae) (Matsuyama et al., 2009) Đây là loại cây bụi sống ở vùng nhiệt đới Tây Phi Trong

điều kiện tự nhiên, cây cao khoảng 6 m còn trong điều kiện nhân tạo thì chiều cao khoảng 3 m Loại cây này sinh trưởng tốt ở đất có pH từ 4,5-5,8, trong điều kiện lạnh, chịu bóng và ở nơi có độ ẩm tương đối cao

Cây thần kỳ có quả màu đỏ, kích thước quả nhỏ (hình 1.1A, B), khi nhai phần thịt quả thần kỳ sau đó ăn vị chua chẳng hạn như chanh, lúc đó chanh sẽ có cảm giác ngọt mà không còn vị chua Do vậy, cây này được gọi tên “thần kỳ”, có quả được người dân Châu Phi dùng cách đây hàng trăm năm (Kurihara, Beidler 1968)

Hình 1.1 Cây thần kỳ (Richadella dulcifica) và quả cắt dọc

Tính chất tạo cảm giác ngọt khi sử dụng quả thần kỳ là do miraculin chứa trong quả tạo ra mà bản thân miraculin là không ngọt Ưu điểm của việc sử dụng miraculin là vừa tạo ra cảm giác ngọt vừa có năng lượng hấp thu thấp, do đó rất tốt

cho cải thiện bữa ăn của bệnh nhân tiểu đường và béo phì (Sun et al., 2006a)

Trong tự nhiên, miraculin được tích lũy ở quả của cây thần kỳ 6 tuần tuổi khi quả chuyển từ màu xanh lá cây sang màu cam và miraculin được tích lũy nhiều nhất khi quả ở trạng thái đỏ hoàn toàn, miraculin được tiết ra và tích lũy trong lớp gian

bào của quả thần kỳ (Hirai et al., 2010b) (hình 1.2)

Hình 1.2 Miraculin tự nhiên được tích lũy trong phần thịt quả cây thần kỳ (A) Hàm

lượng miraculin được tích lũy trong thịt quả; (B) Miraculin trong thịt quả được phân tích

bằng Western blot; (C) Các giai đoạn phát triển của quả thần kỳ (Hirai et al., 2010a, Hirai

et al., 2011a, Kim et al., 2010b)

Tại Việt Nam, Trần Danh Thế et al (2009) đã bước đầu trồng thử nghiệm cây

thần kỳ tại Thành phố Hồ Chí Minh, theo dõi đặc điểm sinh học cũng như phân tích thành phần từ thịt quả cây thần kỳ ở giai đoạn chín đỏ, kết quả phân tích cho thấy dịch chiết quả gồm: nước (68,9%), đường tan tổng số (2,38%), đường khử (0,40%), protein (0,10%), đạm tổng số (1,91%) và khoáng tổng số (0,99%) Ngoài ra cũng đã định tính được một số thành phần cơ bản trong dịch chiết thịt quả gồm tinh dầu, carotenoid, phytosterol, acid béo, flavonoid, polyphenol, acid hữu cơ, saponin

steroid, đường khử, hợp chất uronic (Trần Danh Thế et al., 2009)

1.1.2.2 Cấu trúc của miraculin

Miraculin là một glycoprotein, chuỗi polypeptide chứa 220 acid amin trong

đó có 29 acid amin là trình tự tín hiệu (Masuda et al., 1995) Khối lượng phân tử

của chuỗi đơn peptide được tính toán dựa trên trình tự acid amin là khoảng 24,6

kDa, trong đó hàm lượng hydrocacbon chiếm khoảng 13,9% (Theerasilp et al.,

Hình 1.3 Mô hình cấu trúc 3D của protein miraculin dạng homodimer Mũi tên màu xanh:

liên kết disulfide (Cys138-Cys138) giữa hai monomer

Phân tử miraculin có hai vị trí glycosyl hoá là Asn42 và Asn186 tạo thành các

oligosarcharide (Hiwasa-Tanase et al., 2011) Miraculin có bảy phân tử Cys, hình

thành ba chuỗi tương tác qua cầu disulfide ở Cys47-Cys92, Cys148-Cys159 và Cys152Cys155 và một chuỗi tương tác qua cầu disulfide ở Cys138 (Igeta et al., 1991)

-1.1.2.3 Cơ chế tạo cảm giác ngọt của miraculin

Miraculin có bản chất không ngọt, sau khi sử dụng miraculin từ quả thần kỳ thì vị chua của quả chanh có vị ngọt của cam Miraculin có khả năng tạo ra cảm giác ngọt từ các loại acid khác nhau như HCl, acid oxalic, acid lactic, acid formic, acid axetic và acid citric Tác dụng tạo cảm giác ngọt của miraculin phụ thuộc vào

độ chua và độ pH của acid (Kurihara, Beidler 1969) Hoạt tính tạo cảm giác ngọt của dung dịch miraculin đạt mức tối đa sau khi ngậm dung dịch trong miệng khoảng

3 phút (Kurihara, Beidler 1969) Để có thể tạo ra cảm giác ngọt tối đa, nồng độ của miraculin là từ 4.10-7 M và độ ngọt đạt được tương đương với độ ngọt của dung dịch sucrose 0,4 M Tác dụng tạo cảm giác ngọt kéo dài khoảng 1 giờ sau khi sử dụng, tùy thuộc vào nồng độ của dung dịch miraculin

Ở người, vị được cảm nhận nhờ vào các tế bào thụ thể trong chồi vị giác Có

5 loại vị giác cơ bản: mặn, chua, ngọt, đắng và umami, trong đó cảm giác ngọt và vị umami là các vị ngon chính của con người Thụ thể vị giác ở động vật có vú có bản chất là phức hệ G protein, trong đó phức hệ thụ thể cảm giác ngọt là T1R2+T1R3

(Zhao et al., 2003)

Hình 1.4 Mô hình thụ thể T1R2+T1R3 liên kết với protein cảm giác ngọt (A) Mô hình

mô phỏng tương tác giữa protein ngọt với thụ thể; (B) Mô hình phân tử thể hiện tương tác

giữa miraculin với thụ thể T1R2+T1R3 (Kant 2005, Koizumi et al., 2011)

Miraculin có thể làm thay đổi cấu hình của các chồi vị giác trên lưỡi sau khi

sử dụng Điều này có thể là kết quả của sự hoạt hoá các thụ quan cảm giác ngọt trên lưỡi bởi miraculin: đầu tiên protein cảm giác ngọt (ký hiệu màu đỏ, hình 1.4A) sẽ liên kết với thụ thể T1R2+T1R3 ở dạng I, liên kết này làm thay đổi cấu hình của thụ

thể, trở thành dạng II ổn định hơn (Kant 2005, Koizumi et al., 2011) Cơ chế chi tiết

về hoạt động và thuộc tính cảm ứng lưỡi của miraculin đến nay vẫn chưa rõ ràng, có quan niệm cho rằng các chồi vị giác khác nhau cho cảm giác vị khác nhau chẳng hạn như các chồi vị giác nhận ra vị mặn và truyền tín hiệu này lên não để hoạt hóa các thụ quan vị mặn và cho chúng ta có cảm giác vị mặn này Trong trường hợp của miraculin, các tế bào thụ quan cảm giác ngọt trên chồi vị giác không nhận ra vị của

miraculin mà nó hoạt hoá các thụ quan cảm giác ngọt trên não Vì thế miraculin đã

“đánh lừa” não bộ

1.1.2.4 Tình hình nghiên cứu miraculin tái tổ hợp

Cây thần kỳ là loại cây sống ở vùng nhiệt đới, cây không thể sống được nếu nhiệt độ môi trường thấp hơn 7oC, thêm vào đó, cây cần đến 3-4 năm tuổi để có thể

ra hoa và chỉ một phần nhỏ số hoa đó mới được thụ phấn Ngoài ra, hoạt động tạo cảm giác ngọt của miraculin trong quả thần kỳ sẽ bị mất hoạt tính sau khoảng 2-3 giờ thu hoạch khi quả được bảo quản ở nhiệt độ phòng (Kurihara, Nirasawa 1997)

Vì vậy, nguồn miraculin tự nhiênbị hạn chế Từ các tính chất ưu việt của miraculin nên việc sản xuất sinh khối miraculin là cần thiết

Hiện nay, với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, đặc biệt là công nghệ gen đã giúp nghiên cứu và sản xuất thử nghiệm miraculin tái tổ hợp trên

nhiều đối tượng biểu hiện khác nhau như E.coli, nấm men, nấm mốc (Aspergillus

oryzae) và thực vật Miraculin tái tổ hợp được tạo ra trong E.coli không có hoạt tính

tạo cảm giác ngọt mặc dù có biểu hiện protein này (Kurihara 1992) Gần đây,

miraculin tái tổ hợp được biểu hiện lại trong E.coli với một số cải tiến bởi nhóm nghiên cứu Matsuyama et al (2009), nhóm đã thành công trong việc sản xuất

miraculin dimer có hoạt tính Tuy nhiên, hoạt tính của nó chỉ bằng khoảng 1/6 so với miraculin tự nhiên Kết quả này cho thấy quá trình glycosyl hóa là cần thiết cho

quá trình cuộn gấp và ổn định của protein này (Matsuyama et al., 2009) Miraculin

tái tổ hợp có hoạt tính cũng được sản xuất trong nấm mốc (có quá trình glycosyl

hóa) (Ito et al., 2007) Một hệ thống vi sinh vật khác được sử dụng để biểu hiện

miraculin tái tổ hợp là tế bào nấm men có mã di truyền đã tối ưu và bổ sung thêm

trình tự tín hiệu, kết quả là miraculin tái tổ hợp được tạo ra có hoạt tính (Ito et al.,

2010) Hoạt tính của miraculin tái tổ hợp ở cả hệ thống nấm mốc và nấm men được đánh giá là khoảng 1/5 so với hoạt tính của miraculin tự nhiên, kết quả này cũng có thể giải thích rằng không chỉ quá trình glycosyl hóa quan trọng mà còn phụ thuộc vào bản chất của chuỗi đường liên kết, sự sự ổn định của miraculin được tổng hợp

Các nghiên cứu gần đây xác định thực vật là hệ thống thích hợp nhất để sản xuất miraculin có hoạt tính sinh học, có thể ở thực vật nói chung có quá trình

glycosyl hóa tương tự như ở cây thần kỳ Cây xà lách (Lactuca sativa) là thực vật

đầu tiên được sử dụng để biểu hiện miraculin tái tổ hợp, hoạt động của gen này

được điều khiển bởi promoter 35S và NOS terminator, kết quả là miraculin tái tổ

hợp được tạo ra có đầy đủ hoạt tính tạo cảm giác ngọt với độ ngọt tương đương với

miraculin tự nhiên (Sun et al., 2006a) Tuy nhiên, sự “câm lặng” của gen chuyển xảy ra ở các dòng chuyển gen thế hệ con cháu (Sun et al., 2007) Tiếp theo,

miraculin được biểu hiện trong cây dâu tây chuyển gen, đây là loại cây có ưu thế sinh sản vô tính, tuy nhiên miraculin tái tổ hợp được tích lũy có hàm lượng rất thấp, chỉ khoảng 2,0 µg/g khối lượng tươi, mặc dù mức độ tích lũy ổn định qua các thế hệ

nhờ sinh sản vô tính (Sugaya et al., 2008) Miraculin tái tổ hợp cũng đã được biểu

hiện trong cây cà chua, đây được xem là loại cây thích hợp nhất trong số các loài

thực vật được sử dụng để biểu hiện miraculin tái tổ hợp (Kurokawa et al., 2013)

Cây cà chua cũng có nhiều ưu điểm khác như chuyển gen dễ dàng thông qua

Agrobacterium, hiệu suất biến nạp có thể lên đến 40% (Sun et al., 2006b) Các thể

biến nạp có thể thu được trong khoảng 3 tháng sau khi hạt nảy mầm Hơn nữa, cây

cà chua chuyển gen tạo ra miraculin tái tổ hợp có hàm lượng khoảng 90,7 µg/g khối lượng tươi của quả, có đầy đủ hoạt tính tạo cảm giác ngọt, tương đương với

miraculin tự nhiên (Sun et al., 2007) Ngoài ra, mức độ tích lũy và biểu hiện của

gen chuyển là ổn định từ thế hệ T1 đến T5 (Yano et al., 2010) Tuy nhiên, sự tích lũy

của miraculin tái tổ hợp cũng phụ thuộc vào bản chất giống cà chua, số lượng bản

copy của gen chuyển và thời điểm chín của quả cà chua (Hirai et al., 2011a, Hiwasa-Tanase et al., 2011, Sun et al., 2007) Một hệ thống gần đầy cũng được sử

dụng để biểu hiện miraculin tái tổ hợp là cây cam quýt, đây cũng hệ thống này rất

tiềm năng để sản xuất miraculin trong tương lai (Jin et al., 2013)

Trong quá trình nghiên cứu sản xuất miraculin tái tổ hợp cũng như miraculin được phân lập từ tự nhiên, việc xác định chính xác khối lượng phân tử cũng như tinh sạch được sản phẩm này rất quan trọng, phục vụ các nghiên cứu chi tiết Trước

đây các mẫu phân lập được chưa hoàn toàn tinh sạch và do đó việc xác định cấu trúc chủ yếu của miraclin chưa được thực hiện Kỹ thuật tinh sạch miraculin từ quả cây thần kỳ được phát triển từ những năm 1968 (Kurihara, Beidler 1968) Tuy nhiên, các phương pháp này không thể loại bỏ của chất tạo màu polyphenolic và giảm hoạt tính tạo cảm giác ngọt Năm 1988, Theerasilp và Kurihara đã sử dụng dung dịch NaCl để tách chiết dịch thô từ quả thần kỳ, sau đó tiến hành sắc ký trao đổi ion và sắc ký ái lực để tinh sạch miraculin thu được (Theerasilp, Kurihara 1988), khối lượng phân tử được xác định bằng SDS-PAGE là khoảng 28 kDa trong khi các thông báo trước đó đã cho rằng khối lượng của miraculin dao động 40 kDa tới 48 kDa Miraculin là một glycoprotein có chứa khoảng 13,9% carbohydrate (Theerasilp, Kurihara 1988) Gần đây, hệ thống tinh sạch một bước sử dụng sắc ký

ái lực kim loại nikel cố định đã được phát triển (Duhita et al., 2009) Phương pháp

này sử dụng chuỗi histidine tiếp xúc trên bề mặt của dimer miraculin Phương pháp này đơn giản hơn so với các phương pháp trước đây và làm giảm được bước sử dụng cột lọc nên tiết kiệm về thời gian, giảm chi phí cho quá trình tinh sạch Thêm vào đó, phương pháp này cũng cho phép tinh sạch dạng miraculin hoạt tính bởi vì cột IMAC liên kết chỉ với miraculin có cấu trúc không gian 3 chiều ở dạng dimer (cấu trúc không gian này có liên quan đến hoạt động tạo cảm giác ngọt) và không liên kết với miraculin dạng monomer (dạng không có hoạt tính) Mặc dù phương pháp tinh sạch sử dụng IMAC là hiệu quả hơn so với các phương pháp khác, trong tương lai cần thiết phải phát triển các phương pháp khác để ứng dụng trên quy mô công nghiệp

Đối với miraculin tái tổ hợp, quá trình tinh sạch có thể được thực hiện theo phương pháp của Theerasilp và Kurihara (1988) bằng cách thêm sắc ký cột khối lượng phân tử (Sephacryl S-200 HR) nhưng phương pháp này mất thời gian và có

mức độ thu hồi thấp vì liên quan đến nhiều bước tinh sạch (Sun et al., 2007)

1.2 TĂNG CƯỜNG SỰ BIỂU HIỆN CỦA PROTEIN TÁI TỔ HỢP TRONG THỰC VẬT

1.2.1 Lựa chọn hệ thống biểu hiện

Trước đây, cây thuốc lá được xem là cây mô hình phổ biến nhất để sản xuất các protein tái tổ hợp trong thực vật Hiện nay, có rất nhiều hệ thống thực vật được

sử dụng để sản xuất protein tái tổ hợp như cây cà chua, cây chuối, cây lúa, cây ngô, lúa mỳ, cà rốt, đậu tương, đậu Hà Lan, cây khoai tây, cây xà lách và cỏ linh lăng (Sharma, Sharma 2009) Tuy nhiên, không có một hệ thống nào là tối ưu nhất để sản xuất tất cả các sản phẩm tái tổ hợp

Để sản xuất protein tái tổ hợp, các nhà nghiên cứu cần quan tâm tới việc lựa chọn hệ thống biểu hiện, kiểu protein tái tổ hợp cần sản xuất, năng suất, sinh khối, khả năng mở rộng sản xuất… Mỗi hệ thống biểu hiện đều có những ưu điểm rất định để sản xuất một số loại protein, ưu nhược điểm của các hệ thống biểu hiện được chỉ ra ở bảng 1.2

Bảng 1.2 So sánh ưu nhược điểm giữa các hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp

sản xuất

Thời gian sản xuất

Khả năng

mở rộng sản xuất

Mức độ biểu hiện

Glycosyl hóa

Nguy cơ nhiễm bẩn

Giá thành bảo quản

Vi khuẩn Thấp Ngắn Cao Cao Thiếu hụt Nội độc tố Trung bình Nấm men Trung

bình

Trung bình

Cao Thấp-cao Manosyl

hóa cao hơn

Nguy cơ thấp

Virus, các prion

Virus, các prion

Đắt

Nguy cơ thấp

Nguy cơ thấp

1% so với protein tổng số (Daniell et al., 2005), từ đó làm hạn chế quá trình sản

xuất thương mại các protein mong muốn

Do vậy, để khai thác được những ưu điểm của hệ thống thực vật cần có thêm các chiến lược khác nhằm tăng cường sự biểu hiện của protein tái tổ hợp

1.2.2 Lựa chọn promoter (trình tự khởi đầu phiên mã)

Sự biểu hiện của gen đích thường được điều hòa ở nhiều mức độ khác nhau trong đó những gen có hoạt động phiên mã cao thường dẫn đến hàm lượng protein tạo ra cao hơn Điều hòa sự phiên mã là bước điều hòa sớm trong quá trình biểu hiện protein tái tổ hợp Do vậy, các nỗ lực hiện nay của các nhà nghiên cứu đều tập trung vào bước này để nhằm tăng mức độ phiên mã

Để sự phiên mã diễn ra ở mức độ cao, cần sự biểu hiện mạnh của yếu tố điều hòa “promoter” Promoter gồm một trình tự nucleotide phía đầu 5‟ của điểm khởi đầu phiên mã gen cấu trúc, đóng vai trò then chốt trong việc biểu hiện gen Promoter có chứa các trình tự cần thiết cho RNA polymerase bám vào để bắt đầu quá trình phiên mã và điều khiển sự phiên mã Việc hiểu biết về thành phần của promoter và các yếu tố liên quan tới hoạt động của nó sẽ mở ra triển vọng điều khiển sự biểu hiện gen ở mức phiên mã Promoter có thể được phân loại thành một

số nhóm dựa trên hoạt động của chúng

Promoter cấu trúc

Các promoter điều khiển sự biểu hiện của gen không chịu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường hay yếu tố phát triển được gọi là promoter cấu trúc (constitutive promoter) Promoter cấu trúc thường được sử dụng để sản xuất protein tái tổ hợp ở tất cả các mô của thực vật Trong số các promoter cấu trúc, promoter CaMV35S (viết tắt 35S) được sử dụng rộng rãi để biểu hiện ở mức độ cao các protein tái tổ

hợp (Gutierrez-Ortega et al., 2005) Hoạt động của promoter 35S ở cây hai lá mầm

hiệu quả hơn so với cây một lá mầm có thể là do sự khác nhau về chất lượng hoặc

số lượng của các yếu tố điều hòa

Promoter 35S cũng được sử dụng để sản xuất một số protein kháng nguyên trong thực vật như CTB (cholera toxin B subunit), LTB (heat-labile enterotoxin B subunit), HbsAg (hepatitis B surface antigen), kháng nguyên bảo vệ, glycoprotein G

của virus gây bệnh dại, glycoprotein của virus gây bệnh SARS (Li et al., 2006b) và

một số sản phẩm khác có tác dụng chữa bệnh hoặc đóng vai trò quan trọng trong công nghiệp như kháng thể đơn dòng, tơ nhện, peptide SMAP-29, streptavidin,

avidin và adiponectin (Berberich et al., 2005)

Promoter Ubiquitin là một promoter cấu trúc cũng được sử dụng phổ biến Promoter này được phân lập từ nhiều loại cây trồng khác nhau như ngô,

Arabidopsis, khoai tây, cây hướng dương, cây thuốc lá, cây lúa (Wang, Oard 2003)

Stoger et al đã chuyển nạp thành công gen scFvT84.66 vào cây lúa với promoter

ubiquitin phân lập từ cây ngô và promoter 35S đã cải biến Kết quả cho thấy kháng thể tái tổ hợp được biểu hiện ở mô lá và hạt khi sử dụng promoter ubiquitin trong khi các dòng được chuyển cấu trúc mang promoter 35S chỉ biểu hiện ở mô lá,

không có ở hạt (Stoger et al., 2000) Một số phân tử như CTB, LTB, HbsAg,

interferon người, avidin và aprotonin cũng đã được biểu hiện thành công ở thực vật

khi sử dụng promoter ubiquitin (Kang et al., 2006) Gần đây, Hernandez-Garcia et

al (2009) đã thông báo đặc tính của promoter polyubiquitin được phân lập từ cây

đậu tương, đây là một promoter cấu trúc hoạt động mạnh hơn so với các promoter

cấu trúc khác (Hernandez-Garcia et al., 2009)

Ngoài hai loại promoter cấu trúc được sử dụng phổ biến ở trên, các nghiên cứu cũng sử dụng promoter cấu trúc khác như promoter anopine synthase, promoter cryptic từ cây thuốc lá, promoter Mac là một promoter lai giữa promoter mannopine synthase và promoter 35S có trình từ tăng cường, promoter actin từ lúa, promoter actin của cây chuối, promoter C1 của virus gây bệnh xoăn lá cây bông và promoter nopaline synthase để sản xuất các phân tử sinh học trong thực vật (Sharma, Sharma 2009)

Promoter đặc hiệu ở mô

Promoter điều khiển sự biểu hiện của gen ở trong một loại mô hoặc ở một giai đoạn phát triển nhất định của thực vật được gọi là promoter đặc hiệu mô Các gen được chuyển dưới sự điều khiển của promoter này sẽ chỉ biểu hiện ở mô đặc hiệu, không biểu hiện ở các mô còn lại của cây Các promoter này giúp tập trung các sản phẩm chuyển gen ở những cơ quan đích như hạt, quả… mà không ảnh hưởng đến sinh trưởng của các mô, cơ quan còn lại của cây Đến nay, đã có một số promoter đặc hiệu đã được nghiên cứu và sử dụng cho mục đích biểu hiện các phân

tử sinh học ở các cơ quan đặc hiệu của thực vật Promoter patatin đặc hiệu ở củ được phân lập từ khoai tây đã được sử dụng để biểu hiện CTB, LTB, HbsAg,

dextran và dạng đột biến của enzym sucrase trong củ khoai tây (He et al., 2007)

Quả được cho là cơ quan đích thích hợp cho biểu hiện đặc hiệu các kháng nguyên

vaccine vì quả có thể sử dụng trực tiếp mà không cần chế biến Promoter E8 là

promoter đặc hiệu ở quả được phân lập từ cây cà chua đã được sử dụng để biểu hiện

nhiều kháng nguyên khác nhau trong quả (Jiang et al., 2007) Một số promoter đặc

hiệu đã được phân lập để biểu hiện các phân tử sinh học trong một số mô cơ quan đặc hiệu như ở hạt gồm promoter arcelin, promoter globulin-1, promoter zein từ cây ngô, promoter globulin 7S, promoter glutelin từ lúa và promoter của tiểu phần P-conglycinin a‟ từ đậu tương (Sharma, Sharma 2009) Các promoter đặc hiệu ở hạt

đã được sử dụng để biểu hiện pro-insulin, laccase, epitope của tế bào lympho T của

người, provitamin A và phytase (Aluru et al., 2008) Promoter arcelin được các

nghiên cứu khẳng định là điều khiển mạnh hoạt động của gen ngoại lai ở mức độ

phiên mã trong thực vật Promoter arcelin 5-1 từ cây đậu cũng đã được sử dụng để biểu hiện scFv với hàm lượng chiếm 36% protein tan tổng số

Promoter đặc hiệu ở lục lạp cũng được sử dụng để biểu hiện các protein tái tổ

hợp trong bào quan này Promoter RNA ribosom 16S (Prrn) hoặc promoter của gen

psbA là hai promoter đặc hiệu ở lục lạp được sử dụng phổ biến trong các nghiên cứu

biểu hiện kháng nguyên bảo vệ, CTB, LTB và insulin (Ruhlman et al., 2007)

Promoter của gen rbcs đặc hiệu ở lá được sử dụng để biểu hiện tiểu phần vaccine đậu mùa, endoglucanase E1 và xylanase (Golovkin et al., 2007) Gần đây, Wakasa et al (2009) đã thông báo về hệ thống biểu hiện đặc hiệu ở callus để sản xuất các protein tái tổ hợp ở thực vật (Wakasa et al., 2009)

Promoter cảm ứng

Promoter cảm ứng là các promoter hoạt động dưới sự điều khiển của các hóa chất như cồn, tetracyline, steroid… hoặc bởi các yếu tố vật lý như hạn hán, mặn, nhiệt độ, ánh sáng… Sự biểu hiện liên tục của các phân tử ngoại lai bao gồm cả protein dưới sự điều khiển của promoter cấu trúc trong một số trường hợp có thể ảnh hưởng tới sinh trưởng và phát triển của thực vật, thậm chí làm cho thực vật không thể tái sinh được Để vượt qua được khó khăn này có thể sử dụng promoter biểu hiện đặc hiệu ở mô hoặc promoter cảm ứng bởi các hóa chất để điều khiển sự biểu hiện của gen chuyển trong thực vật Các promoter này “nghỉ” khi vắng mặt các yếu tố cảm ứng Việc sử dụng các promoter cảm ứng bởi hóa chất kết hợp với các yếu tố phiên mã đáp ứng với hóa chất có thể giới hạn sự biểu hiện của gen chuyển ở

mô, cơ quan đặc hiệu thậm chí là loại tế bào (Zuo, Chua 2000)

Để gen biểu hiện mạnh dưới sự điều khiển của promoter cảm ứng thì cần yếu

tố cảm ứng phải có độ đặc hiệu cao với promoter, không độc với thực vật, thực vật phải đáp ứng nhanh với yếu tố cảm ứng, dễ dàng thực hiện và nếu yếu tố đó là hóa chất thì tốt nhất là thực vật ngoài tự nhiên không chứa hợp chất này Promoter cảm

ứng bởi sự thiếu hụt sucrose của gen alpha amylase (αAmy3) đã được sử dụng để biểu hiện interferon γ của người (Chen et al., 2004) Promoter của gen αAmy3 cũng

được sử dụng để điều khiển sự biểu hiện của hormon sinh trưởng người ở tế bào

huyền phù cây lúa (Kim et al., 2008) Promoter cảm ứng cũng được sử dụng để sản

xuất yếu tố kích thích của bạch cầu hạt (hGM-CSF) ở tế bào lúa được nuôi cấy huyền phù và kết quả cho thấy hàm lượng hGM-CSF cao hơn so với đối chứng

được biểu hiện trong cây thuốc lá sử dụng promoter cấu trúc (Shin et al., 2003)

Ngoài ra còn nhiều promoter cảm ứng bởi tetracycline, ecdysone, estrogen, glucocorticoid, cồn đã được sử dụng trong thực vật Về cơ bản, các promoter cảm ứng chứa hai đơn vị phiên mã Sản phẩm của đơn vị phiên mã thứ nhất là một yếu

tố phiên mã, đáp ứng với tín hiệu cảm ứng là hóa chất Đơn vị phiên mã thứ 2 chứa một yếu tố có vai trò hoạt hóa yếu tố phiên mã Yếu tố phiên mã đáp ứng với hóa chất có thể được điều hòa bằng cách sử dụng promoter cấu trúc hoặc promoter đặc hiệu, cung cấp thêm một cơ chế điều hòa bổ sung cho gen chuyển

Promoter nhân tạo

Là promoter được con người tạo ra thông qua các thao tác kỹ thuật trong sinh học phân tử Promoter nhân tạo gồm các yếu tố tối thiểu như hộp TATA cần thiết hoạt động của RNA polymerase II, một điểm khởi đầu phiên mã và một trình tự điều hòa CCAAT giúp cho hoạt động của promoter ở sinh vật nhân chuẩn Ngoài các yếu tố tối thiểu, các promoter nhân tạo cũng cần có các yếu tố khác để giúp cho promoter này có thể hoạt động điều hòa ngược chiều hoặc xuôi chiều (Novina, Roy 1996) Các promoter nhân tạo được thiết kế trước đây là sự kết hợp giữa các yếu tố

cis gồm trình tự tăng cường và trình tự hoạt hóa hoặc ức chế Các nghiên cứu cũng

chỉ ra rằng để promoter hoạt động hiệu quả thì phụ thuộc rất nhiều vào số motif nhắc lại và khoảng cách giữa các motif trong promoter (Gurr, Rushton 2005) Để tăng hiệu quả hoạt động của promoter 35S, trình tự tăng cường được lặp lại nhiều

lần (Guerineau et al., 1992) Promoter lai mac được thiết kế bằng cách kết hợp một phần promoter mac với trình tự tăng cường của promoter 35S, hoạt động của promoter này làm tăng sự biểu hiện của GUS từ 3-5 lần ở trong lá và tăng 10-15 lần

ở trụ dưới lá mầm và rễ so với đối chứng sử dụng promoter 35S có trình tự tăng

cường lặp lại 2 lần (Comai et al., 1990)

1.2.3 Ảnh hưởng terminator đến sự biểu hiện của gen chuyển

Sự biểu hiện của gen cũng phụ thuộc vào terminator và đầu 3‟UTR của gen Terminator và đầu 3‟UTR điều hòa sự biểu hiện bằng cách điều khiển quá trình kết thúc sự phiên mã ở đầu 3‟ của gen và quá trình polyadenin cho phân tử tiền RNA mới hình thành, giúp ribosome tái hoạt động một cách nhanh chóng Các terminator khác nhau có ảnh hưởng rõ rệt tới mức độ biểu hiện của gen và hiệu quả dịch mã

(Nagaya et al., 2010), làm tăng mức độ biểu hiện lên 60 lần trong nghiên cứu biểu hiện tạm thời (Ingelbrecht et al., 1989) Sử dụng terminator HSP18.2 được phân lập

từ cây Arabidopsis để biểu hiện tiểu phần B của Shiga toxin 2e trong cây xà lách,

kết quả cho thấy các dòng xà lách chuyển gen thế hệ T0 có hàm lượng sản phẩm tái

tổ hợp cao gấp khoảng 40 lần so với đối chứng sử dụng NOS terminator (Matsui et

al., 2011) Hirai et al (2011b) đã sử dụng terminator HSP để cải thiện mức độ tích

lũy miraculin tái tổ hợp trong cây cà chua, kết quả phân tích hàm lượng miraculin tích lũy ở thế hệ T1 đạt 1,726 µg/g khối lượng tươi, tương đương với 17,1% tổng

protein tan, cao gấp 10 lần so với đối chứng sử dụng NOS terminator (Hirai et al.,

hợp (Daniell et al., 2009) Chiến lược này được thực hiện bằng cách thay đổi trình

tự nucleotide mà không làm thay đổi trình tự acid amin tương ứng (Gustafssion et

al., 2004) Bằng cách sử dụng chiến lược này, Perlak et al đã biểu hiện thành công

gen cryIA (b) của vi khuẩn Bacillus thuringiensis trong cây thuốc lá và cây cà chua,

kết quả là sự biểu hiện của gen cryIA (b) tăng gấp 100 lần so với đối chứng chuyển

gen cryIA (b) không đổi mã di truyền (Perlak et al., 1991) Các thực nghiệm trên

cây thuốc lá được biểu hiện protein phát huỳnh quang (GFP) đã chứng minh lợi ích

của việc thay đổi mã di truyền của gen chuyển ở thực vật (Rouwendal et al., 1997)

Thực vật một lá mầm và thực vật hai lá mầm khác nhau về mã di truyền được sử dụng, thậm chí ngay trong cùng một hệ thống thực vật cũng có sự khác nhau giữa hệ di truyền nhân và lạp thể của thực vật (Liu, Xue 2005) Trong một số trường hợp, thay vì thay đổi toàn bộ trình tự của gen chuyển, có thể sử dụng đột biến định hướng Đột biến định hướng được sử dụng để loại bỏ các codon hiếm bằng cách thay thế một base nitơ Tuy nhiên, trong khi thay đổi mã di truyền cần tránh việc mở rộng hoặc tập trung lại các codon phổ biến, để không ảnh hưởng đến tốc độ của tRNA Hệ gen ở thực vật là giàu tỷ lệ base nitơ AU, xong sự lặp lại của các trình tự AUUUA được cho là gây sự bất ổn đối với quá trình phiên mã

biểu hiện của gen chuyển trong thực vật (Kang et al., 2004c)

Theo Kang et al (2006), bằng cách sử dụng gen ctxB được thay đổi mã di

truyền các codon phổ biến cho phù hợp với cây thuốc lá và hàm lượng GC trong gen được tăng từ 33% lên 45% để biểu hiện ở cây thuốc lá, kết quả thu được là các

dòng cây thuốc lá chuyển gen ctxB có mã di truyền được thay đổi có biểu hiện cao hơn so với các dòng cây thuốc lá được chuyển gen ctxB không thay đổi mã di truyền là 15 lần dưới sự điều khiển của cùng promoter 35S (Kang et al., 2006) Các

gen có mã di truyền được thay đổi cũng đã được sử dụng để sinh tổng hợp các phân

tử sinh học trong thực vật (Kang et al., 2006, Streatfield 2007)

Ngoài ra, để thúc đẩy sự dịch mã của gen đích trong hệ biểu hiện, các trình

tự xung quanh vị trí dịch mã khởi đầu cần được thay đổi để phù hợp với trình tự điều hòa khởi đầu (consensus initiation sequence) Trình tự điều hòa khởi đầu ở

thực vật thường ở xung quanh mã khởi đầu AUG, có thể là AACAAUGGC hoặc UAAACAAUGGCU, các trình tự này có sự khác biệt so với ở động vật

(CACCAUGG) (Lutcke et al., 1987) Sự thay đổi ở các vị trí -5, -4, -2 và -1 thành

base nitơ C còn các vị trí -3 và +4 giữ nguyên base nitơ cho thấy hiệu quả dịch mã cao hơn, ví dụ GGUUUAUGU được chuyển thành CCUCCAUGU làm tăng đáng

kể quá trình dịch mã (Gallie 1993)

1.2.5 Lựa chọn dòng biểu hiện

Về lý thuyết, tăng số bản copy của gen chuyển trong thực vật chuyển gen có thể làm tăng sự biểu hiện của protein tái tổ hợp Tuy nhiên, cây chuyển gen mang nhiều bản copy không phải luôn có mức độ biểu hiện của protein tái tổ hợp cao mà thường dẫn tới hiện tượng “câm” gen Do đó, các nhà nghiên cứu thường lựa chọn

những dòng mang một bản copy nhằm hạn chế hiện tượng “câm” gen (Jones et al.,

2005) Sử dụng biểu hiện đặc hiệu hoặc promoter cấu trúc yếu có thể giảm được hiện tượng trên (Depicker, Van Montagu 1997) Quá trình biến nạp gen với nhiều

bản copy có thể giảm xuống nhờ sử dụng Agrobacterium (Dai et al., 2001) Bổ sung

trình tự MAR (matrix attachment region) cũng giảm hiện tượng gen “câm” Ngoài

ra, các dòng chuyển gen mang một bản copy của gen chuyển có mức độ biểu hiện cao có thể được lai giống tạo ra các cây chuyển gen có số bản copy và mức độ biểu hiện tăng lên nhưng có thể giảm hiện tượng gen “câm” (Streatfield 2007)

1.3 NGHIÊN CỨU VỀ CHUYỂN GEN TRONG DÒNG TẾ BÀO BY2,

RỄ TƠ VÀ CÂY CÀ CHUA

1.3.1 Dòng tế bào thuốc lá BY2 (Nicotiana tabacum Bright Yellow 2)

Thực vật đã được sử dụng để biểu hiện các protein tái tổ hợp trong nhiều thập kỷ qua (Howard, Hood 2005) Hệ thống biểu hiện này có nhiều ưu điểm hơn so với hệ thống vi sinh vật và hệ thống dòng tế bào động vật trong quá trình sản xuất

protein tái tổ hợp về giá thành sản xuất (Daniell et al., 2001) và khả năng cải biến protein sau dịch mã trong đó có quá trình glycosyl hóa (Karnoup et al., 2005) Hệ

thống dòng tế bào huyền phù bắt nguồn từ thực vật mang nhiều ưu điểm hơn so với

các hệ thống khác như tránh được thời tiết bất thường của tự nhiên, loại bỏ được nguy cơ việc du nhập gen ra ngoài môi trường và không tiềm ẩn những bệnh lây nhiễm trên động vật Tế bào thực vật có chu kỳ sinh trưởng nhanh, thời gian cần thiết để mở rộng sản xuất protein tái tổ hợp trong hệ thống nuôi cấy tế bào thực vật

sau khi biến nạp có thể được tính bằng ngày hoặc tuần (Plasson et al., 2009) Giống

như tế bào vi sinh vật, tế bào thực vật có thể sinh trưởng nhanh trong môi trường rẻ tiền nhưng do lại là tế bào nhân thực nên nó có thể thực hiện nhiều cải biến sau dịch

mã, điều này là cần thiết cho các protein tái tổ hợp để giữ được hoạt tính giống như

protein ngoài tự nhiên (Kwon et al., 2003)

Quá trình thu nhận dòng tế bào từ mô thực vật cũng tương đối dễ dàng và đã

có rất nhiều dòng tế bào được thu nhận từ thực vật bậc cao như đậu tương (Smith et

al., 2002), cà rốt (Aviezer et al., 2008) Trong số đó, dòng tế bào thuốc lá NT-1 và

BY2 thường được sử dụng làm hệ thống để sản xuất protein tái tổ hợp (Nagata et

al., 1992) do quá trình mở rộng sản xuất ngắn thông qua nuôi cấy trong hệ thống

bioreactor (Eibl, Eibl 2008), có độ đồng đều cao và có tỷ lệ sinh trưởng cao gấp 80 đến 100 lần so với tế bào bình thường, quá trình biến nạp gen đích thông qua vi

khuẩn A tumefaciens cũng như quá trình thu nhận tế bào nuôi cấy huyền phù thực hiện dễ dàng (Nagata et al., 1992)

Dòng tế bào BY2 có thể được sử dụng làm mô hình để nghiên cứu sự biểu hiện, quá trình bài tiết, sự hoàn thiện và ổn định của các protein tái tổ hợp mong

muốn (Plasson et al., 2009) Cho đến nay, có một số nghiên cứu đã biểu hiện thành công protein tái tổ hợp trong dòng tế bào BY2 như kháng thể biscFv (Fischer et al.,

1999), kháng thể đơn dòng của người kháng kháng nguyên bề mặt của virus viêm

gan B (mAb against HbsAg) (Yano et al., 2004), albumin tái tổ hợp huyết thanh người (recombinant human serum albumin-rHSA) (Sun et al., 2011) Một số nghiên

cứu đã chuyển sang giai đoạn sản xuất protein tái tổ hợp ở quy mô công nghiệp

bằng hệ thống BY2 như sản xuất protein tái tổ hợp hydrophobin (Reuter et al.,

2014)

Với ưu điểm của BY2 thì việc sản xuất protein tái tổ hợp miraculin tạo vị ngọt trong các dòng tế bào thuốc lá BY2 sẽ là một trong những hướng nghiên cứu

có triển vọng và dễ dàng kiểm tra mức độ biểu hiện miraculin tái tổ hợp trong tế bào thực vật trước khi được nó chuyển vào cây chủ

1.3.2 Hệ thống nuôi cấy rễ tơ thực vật

Rễ tơ (Hairy root) là một bệnh ở thực vật gây bởi Agrobacterium rhizogenes,

một loại vi khuẩn đất thuộc nhóm Gram âm Khi vi khuẩn xâm nhiễm vào thực vật, đoạn T-DNA nằm giữa vùng RB và LB của plamid Ri của vi khuẩn sẽ được chuyển

và dung hợp vào hệ gen của cây chủ Quá trình biến nạp này tạo ra một sản phẩm có

giá trị đó là rễ tơ, rễ tơ được hình thành ở vị trí mà vi khuẩn xâm nhiễm (Chilton et

al., 1982)

Rễ tơ có đặc điểm sinh trưởng nhanh và phân nhánh mạnh, có thể sinh trưởng tốt trên môi trường không có chất điều hòa sinh trưởng Tốc độ sinh trưởng trung bình của rễ tơ dao động trong khoảng từ 0,1-2,0 khối lượng khô/lít/ngày Nuôi cấy rễ tơ thực vật có ưu thế là dễ dàng nuôi cấy, môi trường nuôi cấy đơn giản, rẻ tiền, dễ dàng sản xuất một lượng sinh khối lớn trong khoảng thời gian ngắn và quan trọng hơn cả rễ tơ thực vật không mang các mầm bệnh cho người, được xem là một trong những xu hướng hiện nay được sử dụng để biểu hiện các dược phẩm sinh học tái tổ hợp Hơn nữa, rễ tơ có thể được nuôi cấy tạo sinh khối liên tục, điều này có ý nghĩa trong dây chuyền sản xuất các chất thứ cấp và các dược phẩm sinh học tái tổ hợp Thêm vào đó, rễ được biến nạp có mức phân hóa cao và có thể là nguồn sản xuất ổn định các hợp chất thứ cấp, trong khi các hệ thống nuôi cấy tế bào thực vật khác có tiềm năng di truyền và hóa sinh không ổn định và thường tổng hợp mức độ

rất thấp các hợp chất thứ cấp (Kittipongpatana et al., 1998) Quan trọng nhất là A

rhizogenes có thể chuyển T-DNA từ vector nhị thể và cho phép các gen ngoại lai

biểu hiện ở rễ tơ được chuyển gen và từ rễ tơ chuyển gen này có thể tái sinh thành cây chuyển gen (Christey, Sinclair 1992)

Khi so sánh với thực vật chuyển gen, nuôi cấy rễ tơ thực vật có ưu điểm lớn trong công tác sản xuất các dược phẩm sinh học tái tổ hợp là không đòi hỏi diện tích canh tác, không chịu ảnh hưởng vào khí hậu, mùa vụ, sản phẩm thu được không mang các yếu tố độc hại từ thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ và rút ngắn được rất nhiều thời gian trong trồng trọt Đặc biệt hơn, hệ thống nuôi cấy lỏng các mô tế bào thực vật việc biểu hiện dược phẩm sinh học tái tổ hợp ra ngoài môi trường nuôi cấy giúp làm đơn giản hơn rất nhiều trong quá trình tinh sạch các dược phẩm sinh học này

Hiện nay, nuôi cấy rễ tơ thực vật đã được sử dụng cho quá trình sản xuất protein tái tổ hợp (Wongsamuth, Doran 1997a) và các dược phẩm sinh học tái tổ

hợp như SEAP (human secreted alkaline phosphatase) (Giddings et al., 2000), protein huỳnh quang kết hợp với protein ricin B (GFP-ricin B) (Mason et al.,

2002)và đặc biệt hơn cả là các kháng thể và các chuỗi nặng, chuỗi nhẹ của kháng

thể (Drake et al., 2003)

Tương tự như hệ thống biểu hiện BY2, việc sử dụng rễ tơ thực vật để biểu hiện miraculin tái tổ là một hướng nghiên cứu triển vọng và giúp sản xuất các sản phẩm tái tổ hợp ở quy mô phòng thí nghiệm

1.3.3 Cây cà chua chuyển gen

Cà chua được sử dụng như là loại cây mô hình trong nghiên cứu chuyển gen, trong đó có giống cà chua mini (Micro-Tom), đây là giống cà chua có kích thước

nhỏ có đặc điểm tương tự cây mô hình Arabidopsis thaliana như kích thước nhỏ,

vòng đời ngắn (70-90 ngày, kể từ ngày gieo hạt đến khi quả chín) và kích thước hệ gen nhỏ (950 Mb) Tuy nhiên, giống cà chua mini có ưu điểm hơn so với

Arabidopsis là cây có thể được trồng ở nhiều vùng sinh thái khác nhau trên thế giới,

từ đó giúp mở rộng diện tích cây cà chua chuyển gen một các dễ dàng

Hiện nay, các nghiên cứu tạo cây cà chua chuyển gen thường sử dụng trung

gian A tumefaciens với hiệu suất chuyển gen từ 20-56% (Pineda et al., 2010, Qiu et

al., 2007), quá trình biến nạp tạo cà chua chuyển gen có thể thực hiện trên nhiều

loại bộ phận khác nhau của cây như lá mầm, lóng, trụ dưới và trên lá mầm… khả

năng tái sinh còn chịu ảnh hưởng lớn của nồng độ Zeatin, BAP (Sivankalyani et al., 2014) Đỗ Xuân Đồng et al (2007) đã nghiên cứu hệ thống tái sinh ở một số cà chua

giống và nhận thấy ảnh hưởng của nồng độ ZR lên khả năng tạo chồi của một số giống cà chua cho thấy, ở nồng độ 2 mg/l, tỷ lệ tạo thành chồi và cây đạt cao nhất (92%) đối với giống PT18, hai giống còn lại cho tỷ lệ thấp hơn từ 78-83% Điều này cho thấy, ngoài ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng, ảnh hưởng do sai khác về kiểu di truyền giữa các giống cây cho kết quả tạo chồi cây cũng rất khác nhau Kết quả tái sinh cây ở trên được tiếp tục sử dụng cho nghiên cứu xây dựng quy trình

chuyển gen vào cây cà chua PT18 thông qua vi khuẩn A tumefaciens thu được tỉ lệ tạo cây chuyển gen là khá cao 13,6% (Đỗ Xuân Đồng et al., 2007) Bên cạnh đó,

nhiều nghiên cứu tìm hiểu các yếu tố liên quan đến quy trình chuyển gen cà chua bao gồm kiểu gen của cà chua, loại vector chuyển gen, plasmid trợ giúp, chủng vi khuẩn… cũng như các ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng (BAP, zeatin,

IAA) lên tái sinh mô cà chua (Yasmeen et al., 2009)

Các nghiên cứu chuyển gen cà chua tập trung chủ yếu vào nâng cao chất lượng cà chua bằng cách thay đổi hàm lượng các chất dinh dưỡng có lợi cho con người Bên cạnh đó, chuyển gen cà chua còn quan tâm tới công nghệ chín chậm, phòng chống sâu bệnh và các điều kiện bất lợi của ngoại cảnh, ứng dụng trong sản xuất vaccine ăn được và trong nghiên cứu cơ bản

Nghiên cứu ứng dụng chuyển gen để cải thiện chất lượng cà chua thường quan tâm đến hàm lượng dinh dưỡng và hương vị của quả Năm 2000, thí nghiệm nhằm tăng thêm hàm lượng của tiền vitamin A đã được thực hiện bằng cách đưa

vào gen PSY-1 mã hóa phytoene desaturase, kết quả là hàm lượng β-carotene trong

các dòng cà chua chuyển gen tăng gấp 3 lần, chiếm tới 45% tổng hàm lượng carotenoid Các dòng cà chua được chuyển gen này không bị ảnh hưởng tới sinh

trưởng và phát triển(Römer et al., 2000) Thí nghiệm chuyển gen CYC-B và LCY-B

đã tăng hàm lượng lycopen và β-carotene Sử dụng gen GES có thể làm tăng mùi vị của quả do thay đổi chất tiết sinh học (Davidovich-Rikanati et al., 2007) Năm

2011, Seo et al đã biểu hiện thành công enzym homogentisate phytyltransferase thu

từ cây táo trên cây cà chua giống Micro-Tom Đây là gen mã hóa cho enzym quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp tocopherol (vitamin E) Kết quả cho thấy các dòng cà chua chuyển gen ở thế hệ T1 có α-tocopherol và β-tocopherol cao hơn từ 1,8 đến 3,6 và 1,6 đến 2,9 lần so với đối chứng Kết quả này cho thấy tiềm năng sản

xuất tocopherol trong cây cà chua (Seo et al., 2011)

Gần đây, các nghiên cứu tập trung nhiều vào sản xuất hợp chất flavonoid (chất có nhiều tác dụng tích cực trong phòng chống ung thư) trong cây cà chua Đã

có nhiều gen liên quan đến con đường sinh tổng hợp flavonoid được quan tâm

nghiên cứu chuyển vào cà chua nhằm tăng sự tích lũy flavonoid (Muir et al., 2001)

Cùng với khoai tây, chuối và các loại cây trồng khác, cà chua đang được thử

nghiệm vào việc sản xuất và cung cấp vaccine ăn được (Alvarez et al., 2006) Năm

2001, Mor et al đã tiến hành biểu hiện acetylcholin esterase tái tổ hợp của người

trong cây cà chua chuyển gen Enzym này được ứng dụng trong trị liệu Enzym thu được từ các dòng cà chua chuyển gen có độ ổn định và giữ được hoạt tính giống như enzym trong cơ thể người, có hoạt độ riêng cao, lên đến 25 nmol/phút/mg

protein ở lá và đạt tới 250 nmol/phút/mg protein ở quả (Mor et al., 2001) Các thử

nghiệm lâm sàng đã được tiến hành trên chuột bằng cách sử dụng cà chua biểu hiện kháng thể hoặc các protein kích thích sản xuất kháng thể kháng lại một số virus như

viêm gan B, virus dại, HIV, bệnh than và virus hợp bào hô hấp (Lal et al., 2007)

Một số nhà khoa học Hàn Quốc đang nghiên cứu việc sử dụng cà chua để biểu hiện

một loại vaccine tái tổ hợp chống lại virus SAR (Pogrebnyak et al., 2005) Năm

2013, Kantor đã tiến hành biểu hiện gen kháng nguyên PfCP của ký sinh trùng sốt rét (Plasmodium falciparum), nghiên cứu đã thu được các dòng cà chua biểu hiện protein PfCP-2.9 (kháng nguyên lai của MSP1 và AMA1 của ký sinh trùng sốt rét)

Nhóm tác giả sử dụng mẫu lá mầm 7 ngày tuổi của giống cà chua Summer để làm

vật liệu, biến nạp thông qua A tumefaciens, thu được các dòng biểu hiện protein ổn

định từ thế hệ T0 đến T1 (Kantor et al., 2013) Năm 2014, Chung et al đã biểu hiện

gen của protein khảm (HAV VP1-Fc) chứa gen VP1 của virus viêm gan A ở người (HAV) và mảnh kháng thể Fc trên cây cà chua, protein tái tổ hợp VP1-Fc thu được

có khối lượng phân tử khoảng 68 kDa được tinh sạch, sử dụng protein tái tổ hợp đã tinh sạch để đánh giá đặc tính miễn dịch thông qua tiêm kháng nguyên lên màng bụng của chuột, nhóm nghiên cứu đã thu được kháng thể đặc hiệu IgG trong huyết thanh của chuột Kết quả này cho thấy cây cà chua có thể được sử dụng như một hệ

thống tốt để sản xuất kháng nguyên HAV (Chung et al., 2014) Năm 2015, Jha et al

đã tiến hành biểu hiện và tinh sạch chất ức chế α1-proteinase của người (α1-PI), một chất có tiềm năng trong y học, gen α1-PI được tối ưu mã di truyền cho phù hợp với hệ thống biểu hiện là cây cà chua, cũng như gắn thêm các trình tự làm tăng mức

độ tích lũy của protein này (trình tự biểu hiện protein ở lưới nội chất) Mức độ tích lũy của α1-PI tái tổ hợp chiếm từ 1,5-3,2% protein tan tổng số, enzym được biểu hiện có hoạt tính sinh học cao Phân tích khối phổ của α1-PI cho thấy cấu trúc của α1-PI có độ tương đồng với α1-PI tự nhiên Kết quả này cũng mở ra hướng nghiên cứu sử dụng thực vật như các bioreactor để sản xuất các protein dược phẩm có hoạt

tính sinh học ổn định (Jha et al., 2015)

Hiện nay đã có một số công trình nghiên cứu biểu hiện protein ngọt và protein tạo cảm giác ngọt trên đối tượng cây cà chua Trong số đó, miraculin tái tổ hợp bắt đầu được tập trung nghiên cứu, chủ yếu được thực hiện bởi các nhà khoa học Nhật Bản Tuy nhiên, các nhà nghiên cứu cũng cho rằng mức độ tích lũy của miraculin tái tổ hợp trong cây còn thấp, cần phải có các nghiên cứu tiếp theo Ngoài miraculin, thaumatin II cũng là một loại protein ngọt được quan tâm nghiên cứu

Năm 2012, Firsov et al đã biểu hiện thành công thaumatin II thu từ cây

Thaumatococcus daniellii Benth Trình tự cDNA của gen này được dòng hóa trong

vector chuyển gen pBI121, promoter điều khiển là 35S Kết quả cho thấy, tất cả các dòng cà chua chuyển gen đều biểu hiện thaumatin II tái tổ hợp Hàm lượng thaumatin tái tổ hợp đạt cao nhất ở dòng 91, với 46,4±10,5 µg/mg protein tan (tương đương 4,6%) Kết quả này cho thấy cây cà chua là một hệ thống tiềm năng

để sản xuất thaumatin thương mại (Firsov et al., 2012) Năm 2015, Reddy et al

nghiên cứu cải thiện mùi hương và chất lượng quả cà chua bằng cách biểu hiện gen nhân tạo mã hóa cho protein ngọt monellin Monellin là một protein có vị ngọt