Nghiên cứu biểu hiện protein tái tổ hợp miraculin trong dòng tế bào BY2, rễ tơ thuốc lá và cây cà chua chuyển gen

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LA VIỆT HỒNG NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP MIRACULIN TRONG DÒNG TẾ BÀO BY2, RỄ TƠ THUỐC LÁ VÀ CÂY CÀ CHUA CHUYỂN GEN LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI, 2015 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LA VIỆT HỒNG NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP MIRACULIN TRONG DÒNG TẾ BÀO BY2, RỄ TƠ THUỐC LÁ VÀ CÂY CÀ CHUA CHUYỂN GEN Chuyên ngành : Sinh lý học thực vật Mã số : 62 42 01 12 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Chu Hoàng Hà Viện Công nghệ sinh học HÀ NỘI, 2015 i Lời cảm ơn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Chu Hoàng Hà tận tình hƣớng dẫn, động viên giúp đỡ suốt trình thực luận án Xin cảm ơn lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, cán Phòng Quản lý tổng hợp, phận quản lý đào tạo sau đại học tạo điều kiện thuận lợi để hoàn thành luận án Tôi xin cảm ơn Ban Giám Hiệu, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh-KTNN, Phòng Tổ chức cán bộ, Phòng Khoa học Công nghệ trƣờng ĐHSP Hà Nội tạo điều kiện giúp đỡ mặt suốt trình thực nghiên cứu Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới TS Phạm Bích Ngọc-Phòng Công nghệ tế bào thực vật, PGS.TS Lê Văn Sơn-Phòng Công nghệ ADN ứng dụng, Viện Công nghệ sinh học tạo điều kiện giúp đỡ đóng góp ý kiến quý báu để hoàn thành đề tài Trong thời gian thực đề tài nhận đƣợc giúp đỡ tận tình tập thể cán Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Phòng Công nghệ ADN ứng dụng Nhân dịp xin chân thành cảm ơn giúp đỡ quý báu Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, ngƣời thân, bạn đồng nghiệp, ngƣời động viên góp ý cho thời gian qua Hà Nội, tháng năm 2015 Nghiên cứu sinh La Việt Hồng ii Lời cam đoan Tôi xin cam đoan: Đây công trình nghiên cứu số kết cộng tác với cộng khác; Các số liệu kết trình bày luận án trung thực, phần công bố tạp chí khoa học chuyên ngành với đồng ý cho phép đồng tác giả; Phần lại chƣa đƣợc công bố công trình khác Hà Nội, ngày 19 tháng năm 2015 Tác giả La Việt Hồng iii Mục lục Lời cảm ơn i Lời cam đoan ii DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT ix MỞ ĐẦU .1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu .2 Ý nghĩa lý luận ý nghĩa thực tiễn .3 4.1 Ý nghĩa lý luận 4.2 Ý nghĩa thực tiễn Đóng góp luận án Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 PROTEIN NGỌT, PROTEIN TẠO CẢM GIÁC NGỌT VÀ MIRACULIN .4 1.1.1 Protein protein tạo cảm giác 1.1.2 Đặc điểm sinh học thần kỳ miraculin 1.2 TĂNG CƢỜNG SỰ BIỂU HIỆN CỦA PROTEIN TÁI TỔ HỢP TRONG THỰC VẬT .14 1.2.1 Lựa chọn hệ thống biểu .14 1.2.2 Lựa chọn promoter (trình tự khởi đầu phiên mã) .15 1.2.3 Ảnh hƣởng terminator đến biểu gen chuyển 20 1.2.4 Thay đổi mã di truyền gen đích cho phù hợp với hệ thống biểu 20 1.3 NGHIÊN CỨU VỀ CHUYỂN GEN TRONG DÒNG TẾ BÀO BY2, RỄ TƠ VÀ CÂY CÀ CHUA 22 1.3.1 Dòng tế bào thuốc BY2 (Nicotiana tabacum Bright Yellow 2) .22 1.3.2 Hệ thống nuôi cấy rễ tơ thực vật 24 1.3.3 Cây cà chua chuyển gen 25 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 iv 2.1 VẬT LIỆU 30 2.1.1 Vật liệu thực vật 30 2.1.2 Vector chủng vi khuẩn 30 2.1.3 Hóa chất thiết bị máy móc 31 2.1.4 Địa điểm thời gian nghiên cứu .31 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.2.1 Thay đổi mã di truyền gen miraculin cho phù hợp với hệ thống biểu họ cà 33 2.2.2 Thiết kế mồi 34 2.2.3 Phân lập promoter terminator 34 2.2.4 Thiết kế vector chuyển gen mang gen miraculin 38 2.2.5 Phƣơng pháp tạo dòng tế bào BY2, rễ tơ thuốc cà chua chuyển gen 41 2.2.6 Phân tích tiêu sinh lý dòng chuyển gen 43 2.2.7 Phân tích dòng chuyển gen kỹ thuật sinh học phân tử 44 2.2.8 Phân tích biểu gen dòng chuyển gen 47 2.2.9 Phân tích thống kê kết thực nghiệm .48 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .49 3.1 THAY ĐỔI MÃ DI TRUYỀN CỦA GEN MIRACULIN PHÙ HỢP VỚI HỆ BIỂU HIỆN Ở CÂY HỌ CÀ PHÂN LẬP PROMOTER E8, PROMOTER VÀ TERMINATOR HSP 18.2 49 3.1.1 Thay đổi mã di truyền gen miraculin phù hợp với hệ biểu họ cà 49 3.1.2 Phân lập tách dòng promoter E8 từ cà chua, promoter terminator HSP 18.2 từ Arabidopsis .51 3.2 THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MIRACULIN VÀO DÒNG TẾ BÀO BY2, RỄ TƠ THUỐC LÁ VÀ CÂY CÀ CHUA .58 3.2.1 Thiết kế vector chuyển gen pBI121/35S-pro/Mir/NOS-ter 58 3.2.2 Thiết kế vector chuyển gen pBI121/35S-pro/Mir/HSP-ter 60 3.2.3 Thiết kế vector chuyển gen pBI121/E8-pro/Mir/HSP-ter 62 3.2.4 Thiết kế vector chuyển gen pBI121/HSP-pro/Mir/HSP-ter 63 v 3.2.5 Biến nạp vector chuyển gen mang gen miraculin vào Agrobacterium .65 3.3 BIỂU HIỆN PROTEIN MIRACULIN TÁI TỔ HỢP TRONG DÒNG TẾ BÀO BY2 VÀ HỆ THỐNG RỄ TƠ THUỐC LÁ .66 3.3.1 Biểu protein miraculin tái tổ hợp dòng tế bào BY2 66 3.3.2 Biểu protein miraculin tái tổ hợp rễ tơ thuốc 71 3.4 BIỂU HIỆN PROTEIN MIRACULIN TÁI TỔ HỢP TRONG CÂY CÀ CHUA 79 3.4.1 Tạo dòng cà chua chuyển gen miraculin .79 3.4.2 Kiểm tra có mặt gen miraculin dòng cà chua kỹ thuật PCR 83 3.4.3 Phân tích biểu mức mRNA gen miraculin số dòng cà chua chuyển gen .84 3.4.4 Xác định số copy dòng cà chua chuyển gen kỹ thuật Southern 85 3.4.5 Đánh giá số tiêu sinh trƣởng số dòng cà chua chuyển gen 86 Chƣơng THẢO LUẬN 91 4.1 Tăng cƣờng biểu protein tái tổ hợp thực vật .91 4.2 Biểu miraculin tái tổ hợp dòng tế bào BY2 rễ tơ thuốc .94 4.3 Biểu miraculin tái tổ hợp cà chua chuyển gen .99 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .104 NHỮNG CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 105 SUMMARY 106 Overview: 106 Objectives: .107 Contents: 107 Results: 107 Discussion: 108 TÀI LIỆU THAM KHẢO .112 vi DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Một số đặc tính protein tạo cảm giác Bảng 1.2 So sánh ƣu nhƣợc điểm hệ thống biểu protein tái tổ hợp 14 Bảng 2.1 Trình tự nucleotide cặp mồi sử dụng nghiên cứu 34 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng lai ghép tạo vector tái tổ hợp 37 Bảng 3.1 So sánh trình tự promoter E8 phân lập với trình tự promoter E8 công bố 53 Bảng 3.2 So sánh trình tự nucleotide promoter HSP 18.2 phân lập đƣợc với trình tự gen/promoter HSP 18.2 công bố 56 Bảng 3.3 Kết tạo chọn lọc dòng tế bào BY2 mang gen chuyển miraculin 66 Bảng 3.4 Khối lƣợng tƣơi khối lƣợng khô số dòng tế bào BY2 chuyển gen 69 Bảng 3.5 Kết tạo dòng rễ tơ chuyển gen miraculin 72 Bảng 3.6 Khối lƣợng tƣơi khối lƣợng khô số dòng rễ tơ chuyển gen 75 Bảng 3.7 Chỉ tiêu chiều dài số dòng rễ tơ chuyển gen 76 Bảng 3.8 Kết tạo dòng cà chua chuyển gen miraculin 81 Bảng 3.9 Một số tiêu sinh trƣởng hình thái năm dòng cà chua chuyển gen 87 vii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cây thần kỳ (Richadella dulcifica) cắt dọc Hình 1.2 Miraculin tự nhiên đƣợc tích lũy phần thịt thần kỳ Hình 1.3 Mô hình cấu trúc 3D protein miraculin dạng homodimer Hình 1.4 Mô hình thụ thể T1R2+T1R3 liên kết với protein cảm giác 10 Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 32 Hình 3.1 Trình tự gen miraculin trƣớc (AB512278.1) sau thay đổi mã di truyền 50 Hình 3.2 Hình ảnh điện di sản phẩm phân lập nhân dòng promoter E8 52 Hình 3.3 Hình ảnh điện di sản phẩm phân lập nhân dòng promoter HSP 18.2 55 Hình 3.4 Hình ảnh điện di sản phẩm phân lập nhân dòng terminator HSP 18.2 57 Hình 3.5 Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pBI121/35S-pro/Mir/NOS-ter 58 Hình 3.6 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt ghép tạo vector chuyển gen pBI121/35S-pro/Mir/NOS-ter 59 Hình 3.7 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt ghép tạo vector chuyển gen pBI121/35S/Mir/HSP-ter 61 Hình 3.8 Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pBI121/E8-pro/Mir/HSP-ter 62 Hình 3.9 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt ghép tạo vector chuyển gen pBI121/E8-pro/Mir/HSP-ter 63 Hình 3.10 Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pBI121/HSP-pro/Mir/HSP-ter 63 Hình 3.11 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt ghép tạo vector chuyển gen pBI121/HSP-pro/Mir/HSP-ter 64 Hình 3.12 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt vector chuyển gen thu từ Agrobacterium 65 Hình 3.13 Quá trình tạo dòng tế bào thuốc BY2 mang gen miraculin 67 Hình 3.14 Hình ảnh điện di kiểm tra có mặt gen miraculin dòng BY2 kỹ thuật PCR 68 viii Hình 3.15 Hình ảnh phân tích biểu protein miraculin số dòng tế bào BY2 chuyển gen 70 Hình 3.16 Hàm lƣợng miraculin tái tổ hợp số dòng BY2 chuyển gen 71 Hình 3.17 Quá trình tạo chọn lọc dòng rễ tơ đƣợc chuyển gen miraculin 73 Hình 3.18 Hình ảnh điện di kiểm tra có mặt gen miraculin dòng rễ tơ kỹ thuật PCR 74 Hình 3.19 Hình ảnh chiều dài số dòng rễ tơ thuốc chuyển gen 74 Hình 3.20 Hình ảnh phân tích biểu protein miraculintrong số dòng rễ tơ 78 Hình 3.21 Hàm lƣợng miraculin tái tổ hợp số dòng rễ tơ chuyển gen 79 Hình 3.22 Quá trình tạo sàng lọc cà chua chuyển gen miraculin 82 Hình 3.23 Hình ảnh điện di kiểm tra có mặt gen miraculin dòng cà chua kỹ thuật PCR 83 Hình 3.24 Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR kiểm tra biểu mRNA gen chuyển miraculin dòng cà chua 84 Hình 3.25 Hình ảnh xác định số copy dòng cà chua chuyển gen kỹ thuật Southern Blot 86 Hình 3.26 Hình ảnh dòng cà chua chuyển gen tự nhiên 88 Hình 3.27 Quả cà chua giai đoạn chín đỏ 89 Hình 3.28 Hàm lƣợng miraculin tái tổ hợp vỏ cà chua chuyển gen 89 121 in transgenic tomato suspension cultures Biotechnology Letters 25:15711574 85 Lal P, Ramachandran V, Goyal R, Sharma R (2007) Edible vaccines: current status and future Indian J Med Microbiol 25(2):93-102 86 Lê Trần Bình, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải, Trƣơng Nam Hải, Lê Quang Huấn (2003) Áp dụng kỹ thuật phân tử nghiên cứu tài nguyên sinh vật Việt Nam Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội 87 Lee S, Lee J, Chang H, Cho J, Jung J, Lee W (1999) Solution structure of a sweet protein single-chain monellin determined by nuclear magnetic resonance and dynamical simulated annealing calculations Biochemistry 38(8):2340-2346 88 Li H, Ramalingam S, Chye M (2006b) Accumulation of recombinant SARSCoV spike protein in plant cytosol and chloroplasts indicate potential for development of plant-derived oral vaccines Exp Biol Med 231:1346-1352 89 Liu Q, Xue Q (2005) Comparative studies on codon usage pattern of chloroplasts and their host nuclear genes in four plant species J Genet 84(1):55-62 90 Lohmann C, Egger-Schumacher G, Wunderlich M, Schoffl F (2004) Two different heat shock transcription factors regulate immediate early expression of stress genes in Arabidopsis Mol Gennet Genomics 271(1):11-21 91 Lutcke H, Chow K, Mickel F, Moss K, Kern H, Scheele G (1987) Selection of AUG initiation codon differs in plants and animals EMBO J 6(1):43-48 92 Mandal MK, Fischer R, Schillberg S, Schiermeyer A (2014) Inhibition of protease activity by antisense RNA improves recombinant protein production in Nicotiana tabacumcv Bright yellow (BY-2) suspension cells Biotechnol J 9:1065-1073 doi: 10.1002/biot.201300424 93 Mason H, Warzecha H, Mor T, Arntzen C (2002) Edible plant vaccines: application for prophylactic and molecular medicine Trends Mol Med 8(7):324-329 122 94 Masuda T, Kitabatake N (2006) Developments in biotechnological production of sweet proteins J Biosci Bioeng 102:375-389 95 Masuda Y, Nirasawa S, Nakaya K, Kurihara Y (1995) Cloning and sequencing of a cDNA encoding a taste-modifying protein, miraculin Genes Dev 161:175-177 96 Matsui T, Takita E, Sato T, Aizawa M, Ki M, Kadoyama Y, Hirano K, Kinjo S, Asao H, Kawamoto K, Kariya H, Makino S, Hamabata T, Sawada K, Kato K (2011) Production of double repeated B subunit of Shiga toxin 2e at high levels in transgenic lettuce plants as vaccine material for porcine edema disease Transgenic Res 20:735-748 97 Matsuyama T, Satoh M, Nakata R, Aoyama T, Inoue H (2009) Functional expression of miraculin, a taste-modifying protein in Escherichia coli J Biochem 145:445-450 98 Menzel G, Harloff H, Jung C (2003) Expression of bacterial poly (3hydroxybutyrate) synthesis genes in hairy roots of sugar beet (Beta vulgaris L.) Appl Microbiol Biotechnol 60:571-576 99 Meyer P (1996b) Repeat-induced gene silencing: common mechanisms in plants and fungi Biol Chem Hoppe Seyler 37787-95 100 Mor T, Sternfeld M, Soreq H, Arntzen C (2001) Expression of Recombinant Human Acetylcholinesterase in Transgenic Tomato Plants Biotechnology and Bioengineering 75(3):259-266 101 Muir S, Collins G, Robinson S, Hughes S, Bovy A, De Vos C, Van Tunen A, Verhoeyen M (2001) Overexpression of petunia chalcone isomerase in tomato results in fruit containing dramatically increased levels of flavonoids Nat Biotechnol 19(5):470-474 102 Nagata T, Nemoto Y, Seiichiro H (1992) Tobacco BY-2 cell line as the “HeLa” cell in the cell biology of higher plants Int Rev Cytol 13:21-30 123 103 Nagaya S, Kawamura K, Shinmyo A, Kato K (2010) The HSP terminator of Arabidopsis thaliana increases gene expression in plant cells Plant Cell Physiol 51:328-332 104 Chu Văn Mẫn (2010) Tin học công nghệ sinh học Nhà xuất Giáo dục Việt Nam 105 Nirasawa S, Nishino T, Katahira M, Uesugi S, Hu Z, Kurihara Y (1994) Structures of heat-stable and unstable homologues of the sweet protein mabinlin The difference in the heat stability is due to replacement of a single amino acid residue Eur J Biochem 223(3):989-995 106 Niemer M, Mehofer U, Torres Acosta JA,Verdianz M, Henkel T, Loos A, et al (2014) The human anti-HIV antibodies 2F5, 2G12, and PG9 differ in their susceptibility to proteolytic degradation:down-regulation of endogenous serine and cysteine proteinase activities could improve antibody production in plantbased expression platforms Biotechnol J 9:493-500 doi: 10.1002/biot.201300207 107 Nocarova E, Fischer L (2009) Cloning of transgenic tobacco BY-2 cells; an efficient method to analyse and reduce high natural heterogeneity of transgene expression BMC Plant Biol 108 Novina C, Roy A (1996) Core promoters and transcriptional control Trends Genet 12:351-355 109 Ota M, Sawa A, Nio N, Ariyoshi Y (1999) Enzymatic ligation for synthe-sis of single-chain analogue ofmonellin by transglutaminase Biopolymers 50(2):193-200 110 Peñarrubia L, Kim R, Giovannoni J, Kim S, Fischer R (1992) Production of the sweet protein monellin in transgenic plants Nat Biotechnol 10:561-564 111 Perlak F, Fuchs R, Dean D, McPherson S, Fischhoff D (1991) Modification of the coding sequence enhances plant expression of insect control protein genes Proc Natl Acad Sci USA 88(8):3324-3328 124 112 Pham Bich Ngoc: Production and Secretion of Recombinant Sweet-Tasting Thaumatin from Suspension Cells and Hairy Roots of Nicotiana tabacum University of Heidelberg, Germany (2009) 113 Pineda B, Gimenez-Caminero E, Garcia-Sogo B, Anton M, Atarés A, Capel J, Lozano R, Angosto T, Moreno V (2010) Genetic and physiological characterization of the arlequin insertional mutant reveals a key regulator of reproductive development in tomato Plant Cell Physiol 51(3):435-447 114 Plasson C, Michel R, Lienard D, Saint-Jore-Dupas C, Sourrouille C, de March G, Gomord V (2009) Production of recombinant proteins in suspensioncultured plant cells Methods Mol Biol 483:145-161 115 Pogrebnyak N, Golovkin M, Andrianov V, Spitsin S, Smirnov Y, Egolf R KH (2005) Severe acute respiratory syndrome (SARS) S protein production in plants: development of recombinant vaccine Proc Natl Acad Scie USA 102(25):9062-9067 116 Qiu D, Diretto G, Tavarza R, Giuliano G (2007) Improved protocol for Agrobacterium mediated transformation of tomato and production of transgenic plants containing carotenoid biosynthetic gene CsZCD Sci Hortic 112(2):172-175 117 Reddy C, Vijayalakshmi M, Kaul T, Islam T, Reddy M (2015) Improving Flavour and Quality of Tomatoes by Expression of Synthetic Gene Encoding Sweet Protein Monellin Mol Biotechnol 57(5):448-453 118 Reuter L, Bailey M, Joensuu J, Ritala A (2014) Scale-up of hydrophobinassisted recombinant protein production in tobacco BY-2 suspension cells Plant Biotechnology Journal 12(4):402-410 119 Römer S, Fraser P, Kiano J, Shipton C, Misawa N, Schuch W, Bramley P (2000) Elevation of the provitamin a content of transgenic tomato plants Nat Biotechnol 18(6):666-669 125 120 Rouwendal G, Mendes O, Wolbert E, Boer A (1997) Enhanced expression in tobacco of the gene encoding green fluorescent protein by modification of its codon usage Plant Mol Biol 33:989-999 121 Ruhlman T, Ahangari R, Devine A, Samsam M, Daniell H (2007) Expression of cholera toxin B-proinsulin fusion protein in lettuce and tobacco chloroplasts-oral administration protects against development of insulitis in non-obese diabetic mice Plant Biotechnol J 5:495-510 122 Saidi Y, Schaefer D, Goloubinoff P, Zrÿd J-P, Finka A (2009) The CaMV 35S promoter has a weak expression activity in dark grown tissues of moss Physcomitrella patens Plant Signaling & Behavior 4(5):457-459 123 Seo Y, Kim S, Harn C, Kim W (2011) Ectopic expression of apple fruit homogentisate phytyltransferase gene (MdHPT1) increases tocopherol in transgenic tomato (Solanum lycopersicumcv Micro-Tom) leaves and fruits Phytochemistry 72:321-329 124 Sharma A, Sharma M (2009) Plants as bioreactors: Recent developments and emerging opportunities Biotechnology Advances 27:811-832 125 Sharp J, Doran P (2001) Strategies for enhancing mono-clonal antibody accumulation in plant cell and organ cultures Biotechnol Prog 17:979-992 126 Shin Y, Hong S, Kwon T, Jang Y, Yang M (2003) High level of expression of recombinant human granulocyte-macrophage colony stimulating factor in transgenic rice cell suspension culture Biotechnol Bioeng 82:778-783 127 Sivankalyani V, Takumi S, Thangasamy S, Ashakiran K, Girija S (2014) Punctured-hypocotyl method for high-efficient transformation and adventitious shoot regeneration of tomato Scientia Horticulturae 165:357364 128 Smith M, Mason H, Shuler M (2002) Hepatitis Bsurface antigen (HBsAg) expression in plant cell culture: Kinetics of antigen accumulation in batch culture and its intracellular form Biotechnology and Bioengineering 80:812822 126 129 Stoger E, Vaquero C, Torres E, Sack M, Nicholson L, Drossard J, et al (2000) Cereal crops as viable production and storage systems for pharmaceutical scFv antibodies Plant Mol Biol 42:583-590 130 Streatfield S (2007) Approaches to achieve high-level heterologous protein production in plants Plant Biotechnol J 5(1):2-15 131 Sugaya T, Yano M, Sun H-J, Hirai T, Ezura H (2008) Transgenic strawberry expressing a taste-modifying protein, miraculin Plant Biotechnol J 25:329333 132 Sun H-J, Cui M, Ma B, Ezura H (2006a) Functional expression of the tastemodifying protein, miraculin, in transgenic lettuce FEBS Lett 580620-626 133 Sun H-J, Kataoka H, Yano M, Ezura H (2007) Genetically stable expression of functional miraculin, a new type of alternative sweetener, in transgenic tomato plants Plant Biotech J 5:768-777 134 Sun H-J, Uchii S, Watanabe S, Ezura H (2006b) A highly efficient transformation protocol for Micro-Tom, a model cultivar for tomato functional genomics Plant Cell Physiol 47:426-431 135 Sun Q, Ding L, Lomonossoff G, Sun Y, Luo M, Li C, Jiang L, Xu Z (2011) Improved expression and purification of recombinant human serum albumin from transgenic tobacco suspension culture J Biotechnol 155(2):164-172 136 Theerasilp S, Hitotsuya H, Nakajo S, Nakaya K, Nakamura Y, Kurihara Y (1989) Complete amino acid sequence and structure characterization of the taste-modifying protein, miraculin J Biol Chem 264:6655-6659 137 Theerasilp S, Kurihara Y (1988) Complete purification and charac- terization of the taste-modifying protein, miraculin, from miracle fruit J Biol Chem 263:11536-11539 138 Torregrosa L, Bouquet A (1997) Agrobacterium rhizogenes and A tumefaciens co-transformation to obtain grapevine hairy roots producing the coat protein of grapevine chrome mosaic nepovirus Plant Cell Tiss Org Cult 49:53-62 127 139 Trần Danh Thế, Vũ Văn Độ, Ngô Kế Sƣơng (2009) Bƣớc đầu trồng thử nghiệm tách chiết hoạt chất miraculin trái thần kỳ (Synsepalum Dulcificum Daniell) Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ 13(1):54-61 140 Twyman R, Schillberg S, Fischer R (2013) Optimizing the yield of recombinant pharmaceutical proteins in plants Curr Pharm Des 19: 54865494 doi: 10.2174/1381612811319310004 141 van der Wel H, Larson G, Hladik A, Hladik C, Hellekant G, Glaser D, Dai S, Zheng P, Marmey P, Zhang S, Tian W, Chen S, et al (1989) Isolation and characterisation of pentadin, the sweet principle of Pentadiplandra brazzeana Baillon Chem Senses 14:75-79 142 Wakasa Y, Ozawa K, Takaiwa F (2009) Higher-level accumulation of foreign gene products in transgenic rice seeds by the callus-specific selection system J Biosci Bioeng 107:78-83 143 Wang J, Oard J (2003) Rice ubiquitin promoters: deletion analysis and potential usefulness in plant transformation systems Plant Cell Rep 22:129134 144 Wolin S, Walter P (1988) Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA EMBO J 7:3559–3569 145 Wongsamuth R, Doran P (1997a) Hairy roots as an expression system for production of antibodies In: In: Hairy Roots Culture and Applications, 8997, Harwood, Australia 146 Xin Z, Chen J (2012) A high throughput DNA extraction method with high yield and quality Plant Methods 826 147 Yano A, Maeda F, Takekoshi M (2004) Transgenic tobacco cells producing the human monoclonal antibody to hepatitis B virus surface antigen J Med Virol 73:208-215 148 Yano M, Hirai T, Kato K, Hiwasa-Tanase K, Fukuda N, Ezura H (2010) Tomato is a suitable material for producing recombinant miraculin protein in genetically stable manner Plant Sci 178:469-473 128 149 Yasmeen A, Mirza B, Inayatullah S, Safdar N, Jamil M, Ali S, Choudhry M (2009) In planta transformation of tomato Plant Mol Biol Rep 27(1):20-28 150 Zemanek E, Wasserman B (1995) Issues and advances in the use of transgenic organisms for the production of thaumatin, the intensely sweet protein fromThaumatococcus danielli Crit Rev Food Sci Nutr 35(5):455-466 151 Zhao G, Zhang Y, Hoon M, Chandrashekar J, Erlenbach I, Ryba N, Zuker C (2003) The receptors for mammalian sweet and umami taste Cell 115(3):255266 152 Zuo J, Chua N (2000) Chemical-inducible systems for regulated expression of plant genes Curr Opin Biotechnol 11:146-151 PHỤ LỤC So sánh trình tự nucleotide promoter E8 thu đƣợc với trình tự AF515784.1 DQ317599.1 E8 promoter AF515784.1 DQ317599.1 10 20 30 40 50 60 70 | | | | | | | | | | | | | | AAGCTTTCCC TAATGATATT GTTCATGTAA TTAAGTTTTG TGGAAGTGAG AGAGTCCAAT GAATTCATTT TT.ACA .C E8 promoter AF515784.1 DQ317599.1 80 90 100 110 120 130 140 | | | | | | | | | | | | | | TTTGATAAGA AAAGAGTCAG AAAACGTAAT ATTTTAAAAG TCTAAATCTT TCTACAAATA AGAGCAAATT E8 promoter AF515784.1 DQ317599.1 150 160 170 180 190 200 210 | | | | | | | | | | | | | | TATTTATTTT TTAATCCAAT AAATATTAAT GGAGGACAAA TTCAATTCAC TT-GGTTGTA AAATAAACTT T - E8 promoter AF515784.1 DQ317599.1 220 230 240 250 260 270 280 | | | | | | | | | | | | | | AAACCAATAA CCAAAGAACT AATAAATCCT GAAGTGGAAT TATTAAGGAT AAATGTACAT AGACAATGAA G N - - E8 promoter AF515784.1 DQ317599.1 290 300 310 320 330 340 350 | | | | | | | | | | | | | | GAAATAATAG GTTCGATGAA TTAATAATAA TTAAGGATGT TACAATCATC ATGTGCCAAG TATATACACA E8 promoter AF515784.1 DQ317599.1 360 370 380 390 400 410 420 | | | | | | | | | | | | | | ATATTCTATG GGATTTATAA TTTCGTTACT TCACTTAACT TTTGCGTAAA TAAAACGAAT TATCTGATAT E8 promoter AF515784.1 DQ317599.1 430 440 450 460 470 480 490 | | | | | | | | | | | | | | TTTATAATAA AACAGTTAAT TAAGAACCAT CATTTTTAAC AACATAGATA TATTATTTCT AATAGTTTAA E8 promoter AF515784.1 DQ317599.1 500 510 520 530 540 550 560 | | | | | | | | | | | | | | TGATACTTTT AAATCTTTTA AATTTTATGT TTCTTTTAGA AAATAAAAAT TCAAAAAA-T TAAATATATT - A E8 promoter AF515784.1 DQ317599.1 570 580 590 600 610 620 630 | | | | | | | | | | | | | | TACAAAAACT ACAATCAAAC ACAACTTCAT ATATTAAAAG CAAAATATAT TTTGAAAATT TCAAGTGTCC E8 promoter AF515784.1 DQ317599.1 640 650 660 670 680 690 700 | | | | | | | | | | | | | | TAACAAATAA GACAAGAGGA AAATGTACGA TGAGAGACAT AAAGAGAACT AATAATTGAG GAGTCCTATA E8 promoter AF515784.1 DQ317599.1 710 720 730 740 750 760 770 | | | | | | | | | | | | | | ATATATAATA AAGTTTATTA GTAAACTTAA TTATTAAGGA CTCCTAAAAT ATATGATAGG AGAAAATGAA E8 promoter AF515784.1 DQ317599.1 780 790 800 810 820 830 840 | | | | | | | | | | | | | | TGGTGAGAGA TATTGGAAAA CTTAATAATT AAGGATTTTA AAATATATGG TAAAAGATAG GCAAAGTATC N 850 860 870 880 890 900 910 E8 promoter AF515784.1 DQ317599.1 | | CATTATCCCC | | TTTTAACTTG | | AAGTCTAC-T - C | | AGGCGCATGT | | GAAAG-TTGA .- G | | TTTTTTGTCA | | CGTCATATAG E8 promoter AF515784.1 DQ317599.1 920 930 940 950 960 970 980 | | | | | | | | | | | | | | CTATAACGTA AAAAAAGAAA GTAAAATTTT TAATTTTTTT TAATATATGA CATATTTTAA ACGAAATATA E8 promoter AF515784.1 DQ317599.1 990 1000 1010 1020 1030 1040 1050 | | | | | | | | | | | | | | GGACAAAATG TAAATGAATA GTAAAGGAAA CAAAGATTAA TACTTACTTT GTAAGAATTT AAGATAAATT E8 promoter AF515784.1 DQ317599.1 1060 1070 1080 1090 1100 1110 1120 | | | | | | | | | | | | | | TAAAATTTAA TAGATCAACT TTACGTCTAG AAAGACCCTA TCTTAGAAGG AATTTCA-GA AATCGGCCCT AT ATC C AT ATC C E8 promoter AF515784.1 DQ317599.1 1130 1140 1150 1160 1170 1180 1190 | | | | | | | | | | | | | | TTTTCAAAAA TAACTTTTAA ATAATGAATT TTAAATTTTA AGAAATAATT TCCAATGAAT AAATGACATG A G A A .A E8 promoter AF515784.1 DQ317599.1 1200 1210 1220 1230 1240 1250 1260 | | | | | | | | | | | | | | TAGCATTTTA CCTAAATATT TCAACTATTT TAATCCAATA TTAATTTGTT T-ATTCCCAA CAATAGAAAG .T T E8 promoter AF515784.1 DQ317599.1 1270 1280 1290 1300 1310 1320 1330 | | | | | | | | | | | | | | TCTTGTGCAG ACATTTAATC TGACTTTTCC AGTACTAAAT ATTAATTTTC TGAAGATTTT CGGGTTTAGT E8 promoter AF515784.1 DQ317599.1 1340 1350 1360 1370 1380 1390 1400 | | | | | | | | | | | | | | CCACAAGTTT TAGTGAGAAG TTTTGCTCAA AATTTTAGGT GAGAAGGTTT GATATTTATC TTTTGTTAAA .- E8 promoter AF515784.1 DQ317599.1 1410 1420 1430 1440 1450 1460 1470 | | | | | | | | | | | | | | TTAATTTATC TAGGTGACTA TTATTTATTT AAGTAGAAAT TCATATCATT ACTTTTGCCA ACTTGTAGTC E8 promoter AF515784.1 DQ317599.1 1480 1490 1500 1510 1520 1530 1540 | | | | | | | | | | | | | | ATAATAGGAG TAGGTGTATA TGATGAAGGA ATAAACAAGT TCAGTGAAGT GATTAAAATA AAATATAATT E8 promoter AF515784.1 DQ317599.1 1550 1560 1570 1580 1590 1600 1610 | | | | | | | | | | | | | | TAGGTGTACA TCAAATAAAA ACCTTAAAGT TTAGAAAGGC ACCGAATAAT TTTGCATAGA AGATATTAGT E8 promoter AF515784.1 DQ317599.1 1620 1630 1640 1650 1660 1670 1680 | | | | | | | | | | | | | | AAATTTATAA AAATAAAAGA AATGTAGTTG TCAAGTTGTC TTCTTTTTTT TGGATAAAAA TAGCAGTTGG AF515784.1 DQ317599.1 1690 1700 1710 1720 1730 1740 1750 | | | | | | | | | | | | | | CTTATGTCAT TCTTTTACAA CCTCCATGCC ACTTGTCCAA TTGTTGACAC TTAACTAATT AGTTTGATTC Hộp CAAT A E8 promoter AF515784.1 1760 1770 1780 1790 1800 1810 1820 | | | | | | | | | | | | | | ATGTATGAAT ACTAAATAAT TTTTTAGGAC TGACTCAAAT ATTTTTATAT TATCATAGTA ATATTTATCT E8 promoter DQ317599.1 E8 promoter AF515784.1 DQ317599.1 1830 1840 1850 1860 1870 1880 1890 | | | | | | | | | | | | | | AATTTTTAGG ACCACTTATT ACTAAATAAT AAATTAACTA CTACTATATT ATTGTTGTGA AACAACAACG T A AF515784.1 DQ317599.1 1900 1910 1920 1930 1940 1950 1960 | | | | | | | | | | | | | | TTTTGGTTGT TATGATGAAA CGTACACTAT ATCAGTATGA AAAATTCAAA ACGATTAGTA TAAATTATAT Hộp GATA E8 promoter AF515784.1 DQ317599.1 1970 1980 1990 2000 2010 2020 2030 | | | | | | | | | | | | | | TGAAAATTTG ATATTTTTCT ATTCTTAATC AGACGTATTG GGTTTCATAT TTTAAAAAGG GACTAAACTT E8 promoter AF515784.1 DQ317599.1 2040 2050 2060 2070 2080 2090 2100 | | | | | | | | | | | | | | AGAAGAGAAG TTTGTTTGAA ACTACTTTTG TCTCTTTCTT GTTCCCATTT CTCTCTTAGA TTTCAAAAAG Hộp TATA E8 promoter AF515784.1 DQ317599.1 2110 2120 2130 2140 2150 2160 2170 | | | | | | | | | | | | | | TGAACTACTT TATCTCTTTC TTTGTTCACA TTTTATTTTA TTCTATTATA AATATGGCAT CCTCATATTG E8 promoter AF515784.1 DQ317599.1 2180 2190 2200 2210 | | | | | | | | | AGATTTTTAG AAATTATTCT AATCATTCAC AGTGCAAAAG AAGGGATCC - - E8 promoter Trình tự màu xanh lần lƣợt là: trình tự biểu đặc hiệu (phụ thuộc ethylen): vị trí 1343-1489 trình tự điều khiển trình chín độc lập với ethylen: vị trí: 1943-2168 So sánh trình tự nucleotide promoter HSP 18.2 thu đƣợc với trình tự X17295.1 10 20 30 40 50 60 70 80 90 | | | | | | | | | | | | | | | | | | HSP 18.2 pro AAGCTTATGG TCATTTCTTC TGGTTCAAGC ATGACATGAA CAGGCAATAA ATAAGTTGAG ATTTTGATCA CAGTAACTGA TACTTGAATC Hộp CAAT Hộp GAGA X17295.1 HSP 18.2 pro X17295.1 100 110 120 130 140 150 160 170 180 | | | | | | | | | | | | | | | | | | GAATCATTTA GATTTTTTTT TTTTTTAGTT TACTTGTTTA GTAAATATGT TGTCTATGTT TGTCACAAAA ACGTGGCTCA GTTCTTGTAT HSP 18.2 pro X17295.1 190 200 210 220 230 240 250 260 270 | | | | | | | | | | | | | | | | | | ATATGGAGAC AAAAAAATCC ATTAAAAGAT TGTTGACATT CTCGGAAATT TAGTGCCAAC TGTTATTGCG AGAACTTACT ATAGTTTTCC HSP 18.2 pro X17295.1 280 290 300 310 320 330 340 350 360 | | | | | | | | | | | | | | | | | | TTTGGCGAAA AGCTAATAAT CTTAAATCTT GATTTTGTCC TCTTTTCTCT GAGTTAGATT TTCTTAAATT CCACTTCCGA CCTATTAAGA HSP 18.2 pro X17295.1 HSP 18.2 pro X17295.1 370 380 390 400 410 420 430 440 450 | | | | | | | | | | | | | | | | | | AATGGGCTTT TGCAAAGAAG ATCCGCTTCA CTGAGCCCGT ATCTCGAAGA GGATAATACA ACAACAAAGC AAAACGGCAC GTAGTTTTAA Hộp GAGA 460 470 480 490 500 510 520 530 540 | | | | | | | | | | | | | | | | | | TTGTAACCAA GGATTGCATT TCGGTCTTGT TTCAACAAAC GAAACTTCCT GAAATGCCAA GAAAAATCTG GTCATTTCAC CACAGTGATC AAC GAAACTTCCT G (HSE) CCT GAAATGCCAA G (HSE) CAA GAAAAATCTG G (HSE) 550 560 570 580 590 600 610 620 630 | | | | | | | | | | | | | | | | | | HSP 18.2 pro X17295.1 ATTGTGTATG TGTTCTAAAG ACTCCAAGCG AAGGTTTTAG AAAAAGGAGC ATTTTCTATT CTATTCAAGA AACTCGAAGA ACATTCTCTC CTAAAG ACTCCAAG (HSE) CAAGA AACTCGAAG (HSE) CAAGCG AAGGTTTT (HSE) X17295.1 640 650 660 670 680 690 700 710 720 | | | | | | | | | | | | | | | | | | TTCATCCTCT AACTTCCCTA TAAATATGTC CTTTGCTAAT CAGATCAAAT CAGCAGGAAA ATCAAGAACC AAAAGTCTCC CGAAAAGCAA Hộp TATA HSP 18.2 pro X17295.1 730 | | CGAACAGGAT CC HSP 18.2 pro HSE: heat shock elements So sánh trình tự nucleotide terminatorHSP 18.2 thu đƣợc với trình tự công bố 10 20 30 40 50 60 70 80 90 | | | | | | | | | | | | | | | | | | HSP 18.2 ter GAGCTCATAT GAAGATGAAG ATGAAATATT TGGTGTGTCA AATAAAAAGC TTGTGTGCTT AAGTTTGTGT TTTTTTCTTG GCTTGTTGTG HSP ter Nagaya 100 110 120 130 140 150 160 170 180 | | | | | | | | | | | | | | | | | | ↑ HSP 18.2 ter HSP ter Nagaya TTATGAATTT GTGGCTTTTT CTAATATTAA ATGAATGTAA GATCTCATTA TAATGAATAAACAAATGT TT CTATAATCCA TTGTGAATGT HSP 18.2 ter HSP ter Nagaya 190 200 210 220 230 240 250 260 | | | | | | | | | | | | | | | | TTTGTTGGAT CTCTTCTGCA GCATATAACT ACTGTATGTG CTATGGTATG GACTATGGAA TATGATTAAA GATAAGGAAT TC ↑poly A site Thành phần môi trƣờng nuôi cấy in vitro Loại môi trƣờng Thành phần MS lỏng MS (I-V) + Sucrose 30 mg/l; pH 5,8 MS đặc MS lỏng + 7,5 g Agar CCM STM RM MS (I - V) bổ sung BAP mg/l, NAA mg/l, sucrose 30 g/l 7,5g agar, pH 5,8 MS (I - V) bổ sung zeatin mg/l, sucrose 30 mg/l 7,5g agar, pH 5,8 MS (I - V) bổ sung IBA 0,3 mg/l, sucrose 15 g/l 7,5g agar, pH = 5,8 Thành phần môi trƣờng nuôi khuẩn Môi trƣờng Thành phần LB đặc g/l yeast extract + g/l NaCl + 10 g/l tryptone + 15 g/l bacto agar, pH = 7,0 LB lỏng g/l yeast extract + g/l NaCl + 10 g/l tryptone, pH = 7,0 Trình tự cặp mồi M13 F/R (5’→3’) M13_F: GTAAAACGACGGCCAG; M13_R: CAGGAAACAGCTATGAC Sơ đồ cấu trúc vector pBI121 Sơ đồ cấu trúc vector pBluescript II SK Phƣơng trình đƣờng chuẩn C(µg/µl) 9.1 Phương trình đường chuẩn protein (theo Braford, 1976, sử dụng BSA làm chất chuẩn) 2250 2000 1750 1500 1250 1000 750 500 250 y = 3503.6x - 18.094 R² = 0.9924 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5 0.55 0.6 OD595nm 9.2 Phương trình đường chuẩn protein scFv gắn đuôi c-myc C (ng/μl) Nồng độ chất chuẩn: 0; 1,25; 2,5; 5; 10; 20 ng/μl 22.5 20 17.5 15 12.5 10 7.5 2.5 y = 26.318x - 1.6454 R² = 0.9862 0.2 0.4 0.6 0.8 OD630nm Nồng độ chất chuẩn: 0; 10; 25; 50; 100; 150; 200 ng/μl 250 y = 281.98x - 36 R² = 0.903 C (ng/μl) 200 150 100 50 0 0.2 0.4 OD630nm 0.6 0.8 10 Thành phần đệm chiết DNA (theo Xin Chen, 2012) STT Nồng độ gốc Nồng độ sử dụng 1 M Tris-HCl (pH8,0) 50 mM M NaCl 300 mM 0,5 M EDTA (pH 8,0) 20 mM CTAB 4% Nƣớc khử ion, khử trùng 11 Cà chua chuyển gen: giai đoạn xanh chín đỏ [...]... vector biểu hiện miraculin trong dòng tế bào BY2, rễ tơ thuốc lá và cây cà chua 3) Biểu hiện protein tái tổ hợp miraculin trong dòng tế bào BY2 và rễ tơ thuốc lá 4) Biểu hiện protein tái tổ hợp miraculin trong cây cà chua 3 4 Ý nghĩa lý luận và ý nghĩa thực tiễn 4.1 Ý nghĩa lý luận Đề tài cung cấp cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tăng cƣờng mức độ biểu hiện của gen chuyển ở thực vật bằng cách thay đổi... chuyển vào dòng tế bào BY2, rễ tơ thuốc lá và cây cà chua nhằm thu đƣợc các dòng chuyển gen có khả năng biểu hiện miraculin tái tổ hợp 3 Nội dung nghiên cứu 1) Thay đổi mã di truyền của gen miraculin cho phù hợp với hệ thống biểu hiện ở cây họ cà Phân lập, nhân dòng promoter E8 từ cà chua, promoter HSP 18.2 và terminator HSP 18.2 từ Arabidopsis thaliana 2) Thiết kế vector biểu hiện miraculin trong dòng tế. .. của miraculin tái tổ hợp trong hệ thống biểu hiện vẫn chƣa đƣợc nhƣ kỳ vọng Xuất phát từ lý do trên, chúng tôi thực hiện đề tài: Nghiên cứu biểu hiện protein tái tổ hợp miraculin trong dòng tế bào BY2, rễ tơ thuốc lá và cây cà chua chuyển gen 2 Mục tiêu nghiên cứu Thay đổi mã di truyền gen miraculin của cây thần kỳ, thiết kế vector chuyển gen cùng với các promoter đặc hiệu và promoter cảm ứng để chuyển. .. terminator và hệ thống biểu hiện thực vật 4.2 Ý nghĩa thực tiễn 1) Sản xuất protein tái tổ hợp miraculin quy mô phòng thí nghiệm bằng dòng tế bào BY2 và rễ tơ chuyển gen 2) Sản xuất protein tái tổ miraculin ngoài tự nhiên bằng cây cà chua chuyển gen 5 Đóng góp mới của luận án 1) Protein tái tổ hợp miraculin đã đƣợc biểu hiện thành công trong dòng tế bào BY2 với hàm lƣợng từ 1,13-3,10 ng/µg protein tan tổng... attachment region) cũng giảm hiện tƣợng gen “câm” Ngoài ra, các dòng chuyển gen mang một bản copy của gen chuyển có mức độ biểu hiện cao có thể đƣợc lai giống tạo ra các cây chuyển gen có số bản copy và mức độ biểu hiện tăng lên nhƣng có thể giảm hiện tƣợng gen “câm” (Streatfield 2007) 1.3 NGHIÊN CỨU VỀ CHUYỂN GEN TRONG DÒNG TẾ BÀO BY2, RỄ TƠ VÀ CÂY CÀ CHUA 1.3.1 Dòng tế bào thuốc lá BY2 (Nicotiana tabacum... protein tan tổng số; biểu hiện trong hệ thống rễ tơ thuốc lá, hàm lƣợng tự 13,7-19,97 ng/µg protein tan tổng số 2) Miraculin tái tổ hợp đã đƣợc biểu hiện thành công trong cà chua, trong đó gồm 5 dòng mang bản đơn copy của gen chuyển, hàm lƣợng cao ở các dòng cà chua đƣợc chuyển cấu trúc biểu hiện đặc hiệu ở quả, đạt 118,0 ng/µg protein tan tổng số, cao gấp hơn 4 lần so với các dòng đƣợc chuyển cấu trúc... của BY2 thì việc sản xuất protein tái tổ hợp miraculin tạo vị ngọt trong các dòng tế bào thuốc lá BY2 sẽ là một trong những hƣớng nghiên cứu có triển vọng và dễ dàng kiểm tra mức độ biểu hiện miraculin tái tổ hợp trong tế bào thực vật trƣớc khi đƣợc nó chuyển vào cây chủ 1.3.2 Hệ thống nuôi cấy rễ tơ thực vật Rễ tơ (Hairy root) là một bệnh ở thực vật gây bởi Agrobacterium rhizogenes, một loại vi khuẩn... gian và có mức độ thu hồi thấp vì liên quan đến nhiều bƣớc tinh sạch (Sun et al., 2007) 14 1.2 TĂNG CƢỜNG SỰ BIỂU HIỆN CỦA PROTEIN TÁI TỔ HỢP TRONG THỰC VẬT 1.2.1 Lựa chọn hệ thống biểu hiện Trƣớc đây, cây thuốc lá đƣợc xem là cây mô hình phổ biến nhất để sản xuất các protein tái tổ hợp trong thực vật Hiện nay, có rất nhiều hệ thống thực vật đƣợc sử dụng để sản xuất protein tái tổ hợp nhƣ cây cà chua, ... tumefaciens cũng nhƣ quá trình thu nhận tế bào nuôi cấy huyền phù thực hiện dễ dàng (Nagata et al., 1992) Dòng tế bào BY2 có thể đƣợc sử dụng làm mô hình để nghiên cứu sự biểu hiện, quá trình bài tiết, sự hoàn thiện và ổn định của các protein tái tổ hợp mong muốn (Plasson et al., 2009) Cho đến nay, có một số nghiên cứu đã biểu hiện thành công protein tái tổ hợp trong dòng tế bào BY2 nhƣ kháng thể biscFv (Fischer... thay vào bằng các codon phổ biến của hệ thống biểu hiện là một trong những cách tăng cƣờng sự biểu hiện của gen chuyển trong thực vật (Kang et al., 2004c) Theo Kang et al (2006), bằng cách sử dụng gen ctxB đƣợc thay đổi mã di truyền các codon phổ biến cho phù hợp với cây thuốc lá và hàm lƣợng GC trong gen đƣợc tăng từ 33% lên 45% để biểu hiện ở cây thuốc lá, kết quả thu đƣợc là các dòng cây thuốc lá chuyển ... THỐNG RỄ TƠ THUỐC LÁ .66 3.3.1 Biểu protein miraculin tái tổ hợp dòng tế bào BY2 66 3.3.2 Biểu protein miraculin tái tổ hợp rễ tơ thuốc 71 3.4 BIỂU HIỆN PROTEIN MIRACULIN TÁI TỔ HỢP TRONG. .. LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LA VIỆT HỒNG NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP MIRACULIN TRONG DÒNG TẾ BÀO BY2, RỄ TƠ THUỐC LÁ VÀ CÂY CÀ CHUA CHUYỂN GEN Chuyên... Nghiên cứu biểu protein tái tổ hợp miraculin dòng tế bào BY2, rễ tơ thuốc cà chua chuyển gen Mục tiêu nghiên cứu Thay đổi mã di truyền gen miraculin thần kỳ, thiết kế vector chuyển gen với