Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của trypanosoma evansi và ứng dụng kháng nguyên tái tổ hợp để sản xuất kít chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở gia súc

Rất Rất Hay!

EDTA Ethylen Diamin Tetra Acetic

IFAT Indirect Fluorescent Antibody Test

IPTG Isopropyl β – D - thiogalactoside

PBS Phosphat Buffered Saline

PCR Polymerase Chain Reaction

RNA Ribonucleic acid

SDS Sodium Dodecyl Sulfat

SDS – PAGE Sodium Dodecyl Sulfat Poly AcrylamideTEA Tris – axit acetic – EDTA

T.evansi Trypanosoma evansi

VAT Variant Antigen Tupe

VSG Variant Surface Glucoprotein

v/p Vòng/phút

i

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Các hóa chất chính 35

Bảng 2.2 Các máy và thiết bị chính 36

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng RT-PCR 39

Bảng 2.4 Các chu kỳ nhiệt của phản ứng RT-PCR 39

Bảng 2.5 Công thức pha gel tách (12%) 46

Bảng 2.6 Công thức pha gel co (5%) 47

Bảng 3.1 Xác định hiệu giá huyết thanh và nồng độ kháng nguyên tối ưu cho phản ứng ELISA (S/N) 66

Bảng 3.2 Giá trị OD của phản ứng ELISA với các tác nhân block 67

Bảng 3.3 Kết quả phản ứng ELISA để xác định độ nhạy và đặc hiệu 70

Bảng 3.4 Kết quả xác định mức độ lặp lại kết quả phản ứng ELISA 70

Bảng 3.5 Kết quả xác định trâu/bò nhiễm bệnh tiên mao trùng bằng phương pháp ELISA và PCR 71

ii

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1 Kích thước các thang chuẩn 34

Hình 3.1 Trình tự gen và trình tự axit amin suy diễn của RoTAT 1.2 52

Hình 3.2 Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E coli BL21 53

Hình 3.3 Kết quả điện di protein tổng số của trên gel SDS-PAGE 54

Hình 3.4 Kết quả Western blot kiểm tra tính đặc hiệu của protein tái tổ hợp RoTAT 1.2 với kháng thể đặc hiệu của Trypanosoma evansi 55

Hình 3.5 Mức độ biểu hiện kháng nguyên RoTAT 1.2 theo thời gian cảm ứng 56

Hình 3.6 Mức độ biểu hiện kháng nguyên RoTAT 1.2 ở các nhiệt độ nuôi cấy 57

Hình 3.7 Mức độ biểu hiện kháng nguyên RoTAT 1.2 ở các giá trị OD khác nhau 58

Hình 3.8 Mức độ biểu hiện kháng nguyên RoTAT 1.2 ở các giá trị pH khác nhau 59

Hình 3.9 Mức độ biểu hiện kháng nguyên RoTAT 1.2 ở các nồng độ kháng sinh ampicillin bổ sung vào môi trường 61

Hình 3.10 Mức độ biểu hiện kháng nguyên RoTAT 1.2 ở các nồng độ IPTG cảm ứng 62

Hình 3.11 Protein thu được từ dịch nuôi cấy chủng E.coli BL21- pET32/RoTAT1.2 63

Hình 3.12 Điện di protein RoTAT 1.2 tinh sạch trên gel SDS-PAGE 64

Hình 3.13 Phản ứng western blot kiểm tra tính đặc hiệu của protein RoTAT 1.2 65

Hình 3.14 Ảnh hưởng của thời gian ủ huyết thanh đến kết quả phản ứng ELISA 68

Hình 3.15 Ảnh hưởng của thời gian ủ anti-bovine IgG:HRPO đến kết quả phản ứng ELISA 69

iii

ĐẶT VẤN ĐỀ

1 Tính cấp thiết của của đề tài

Bệnh tiên mao trùng hay còn gọi là bệnh ngã nước trâu bò do

Trypanosoma evansi (T.evasi) gây ra Theo số liệu của Phạm Sỹ Lăng (1982),

Phan Địch Lân và cs (2004)[9], Phan Văn Chinh (2006)[3], bệnh tiên maotrùng xuất hiện ở nhiều vùng trên cả nước, với tỷ lệ mắc khá cao: trên trâu là

13 – 30%, trên bò là 7 – 14%, trong đó tỷ lệ gia súc chết/gia súc mắc lên tới6,3 – 20% Hậu quả là bệnh gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi do ảnhhưởng đến sản lượng thịt và sức kéo

Trong các hệ thống chẩn đoán bệnh tiên mao trùng hiện nay ở nước tanhư: phương pháp chẩn đoán truyền thống, phương pháp chẩn đoán huyếtthanh học, phương pháp chẩn đoán sinh học phân tử thì phương pháp chẩnđoán huyết thanh học được đánh giá là có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, chokết quả nhanh và có khả năng chẩn đoán với số lượng mẫu lớn trong thờigian ngắn

Tuy nhiên hiện tại chúng ta vẫn phải sử dụng Kít nhập ngoại nên giáthành cao, chưa có khả năng cho phép sử dụng rộng rãi để chẩn đoán bệnhtiên mao trùng

Ở Việt Nam, vấn đề sản xuất Kít huyết thanh học chẩn đoán bệnh tiênmao trùng còn khá mới mẻ Hầu hết chỉ tập chung vào xác định hiệu quả chẩnđoán của một số phương pháp phát hiện tiên mao trùng và phương pháp huyếtthanh học

Để sản xuất Kít chẩn đoán cần phải có một lượng lớn kháng nguyênRoTAT 1.2, nguồn kháng nguyên này có thể được sản xuất bởi 2 phươngpháp: tự nhiên và tái tổ hợp

Kháng nguyên tự nhiên được tách từ ký sinh trùng sau khi tăng sinhtrên động vật thí nghiệm Ưu điểm của phương pháp này là có thể đồng thờitạo ra một lượng lớn kháng nguyên, tuy nhiên kháng nguyên này không tinhkhiết, thành phần đa dạng, vì vậy có khả năng gây phản ứng dương tính giảvới các kháng thể khác Trong khi kháng nguyên tái tổ hợp có thể khắc phụcđược những hạn chế đó.

Theo nghiên cứu của Urakawa và cs năm (2001)[32], kháng nguyên tái

tổ hợp RoTAT 1.2 được sản xuất dựa trên chức năng biểu hiện gen mã hóakháng nguyên vào tế bào côn trùng dòng Sf 9 Dòng tế bào tái tổ hợp có khảnăng tổng hợp và tiết kháng nguyên vào dịch nuôi cấy tế bào Khi ứng dụngkháng nguyên RoTAT 1.2 vào sản xuất Kít chẩn đoán, kháng nguyên tái tổhợp có độ nhạy tương tự như với kháng nguyên RoTAT 1.2 tự nhiên, nhưng

có độ đặc hiệu cao hơn tương ứng là 99% và 89,3% Kết quả này chỉ ra khảnăng kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 phát hiện được kháng thể đặc hiệu

của Trypanosoma evansi.

Như vậy, để chủ động nguồn kháng nguyên tinh khiết để sản xuất Kítchẩn đoán nhanh và chính xác từ đó có biện pháp điều trị kịp thời và hiệu quảbệnh tiên mao trùng cho gia súc ở Việt Nam thì vấn đề nghiên cứu chế tạo

kháng nguyên tái tổ hợp sản xuất kít phát hiện kí sinh trùng Trypanosoma evanci gây bệnh trên gia súc và đề xuất biện pháp phòng bệnh hiệu quả là vấn

đề cấp thiết

Với mục tiêu sản xuất được Kít chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở

trong nước chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu biểu hiện

gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của Trypanosoma evansi và ứng dụng kháng nguyên tái tổ hợp để sản xuất Kít chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở gia súc”.

2 Mục tiêu của đề tài

2.1 Mục tiêu chung

Sản xuất được Kít chẩn đoán bệnh tiên mao trùng tại Việt Nam có độnhạy và độ đặc hiệu cao.

2.2 Mục tiêu cụ thể

- Sản xuất được kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 của

Trypanosoma evansi

- Tạo được bộ Kit CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở Việt Nam

3 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài

3.1 Ý nghĩa khoa học

Kết quả của đề tài là những thông tin khoa học về biểu hiện các gen mã

hóa kháng nguyên bề mặt của Trypanosoma evanci và ứng dụng để sản xuất

Kít chẩn đoán bệnh tiên mao trùng

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả của đề tài chế tạo ra kháng nguyên tái tổ hợp để sản xuất Kítchẩn đoán bệnh tiên mao trùng cho gia súc tại Việt Nam, nhằm phục vụ choviệc chẩn đoán bệnh tiên mao trùng cho gia súc, góp phần nâng cao năng suấtchăn nuôi

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tiên mao trùng và bệnh tiên mao trùng ở gia súc

Bệnh tiên mao trùng được Blanchard (1888) phát hiện đầu tiên ở ViệtNam Sau đó, bệnh được xác định là phổ biến ở hầu hết các tỉnh thành trong

cả nước Bệnh do loài tiên mao trùng Trypanosoma evansi gây ra Trâu, bò,

ngựa mắc bệnh dễ chết hoặc thiếu máu, suy nhược, giảm hoặc mất khả năngsinh sản và sức sản xuất

1.1.1 Đặc điểm hình thái, cấu trúc và phân loại tiên mao trùng

1.1.1.1 Vị trí của tiên mao trùng Trypanosoma trong hệ thống phân loại động vật nguyên sinh

Theo Levine et al (1980) (dẫn theo Lương Văn Huấn và cs, 1997) [5], vị

trí của tiên mao trùng trong hệ thống phân loại nguyên bào (Protozoa) như sau:

Ngành Sarcomastigophora

Phân ngành Mastigophora

Lớp Zoomastigophorasida

Bộ Kinetoplastorida Phân bộ Trypanosomatorida

Họ Trypanosomatidae Donein, 1901 Giống Trypanosoma Gruby, 1843 Giống phụ Megatrypanum Hoare, 1964

Loài Trypanosoma (M) theileria Giống phụ Herpetosoma Donein, 1901

Loài Trypanosoma (H) leisi Giống phụ Schizotrypanum Chagas, 1909

Loài Trypanosoma (S) cruzi

Giống phụ Duttonella Chalmers, 1918

Loài Trypanosoma (D) vivax Loài Trvpanosoma (D) uniform Giống phụ Nalmomonas Hoare, 1964

Loài Trypanosoma (N) congolense Loài Trypanosoma (N) siminae Loài Trypanosoma (N) vanhogi Giống phụ Trypanozoon Liihe, 1906

Loài Trypanosoma (T) brucei Loài Trypanosoma (T) gambience Loài Trypanosoma (T) rhodesiense Loài Trypanosoma (T) equiperdum Giống phụ Pycnomonas Hoare, 1964

Loài Trypanosoma (P) suis Giống phụ Trypanosoma Gruby, 1843 Loài Trypanosoma evansi (Steel, 1885)

Trong các loài tiên mao trùng trên, có 7 loài được tổ chức dịch tễ quốc tế(OIE) thông báo là có khả năng gây bệnh cho người và động vật có vú, đó là:

T brucei, T congolense, T cruzi, T evansi, T gambiense, T siminae, T vivax 1.1.1.2 Đặc điểm hình thái, cấu tạo của tiên mao trùng

Tiên mao trùng T evansi được xếp vào loại đơn hình thái, cơ thể chỉ là

một tế bào, có kích thước nhỏ, chiều dài 18 - 34 μm (trung bình là 25 μm),chiều rộng 1,5 - 2μm Cơ thể có hình suốt chỉ mảnh hoặc hình thoi, cuối thân

nhọn Nhìn chung, cấu trúc cơ bản của T evansi cũng giống như cấu trúc của các loài tiên mao trùng khác thuộc họ Trypanosomatidae Cấu trúc từ ngoài

vào trong được chia thành 3 phần chính:

- Vỏ: ngoài cùng là lớp vỏ dày 10 - 15 nm, vỏ được chia làm 3 lớp (lớpngoài và lớp trong cùng tiếp giáp với nguyên sinh chất dầy hơn lớp giữa) Lớp

vỏ ngoài cùng được cấu tạo từ các phân tử glycoprotein luôn biến đổi (VanantGlycoprotein Surface -VGS) Tiếp giáp với lớp trong cùng là 9 cặp vi ống xếpsong song dọc theo chiều dài thân tiên mao trùng Chính nhờ sự sắp xếp củacác cặp vi ống nên tiên mao trùng có dạng hình suốt chỉ mảnh (Hoare, 1972[27]; Phạm Sỹ Lăng, 1982 [7]; Nguyễn Quốc Doanh, 1999 [4])

- Nguyên sinh chất: gồm lớp trong và lớp ngoài Trong nguyên sinhchất có chứa các nội quan: ribosome có màu thẫm xen kẽ vùng không bàomàu sáng, kinetoplast (thể cơ động), mitochrondno, reticulum (lưới nộibào) và mạng lưới golgi

- Nhân: nhân tiên mao trùng có chứa DNA, hình bầu dục hoặc hìnhtrứng Nhân thường nằm ở vị trí trung tâm hoặc gần vị trí trung tâm cơ thể.Ngoài nhân, về phía cuối thân còn có thể kinetoplast chứa DNA (KADN) Từkinetoplast có một roi chạy vòng quanh thân lên đầu và ra phía ngoài cơ thểthành một roi tự do Roi của tiên mao trùng có lớp vỏ ngoài cùng giống lớp vỏcủa thân Trong roi có 9 cặp vi ống ở xung quanh và một cặp ở trung tâm, xếpsong song dọc chiều dài roi (Hoare, 1972 [27]; Nguyễn Quốc Doanh, 1999 [4])

1.1.1.3 Cấu trúc kháng nguyên của tiên mao trùng Trypanosoma evansi

Kháng nguyên của T evansi gồm hai loại: kháng nguyên ổn định

(kháng nguyên không biến đổi) và kháng nguyên biến đổi

* Kháng nguyên ổn định (kháng nguyên không biến đổi)

Phần lớn các thành phần kháng nguyên tiên mao trùng không biến đổitrong quá trình sống ký sinh Bằng phương pháp điện di miễn dịch huyết

thanh thỏ tối miễn dịch với T evansi, Kageruka (1982) đã phát hiện tới 30

thành phần kháng nguyên khác nhau Có ba loại kháng nguyên không biếnđổi ở màng nguyên sinh chất tế bào (ISG: Invanant Surface Glycoprotein):ISG 65, ISG 75 và ISG 100 Do cấu trúc không gian ba chiều và đặc tính ưanước, các loại này không kết hợp với kháng thể của vật chủ (Nolan, 1997)

* Kháng nguyên biến đổi

Về kháng nguyên biến đổi, cần đề cập đến sự biến đổi lớp vỏ bề mặt VSG(Variant Surface Glycoprotein), những quan điểm mới về sự xuất hiện khángnguyên biến đổi của tiên mao trùng và cơ chế di truyền của kháng nguyên biến đổi

Nhờ kháng thể đặc hiệu được đánh dấu mà Vickerman và Luckins(1969) đã phát hiện ra sự biến đổi của lớp kháng nguyên bề mặt Cross (1975)

đã mô tả lớp áo bề mặt của tiên mao trùng có thành phần là glycoprotein baophủ toàn bộ bề mặt tế bào bằngmột lớp phân tử giống nhau (mỗi tiên maotrùng có 107 phân tử) Lớp áo bề mặt này kích thích cơ thể vật chủ tạo rakháng thể đặc hiệu với từng type kháng nguyên biến đổi VAT (VariableAntigen Type) Chỉ có kháng nguyên biến đổi mới có khả năng kích thích vậtchủ tạo miền dịch chủ động Người ta ước lượng rằng, một con tiên mao trùng

có ít nhất vài trăm hoặc vài nghìn VSG, nghĩa là 5 - 10% số gen của tiên maotrùng cung cấp cho kháng nguyên bề mặt này

Nhiều tác giả nghiên cứu về miễn dịch học cho rằng, tiên mao trùngbiến đổi kháng nguyên bề mặt để né tránh miễn dịch đặc hiệu của vật chủ.Tuy nhiên, Van Meirvenne (1975) cho biết, sự biến đổi kháng nguyên bề mặtcủa ký sinh trùng đã có ngay ở pha đầu tiên của quá trình nhiễm (trước khixuất hiện đáp ứng miễn dịch của cơ thể vật chủ) Theo Hajduc và Vickernlan(1981), hiện tượng biến đổi kháng nguyên bề mặt của tiên mao trùng còn thấy

ở gia súc đã bị tiêm thuốc làm suy giảm miễn dịch Những quan điểm này làhoàn toàn mới để lý luận về sự xuất hiện kháng nguyên biến đổi của tiên maotrùng Như vậy, quan điểm về sự biến đổi kháng nguyên lớp vỏ của tiên maotrùng cho đến nay vẫn chưa thống nhất

* Cơ chế di truyền của kháng nguyên biến đổi

Khi kháng thể đặc hiệu kết hợp với phân tử của kháng nguyên bề mặt(VSG), làm tiêu tan tiên mao trùng thì đó cũng là nguyên nhân chính thúc đẩy

sự hoạt hoá của gen Kết quả là các phân tử kháng nguyên VSG được thay đổihoàn toàn bằng các phân tử VSG mới Lúc này, kháng thể đặc hiệu lúc trước

đã không còn tác dụng đối với kháng nguyên mới này

Theo Barry và Tumer (1991) [22], các VSG được mã hoá nhờ các genchuyên biệt Từ kho chứa hàng nghìn đến khác nhau, một gen VSG được hoạthoá một cách chọn lọc, dẫn đến tổng hợp ra một loại kháng nguyên VSG Mỗibên VSG mới tạo ra một loại kháng nguyên VSG mới Trong bộ gen của tiênmao trùng tồn tại một số lớn gen VSG, các gen này sử dụng nhiều cơ chế sắpxếp khác nhau, do vậy tiên mao trùng đã tạo ra nhiều VSG khác nhau ở giasúc bị bệnh mãn tính Cơ chế biến đổi kháng nguyên theo 2 cách: cách thứnhất là, sử dụng lần lượt các điểm biểu hiện trên (expression si de) khác nhau,không có sự sắp xếp của DNA Các điểm biểu hiện khác nhau sẽ mang cácgen VSG khác nhau, sự luân phiên này dẫn đến sự thay đổi type khángnguyên Cơ chế này quan sát được chủ yếu ở giai đoạn đầu của quá trình cảmnhiễm Có lẽ ở giai đoạn đầu này chưa có đáp ứng miễn dịch của vật chủ đốivới VSG, chính điều này không gây ra một cản trở hoạt hoá tự nhiên của cácđiểm biểu hiện gen này Cách thứ hai là, tập hợp lại các đoạn DNA khác nhau

để tái tổ hợp gen, mà việc tái tổ hợp này cho phép thay thế hoàn toàn hoặctừng phần gen; hoặc việc thay thế diễn ra dựa vào sự chuyển đổi gen chứkhông phải dựa vào tái tổ hợp gen Trường hợp này được diễn giải như sau:một gen hoạt hoá được thay thế bằng bản sao chép của một gen khác Do có

sự thay thế một phần của gen nên đã tạo ra loại gen phức hợp và đặc trưng

1.1.2 Dịch tễ học bệnh tiên mao trùng

1.1.2.1 Phân bố của bệnh

Bệnh tiên mao trùng phân bố rất rộng, từ phía Tây sang phía Đông báncầu Phía Tây bán cầu thuộc châu Mỹ, phía Đông bán cầu trải dài từ châu Phicho đến Philippine

Theo Euzeby (1984), bệnh phổ biến ở trâu, bò, ngựa các nước nhiệt đới

ở châu Phi,châu Á và Nam Mỹ

Ở châu Phi, bệnh trải dài từ Tây sang Đông, phía Bắc qua vùng sa mạcSahara, dọc theo bờ biển Atlantique Địa trung hải

Bệnh tiên mao trùng xảy ra với tên gọi "bệnh Surra” ở Ả rập Saudi,

Yêmen, Sultanate, Ả Rập thống nhất, Thổ Nhĩ Kỳ, Israel, Syrie, Afganistan,Pakistan

Ở châu Á, bệnh xuất hiện ở Trung Á (thuộc Liên Xô cũ), Ấn Độ,Malaysia, bán đảo Đông Dương, Trung Quốc, Indonexia, Philippine

Ở châu Âu, bệnh xuất hiện ở Bungaria (nay đã được thanh toán), hiệnchỉ còn ở vùng Volga và Nam Capcase (Liên Xô cũ)

Ở châu Mỹ, bệnh xuất hiện ở Trung Mỹ, Nam Mỹ, đặc biệt phổ biến ởBrazil, Mexico, Venezuela, Colombia

Châu Úc cũng đã được xác định là có bệnh tiên mao trùng (Reid, 2002)cho rằng, bệnh tiên mao trùng phổ biến nhất ở châu Á và châu Phi, từ Ấn Độđến Srilanca, Trung Quốc, Indonexia, Thái Lan, Lào, Camphuchia, Iran,Philippine

Ở Việt Nam, bệnh tiên mao trùng thấy ở hầu hết các vùng sinh tháikhác nhau: miền núi, trung du, đồng bằng, ven biển Theo Phạm Sỹ Lăng(1982) [7], bệnh tiên mao trùng có ở tất cả các tỉnh miền Bắc (Bắc Kạn, LạngSơn, Tuyên Quang, Thái Nguyên, Ninh Bình, Hà Tây) Trâu, bò nhiễm bệnhvới tỷ lệ cao và thay đổi giữa các vùng khác nhau (trâu, bò ở đồng bằngnhiễm tiên mao trùng cao hơn vùng trung du và miền núi, đặc biệt ở trâu, bò

có nguồn gốc từ miền núi chuyển xuống vùng đồng bằng)

Lê Ngọc Mỹ và cs (1994) [11] đã điều tra tình hình nhiễm tiên maotrùng ở trâu bò Việt Nam Kết quả cho thấy, trâu bò nhiễm tiên mao trùng với

tỷ lệ cao (21,27%), trong đó trâu bò nuôi ở các tỉnh miền núi phía Bắc nhiễm

T evansi cao hơn ở đồng bằng

Theo Lê Đức Quyết và cs (1995) [16], Phạm Chiến và cs (1999) [2],trâu ở một số tỉnh miền Nam và Tây Nguyên nhiễm tiên mao trùng là 22,12%;

bò là 6,6 - 10,3%

1.1.2.2 Vật chủ và vật môi giới truyền bệnh tiên mao trùng

Trong tự nhiên, tiên mao trùng ký sinh ở hầu hết các loài thú nuôi vàthú hoang, thấy nhiều hơn ở trâu, bò, ngựa, trâu bò rừng, hươu, nai, hổ, báo,

sư tử, chó, mèo, lạc đà, voi thỏ, chuột cống, chuột lang, chuột bạch , nhưngkhông ký sinh ở người

Chen Qijun (1992) cho biết: T evansi gây bệnh cho hầu hết các loài

động vật như trâu, bò, ngựa, la, chó… ở Trung Quốc

Theo Sukanto I P (1992): tỷ lệ lưu hành bệnh tiên mao trùng ở trâuIndonesia cao hơn ở bò và tỷ lệ lưu hành bệnh ở bò lại cao hơn ở ngựa

Sự lây truyền tiên mao trùng từ trâu, bò ốm sang trâu, bò khoẻ là nhờ

các loài ruồi hút máu (thuộc họ phụ Stomoxydinae) và các loài mòng hút máu (thuộc họ Tabanidae) Ruồi và mòng hút máu của gia súc bị bệnh, hút luôn cả

tiên mao trùng vào vòi hút, sau đó lại hút máu gia súc khoẻ, trong khi hút máu

sẽ truyền tiên mao trùng từ vòi hút vào máu con vật khoẻ Sự lây truyền nàymang tính chất cơ học Như vậy, ruồi và mòng hút máu là những vật môi giớitruyền bệnh tiên mao trùng quan trọng

Theo Phan Địch Lân (1974) [8], Phan Địch Lân (1994 - 2004) [9], phầnlớn các loài mòng tập trung ở khu vực miền núi và trung du Trong 53 loàimòng thì có tới 44 loài phân bố ở vùng rừng núi có độ cao dưới 1 000 mét sovới mặt nước biển, càng lên cao số loài càng ít dần (độ cao trên 1 000 mét chỉ

có 26 loài) Ở vùng trung du (rừng thưa, độ cao không quá 500 mét so với mặtnước biển có 27 loài; vùng đồi trọc chỉ có 9 - 11 loài; vùng rừng núi ven biểnphát hiện chỉ có 8 loài Những loài mòng phổ biến ở tất cả các vùng là:

Tabanus rubidus, T striatus, Chrysops dispar, Chrysozoma assamensis.

Phan Địch Lân (1994 - 2004) [9] cho biết, kiểm tra ở nhiều địa điểm

thấy hai loài mòng T rubidus và T striatus mang tiên mao trùng với tỷ lệ 15,2% và 14,0%; ruồi hút máu Stomoxys calcitrans mang tiên mao trùng với tỷ

lệ 12,5% Ở những vùng đang có bệnh tiên mao trùng, kiểm tra ruồi và mònghút máu dễ dàng tìm thấy tiên mao trùng Sau khi theo máu vào vòi hút ruồi vàmòng, tiên mao trùng vẫn sống đến giờ thứ 53, thời gian hoạt động mạnh nhất

là từ giờ thứ nhất đến giờ thứ 34 trung bình là 24giờ Sự hoạt động của tiênmao trùng yếu dần từ giờ thứ 35 đến 42 Từ 46 - 53 giờ thì tiên mao trùngngừng hoạt động

Hình thái tiên mao trùng khi ở trong vòi ruồi, mòng biến đổi theo thời gian:

từ 1 - 34 giờ có hình thái, kích thước bình thường; 35 - 45 giờ: tiên mao trùng cóhình dạng thay đổi, tăng kích thước chiều rộng và thô dần; 46 - 53 giờ: tiên maotrùng trương to, duỗi thẳng, mất khả năng di động và ngừng hẳn hoạt động

Thực nghiệm đã chứng minh khả năng gây bệnh của tiên mao trùng sau

khi xâm nhập vào mòng Tabanus rubidus như sau: Thời gian từ giờ thứ 1 đến

thứ 5, tiên mao trùng có khả năng gây bệnh và làm chết chuột bạch tương tựnhư khi truyền thẳng máu có tiên mao trùng cho chuột; từ giờ thứ 6 đến thứ 7chỉ còn 30% số chuột thí nghiệm phát bệnh, thời gian gây bệnh kéo dài vàthời gian chết của chuột cũng dài Điều này có thể giải thích là do độc lực củatiên mao trùng giảm dần và số lượng tiên mao trùng còn hoạt lực gây bệnh

cũng giảm dần sau khi chúng xâm nhập vào mòng Tabanus rubidus.

1.1.2.3 Tuổi vật chủ, mùa mắc bệnh

Trâu, bò và các loài gia súc khác ở mọi lứa tuổi đều nhiễm tiên maotrùng và đều phát bệnh, có thể dẫn đến tử vong hoặc suy nhược, thiếu máu,giảm sức đề kháng, giảm khả năng sinh đẻ và sức sản xuất

Phan Địch Lân (1994 - 2004) [9] đã tổng hợp kết quả điều tra 3.172trâu ở các tỉnh đồng bằng: trâu dưới 3 năm tuổi nhiễm thấp nhất (3,2 - 6,l

%), trâu 3 - 5 tuổi nhiễm cao hơn (lo 6 - 12,7%), trâu 6 - 8 tuổi nhiễm caonhất (12,9 - 14,8%), trâu trên 9 năm tuổi tỷ lệ nhiễm giảm thấp hơn trâu 3

- 8 năm tuổi

Theo Phan Văn Chinh (2006) [3], tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng cao nhất ở

4 - 8 năm tuổi (trâu: 12,71%; bò: 5,77%), thấp nhất là trâu, bò dưới 3 nămtuổi (6,92% và2,31%) Mùa lây lan bệnh thường xảy ra trong các tháng nóng

ẩm, mưa nhiều (từ tháng 4 đến tháng 9) Thời gian này điều kiện sinh tháithuận lợi cho các loài ruồi, mòng phát triển, hoạt động mạnh Hút máu súc vật

và truyền tiên mao trùng

Theo Luckins (1988), sự xuất hiện lượng lớn ruồi, mòng trong mùamưa nóng ẩm luôn có liên quan đến tình hình dịch tễ bệnh tiên mao trùng ởtrâu, bò, dê, lạc đà Từ cuối mùa thu, mùa đông và đầu mùa xuân, trâu bònhiễm tiên mao trùng phải sống trong điều kiện thời tiết lạnh, thiếu thức ănnên sức đề kháng giảm, bệnh thường phát ra vào thời gian này và trâu bò bị

đổ ngã hàng loạt Tiên mao trùng có sức đề kháng yếu, dễ chết khi tiếp xúcvới nước cất, cồn và thuốc sát trùng

Theo Tamasan Kas R (1992): bò ở Guaico nhiễm T evansi từ 11 –

74%, bò dưới 12 tháng nhiễm 21,04%; bò trên 25 tháng nhiễm 72,92%; bòZebu cao sản nhiễm 74,4%

Cũng năm 1992, Tperone M C và cs kiểm tra bò ở Venezuela thấy: bò

dưới 3 tháng nhiễm T evansi 13% và bò trên 36 tháng nhiễm 50%.

1.1.3 Đặc điểm bệnh lý và lâm sàng của bệnh

1.1.3.1 Đặc điểm bệnh lý

Khi ruồi trâu, mòng đốt, hút máu và truyền tiên mao trùng vào trâu, bò,ngựa, tiên mao trùng xâm nhập vào da, gây ra vết viêm trên mặt da Theo cóthể quan sát được phản ứng viêm ở da của thỏ, cừu, dê và bò gây nhiễm thựcnghiệm tiên mao trùng, kích thước chỗ viêm phụ thuộc vào số lượng tiên mao

trùng được tiêm truyền (ước chừng khoảng 108 tiên mao trùng có thể gâyviêm da - ở vị trí tiêm truyền), một số lượng lớn tiên mao trùng phát triển ởtại chỗ viêm này

Vào máu, tiên mao trùng nhân lên theo cấp số nhân ở trong máu, trongbạch huyết và ở trong các mô khác của cơ thể vật chủ theo cách phân chiatheo chiều dọc Số lượng tiên mao trùng trong máu không phải lúc nào cũngnhư nhau Mật độ tiên mao trùng thay đổi theo ngày Biểu đồ sóng tiên maotrùng cho thấy, xen kẽ giữa những sóng tiên mao trùng mạnh là những đợtsóng yếu Mỗi đợt sóng tiên mao trùng bắt đầu bằng sự tăng số lượng tiênmao trùng trong máu, sau đó giảm và khó phát hiện thấy tiên mao trùng Mỗiđợt tiên mao trùng tăng lên trong máu là biểu hiện sự xuất hiện một quần thểtiên mao trùng có tính kháng nguyên bề mặt mới, quần thể này có thể tiếp tụcsinh sản và tồn tại một thời gian cho đến khi cơ thể xuất hiện kháng thể đặchiệu với chúng

Tiên mao trùng phát triển nhanh trong máu, tiêu thụ Glucose và cácchất đạm, chất béo và khoáng chất trong máu ký chủ bằng phương thức thẩmthấu qua bề mặt cơ thể để duy trì hoạt động và sinh sản Ở súc vật bị bệnh,trong 1 ml máu có thể có 10.000 - 30.000 tiên mao trùng Với số lượng nhiềunhư vậy, tiên mao trùng chiếm đoạt dinh dưỡng nhiều, làm cho súc vật bệnhgây còm, thiếu máu và mất dần khả năng sản xuất sữa, thịt, mất dần khả năngsinh sản và giảm sức đề kháng với các bệnh khác

Sống trong máu vật chủ, tiên mao trùng còn tạo ra độc tố Trypanotoxin,

độc tố này gồm: độc tố do tiên mao trùng tiết ra qua màng thân trong quátrình sống và độc tố do xác chết của tiên mao trùng phân huỷ trong máu sau

15 - 30 ngày Độc tố của tiên mao trùng tác động lên hệ thần kinh trung ươnglàm rối loạn trung khu điều hoà thân nhiệt, gây sốt cao và gián đoạn (lúc sốt,lúc hết sốt xen kẽ nhau) Khi sốt thường có rối loạn về thần kinh (kêu rống,

run rẩy, ngã vật xuống) Độc tố cũng phá huỷ hồng cầu, ức chế cơ quan tạomáu làm cho vật chủ thiếu máu và suy nhược dần Độc tố còn tác động tới bộmáy tiêu hoá, gây rối loạn tiêu hoá, làm con vật ỉa chảy Hội chứng tiêu chảythường xảy ra khi xuất hiện tiên mao trùng trong máu con vật bệnh.

Khi tăng lên với số lượng lớn trong máu, tiên mao trùng còn làm tắccác mao mạch, làm tăng tính thấm thành mạch, dần dần tạo ra các ổ thuỷthũng chất keo vàng dưới da

1.1.3.2 Triệu chứng lâm sàng của bệnh tiên mao trùng ở trâu, bò, ngựa

* Ở trâu, bò:

Trâu, bò bị bệnh thể hiện các triệu chứng lâm sàng chủ yếu như sau:

- Sốt cao và gián đoạn: sau 14 - 30 ngày bị ruồi, mòng hút máu truyềntiên mao trùng, trâu bò thường đột ngột lên cơn sốt (40 - 41,70C) kéo dài 2 - 4ngày rồi giảm, thời gian sau nhiệt độ lại tăng lên Thời gian gián đoạn giữahai cơn sốt dài hay ngắn tuỳ theo thể trọng con vật Khi sốt, kiểm tra máuthường thấy tiên mao trùng

- Hội chứng thần kinh: ở một số trâu, bò khi lên cơn sốt còn thể hiệnhội chứng thần kinh như điên loạn, mắt đỏ ngầu, húc đầu vào tường, chạyvòng quanh kêu rống lên Trường hợp nhẹ thấy run rẩy từng cơn, mắt trợnngược rồi đổ ngã vật xuống, sùi bọt mép giống như trâu bị cảm nắng Sau 20 -

30 phút con vật lại đứng dậy đi lại được Những trâu bò mắc bệnh có triệuchứng lâm sàng như trên thường là mắc bệnh ở thể cấp tính

Trâu, bò bị bệnh mạn tính thường kéo dài, cơ thể suy yếu, liệt hai chânsau, nằm tư thế quỳ và không đi lại được Mặc dù nằm liệt nhưng vẫn ăn vànhai lại cho đến khi sắp chết

- Phù thũng dưới da: phù thũng thường thấy ở vùng thấp của cơ thể như

ở bốn chân (từ khớp khuỷu trở xuống), phần yếm, ngực, bộ phận sinh dục

- Viêm giác mạc và kết mạc mắt: triệu chứng này thấy ở hầu hết trâu,

bò bệnh Mắt có dử trắng hay vàng, chảy liên tục, nếu nặng thì mắt sưng đỏngầu Khi khỏi bệnh, mắt có màng trắng (củi nhãn) kéo che kín giác mạc

- Hội chứng tiêu hoá: một số trâu, bò bệnh bị ỉa chảy nặng, phân lỏng,màu vàng, sau chuyển màu xám, có lẫn bọt và chất nhầy Các đợt ỉa chảy tiếptheo những cơn sốt cách quãng Ỉa chảy trong bệnh tiên mao trùng thường daidẳng và con vật vẫn ăn được

- Gầy yếu, suy nhược: ở thể bệnh cấp tính trâu, bò gầy sút nhanh, chỉsau 7 – 14 ngày từ khi phát bệnh con vật đã gầy rộc, mắt trũng sâu Nếu bệnhkéo dài thì con vật gầy xơ xác, lông dựng ngược, da khô nhăn nheo, niêm mạcmắt nhợt nhạt, lông dễ rụng, dần dần suy nhược cơ thể nặng, mất khả năngcày kéo và sinh sản Nếu gặp điều kiện bất lợi như thiếu ăn, rét mướt thì trâu,

bò dễ chết Trong thực tế, có khoảng 3% trâu bệnh ở thể ẩn vẫn béo khoẻ, làmviệc bình thường khi được chăm sóc nuôi dưỡng tốt

Tình trạng thiếu máu thể hiện rõ trong bệnh do T evansi gây ra Theo

Silva Rams và cs (1995), Smith R D (1995), số lượng hồng cầu và hàmlượng huyết sắc tố giảm, số lượng bạch cầu tăng, thành phần bạch cầu thayđổi: bạch cầu lymphô, bạch cầu ái toan tăng nhưng bạch cầu trung tính giảm,protein tổng số và Albumin giảm rõ rệt

* Ở ngựa

Sau khi ruồi, mòng hút máu và truyền T evansi, ngựa phát bệnh sau 1

-2 tuần Triệu chứng rõ nhất là ngựa sốt 40 - 410C, sốt gián đoạn, khi sốt cótiên mao trùng ở máu ngoại vi Khi bị bệnh nặng, ngựa thường sốt cao độtngột, các triệu chứng khác chưa kịp thể hiện thì con vật đã lăn lộn điên cuồngrồi chết Thể bệnh cấp tính diễn ra khoảng 1 - 3 tuần, thể mãn tính kéo dài 2 -

4 tháng (tuy nhiên, thể mãn tính thường ít gặp)

Hiện tượng thuỷ thũng xuất hiện ở vùng thấp của cơ thể (ngực, bụng,

âm hộ, vú) sau 1 - 2 tuần kể từ khi phát bệnh Ngựa đi đứng xiêu vẹo, gầy sútrất nhanh, ăn kém, da khô, lông dựng, bốn chân run rẩy, hay nằm, dần dần liệtchân, nằm một chỗ rồi chết

1.1.3.3 Bệnh tích của bệnh tiên mao trùng

Trâu, bò bị bệnh tiên mao trùng khi chết gầy xơ xác, mổ khám thấy cónhững biến đổi bệnh tích đại thể rõ rệt ở hệ tuần hoàn và hô hấp: tim nhão,xoang bao tim tích nước vàng; phổi xung huyết và tụ máu từng đám nhỏ; gansưng to, nhạt màu; lách sưng, mềm nhũn và nhạt màu; hạch lâm ba sưng và có

tụ máu trong hạch; cơ nhão, màu nhợt nhạt, nhát cắt rỉ nước; xoang ngực vàxoang bụng tích dịch màu vàng nhạt; có những đám keo nhầy vàng dưới vùng

1.1.4.2 Chẩn đoán thí nghiệm

Có nhiều phương pháp chẩn đoán tiên mao trùng trong phòng thínghiệm, mục đích là phát hiện tiên mao trùng trong máu gia súc Tùy từng

trường hợp bệnh, tuỳ điều kiện mà có thể làm cùng lúc một số phương pháphoặc lựa chọn một phương pháp phù hợp và có độ chính xác cao.

* Phương pháp phát hiện tiên mao trùng trực tiếp:

Muốn phát hiện tiên mao trùng trực tiếp, có thể áp dụng những phươngpháp sau:

- Phương pháp xem tươi (Direct smear)

Khi bệnh súc sốt, T evansi thường xuất hiện trong mao quản ngoại vi;

vì vậy, nên lấy máu vùng ngoại vi để xem tươi Cho 1 giọt máu nhỏ lên phiếnkính đã có sẵn 1 giọt EDTA 1%; dùng góc của la men khuấy đều, đậy la menlên để máu dàn theo la men thành một lớp mỏng Soi dưới kính hiển vi (độphóng đại 10 x 10 và 10 x 20) để phát hiện tiên mao trùng sống

- Phương pháp nhuộm Giemsa tiêu bản máu khô (Romanovsky)

+ Phương pháp giọt dầy: Đặt 1 giọt máu to vào giữa phiến kính, dùngmột góc của đầu một phiến kính khác ria tròn giọt máu với đường kínhkhoảng 1 - 1,25 cm Để khô tự nhiên trong khoảng 1 giờ, rồi cố định bằng cồn

Methanol, nhuộm Giemsa [1 giọt Giemsa + 1 ml dung dịch PBS (Phosphat

Buffered Saline) pH = 7,2] trong 25 phút Rửa tiêu bản dưới vòi nước chảymạnh, để khô rồi soi dưới kính hiển vi (độ phóng đại 10 x 100 hoặc 10 x 90)

Phương pháp này có nhược điểm là dễ làm tổn thương tiên mao trùng,

do đó khó phân biệt được các loài khác nhau trong trường hợp nhiễm nhiềuloài tiên mao trùng cùng một lúc

+ Phương pháp giọt mỏng: Đặt 1 giọt máu cách 1 đầu phiến kính 2 cm,dùng la men ria máu thành một lớp mỏng Để khô, cố định bằng cồn

Methanol trong 2 phút Nhuộm Giemsa trong 25 phút (l giọt Giemsa + 1 ml

dung dịch PBS pH = 7,2) Rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy mạnh, để khô, soidưới kính hiển vi (độ phóng đại 10 x 100 hoặc 10 x 90)

Ưu điểm của phương pháp giọt mỏng là có thể phân biệt được hình tháicác loài tiên mao trùng khác nhau

+ Phương pháp làm tan hồng cầu: dung dịch SDS (Sodium DodecylSulfat) là chất làm tan hồng cầu Nhờ dung dịch SDS, tiên mao trùng dễ dàngđược phát hiện trong máu Dung dịch SDS rất độc nên tránh tiếp xúc với da

và tránh hút bằng pipet Dung dịch SDS dễ bảo quản ở nhiệt độ thường trongnhiều tháng (Van Meirvenne, 1989)

* Phương pháp tập trung tiên mao trùng:

Người ta đã sử dụng phương pháp ly tâm tập trung tiên mao trùng bằngống Haematocrit hoặc tách tiên mao trùng bằng gen DEAE - cellulose

- Phương pháp ly tâm tập trung bằng ống Haematocrit (WOO, 1971):cho máu động vật nghi mắc bệnh vào ống Haematocrit, một đầu ống được bịtkín bằng chất dẻo matit, một đầu ống để hở Ly âm với tốc độ 14.000vòng/phút trong 5 phút Sau đó kiểm tra sự tập trung của tiên mao trùng tại vịtrí tiếp giáp giữa huyết tương và hồng cầu (độ phóng đại 10 x 10)

Phương pháp này đơn giản, phát hiện tiên mao trùng tốt hơn phươngpháp xem tươi và nhuộm Giemsa Song, tỷ lệ phát hiện chưa cao

Với ống Haematocrit trên, có thể thực hiện phương pháp Darkground:dùng cưa y tế cắt ống ở vị trí tiên mao trùng tập trung (ranh giới giữa huyếttương và hồng cầu), nhỏ 1 giọt huyết tương lên phiến kính, đậy la men vàkiểm tra dưới kính hiển vi (độ phóng đại 10 x 40)

* Phương pháp tiêm truyền động vật thí nghiệm:

Đây là phương pháp phổ biến, hiệu quả, chính xác và thường được ứngdụng nhiều để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở Việt Nam Phương pháp này

có ưu điểm là chính xác, do trực tiếp phát hiện thấy tiên mao trùng sau khinhân chúng lên trong động vật thí nghiệm mẫn cảm Song, nhược điểm củaphương pháp tiêm truyền động vật thí nghiệm là khi cần chẩn đoán nhanh, với

số lượng nhiều và thời gian ngắn thì phương pháp này không thể đáp ứngđược (Lê Ngọc Mỹ, 1994 [11]; Đoàn Văn Phúc và cs, 1994 [13])

* Phương pháp chẩn đoán huyết thanh học:

Bằng phương pháp huyết thanh học, có thể phát hiện kháng thể hoặckháng nguyên tiên mao trùng Đây là các phương pháp huyết thanh học đặc hiệu

- Các phương pháp phát hiện kháng thể kháng tiên mao trùng

Khi tiên mao trùng ký sinh, cơ thể vật chủ sinh ra kháng thể đặc hiệuchống lại tiên mao trùng Những phương pháp sau cho phép phát hiện khángthể kháng tiên mao trùng trong máu vật chủ:

+ Phương pháp ngưng kết trên phiến kính (SAT: Slice AgglutinationTest): hoà tan 1 giọt huyết thanh gia súc nghi mắc bệnh vào 1 giọt nước muốisinh lý trên phiến kính, sau đó cho 1 giọt máu chuột bạch có nhiều tiên maotrùng vào, trộn đều, đậy la men và soi dưới kính hiển vi (độ phóng đại 10 x 20hoặc 10 x 40) Nếu thấy ngưng kết hình hoa cúc là (+) và ngược lại là (-).Phương pháp này đơn giản, dễ làm và có thể áp dụng trên diện rộng

+ Phương pháp LATEX (Latex Agglutination Test)

LATEX là phương pháp được dùng để phát hiện kháng thể lưu động cótrong máu của gia súc mắc bệnh tiên mao trùng

Nguyên lý của phương pháp LATEX: khi kháng nguyên bề mặt T evansi

gắn lên các hạt latex kết hợp với kháng thể đặc hiệu kháng tiên mao trùng ở trênbản nhựa, thì sẽ xảy ra phản ứng ngưng kết giữa kháng nguyên với kháng thể.Hiện tượng ngưng kết có thể quan sát được bằng mắt thường, và được giải thích

là do kháng nguyên bề mặt tiên mao trùng được gắn lên các hạt latex là loạikháng nguyên hữu hình, có nhiều điểm quyết định tính kháng nguyên bề mặt(epitop surface) Còn kháng thể đặc hiệu kháng tiên mao trùng lại có nhiều điểmthụ thể (receptor) tương ứng, đặc hiệu với các điểm quyết định của khángnguyên Do đó, khi kháng nguyên tiên mao trùng gặp kháng thể đặc hiệukháng tiên mao trùng, sẽ có hiện tượng một phân tử kháng thể đặc hiệu liênkết với nhiều phân tử kháng nguyên và ngược lại Kết quả là các hạt latex

cùng với kháng nguyên chụm lại, tạo thành đám ngưng kết có thể quan sátbằng mắt thường Kháng nguyên dùng cho phản ứng là kháng nguyên bề mặt

được tinh chế từ chủng T evansi không nhuộm màu.

Phương pháp này có thể ứng dụng trong kiểm tra dịch tễ và có thể ứngdụng ở cơ sở Tuy nhiên tỷ lệ phát hiện bệnh không cao do phương pháp nàycho kết quả dương tính cả khi con vật khỏi bệnh nhưng vẫn còn kháng thể tồntại trong huyết thanh; mặt khác, đối với những súc vật mới nhiễm bệnh TMTtrong huyết thanh chưa có kháng thể nên khi kiểm tra bằng phương phápLATEX sẽ cho kết quả âm tính

* Phương pháp CATT (Card Agglutination Test for Trypanosomiasis)

Đây là phương pháp ngưng kết trực tiếp giữa kháng nguyên và khángthể trên bản nhựa, được dùng để phát hiện kháng thể lưu động trong máuđộng vật nhiễm bệnh

Nguyên lý: kháng nguyên TMT đã được nhuộm màu kết hợp với khángthể tạo thành những đám kết tủa li ti màu xanh

Cách tiến hành: dùng ống hút 2,5 ml dung dịch buffer cho vào lọ khángnguyên chuẩn đã được nhuộm màu (CATT reagent), lắc đều Cho vào lọkháng nguyên đối chứng (đối chứng dương, đối chứng âm) mỗi lọ 0,5 mldung dịch buffer, lắc đều Dùng micropipette pha loãng huyết thanh theo tỷ lệcần chẩn đoán (1/8) Cho các mẫu huyết thanh cần chẩn đoán đã được phaloãng lần lượt vào các vòng tròn của bản CATT, cho kháng nguyên đối chứngvào hai vòng tròn khác của bản, mỗi loại 1 giọt (tương đương 45µl) Sau đócho vào tất cả các vòng tròn trên bản CATT 1 giọt kháng nguyên chuẩn.Dùng que nhựa trộn đều Cuối cùng cho lên máy lắc 5 phút (60 - 70 lần/ phút)

và đánh giá kết quả

* Phương pháp kháng thể huỳnh quang gián tiếp IFAT (Indirect Fluorescent Antibody Test) Phản ứng này là phản ứng huyết thanh học đặc

hiệu có độ nhạy cao, được ứng dụng rộng rãi trong phòng thí nghiệm và thựcđịa Ngoài việc được dùng làm phản ứng chuẩn để so sánh với các phươngpháp huyết thanh khác, phương pháp IFAT còn được dùng trong nghiên cứucác dòng kháng nguyên, phát hiện kháng thể (Luckins, 1988 [23]; Davison,

1999 [24])

Trong phương pháp IFAT, huyết thanh dương chuẩn được lấy từ trâu

bò mắc bệnh tiên mao trùng, huyết thanh âm chuẩn được lấy từ trâu bò khoẻmạnh, huyết thanh cần chẩn đoán là huyết thanh lấy từ gia súc nghi mắc bệnh

Ứng dụng phương pháp này ở Việt Nam, Lương Tố Thu và cs (1994)[20] đã chế tạo conjugate huỳnh quang trên thỏ kháng IgG của bò để chẩnđoán bệnh tiên mao trùng Độ pha loãng của conjugate tự chế sử dụng chophản ứng là 1/8 và huyết thanh chuẩn pha loãng ớ 1/40 Theo Lương Tố Thu

và Lê Ngọc Mỹ (1996) [12], độ nhạy của phương pháp IFAT là 71,25

Để tinh chế kháng nguyên T evansi dùng trong phản ứng miễn dịch

huỳnh quang gián tiếp để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở trâu bò, Vương

Thị Lan Phương (2004) [15] đã nghiên cứu kháng nguyên bề mặt T evansi

phân lập từ trâu, bò ở 6 tỉnh phía Bắc Việt Nam và cho biết: đã thu được 6mẫu tiên mao trùng từ 6 tỉnh, tiến hành phân dòng, phân VAT (VariableAntigenic Type) và thu được 26 VAT thuộc 6 kho kháng nguyên khácnhau Bằng phản ứng dung giải miễn dịch và phương pháp thấm miễn dịch,

tác giả đã xác định được sự thay đổi kháng nguyên bề mặt của T evansi: đa

số các VAT của các kho kháng nguyên khác nhau là khác nhau, chỉ có 8VAT/26 VAI có hiệu giá kháng thể đơn giá đặc hiệu, có phản ứng chéo vớicác VAT của các kho kháng nguyên khác Các VAT trội xuất hiện sớmtrong 4 tuần lễ đầu nhiễm bệnh, có tính kháng nguyên mạnh có thể nghiêncứu ứng dụng chế kháng nguyên chẩn đoán Từ đó, tác giả đã tinh chếkháng nguyên theo phương pháp tách tiên mao trùng để dùng trong phản

ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp, chẩn đoán bệnh tiên mao trùng cho

độ nhạy và độ đặc hiệu cao

+ Phương pháp ELISA (Enzym Linked Immunosorbent Assay)

Phương pháp ELISA là một trong những phương pháp hiện đại nhấtđược ứng dụng để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng

Nguyên lý: dùng kháng thể hoặc kháng thể kháng Globulin (khángkháng thể) có mang một enzym (phosphatase hoặc Peroxydase) được gắn trênmảnh Fc, cho kết hợp trực tiếp hoặc gián tiếp với kháng nguyên Sau đó, cho

cơ chất sinh màu vào, cơ chất sẽ kết hợp với enzym và bị enzym phân huỷ tạonên màu So sánh với màu của quang phổ kế sẽ định lượng được mức độ củaphản ứng

Phương pháp ELISA hiện đang được sử dụng rộng rãi ở các nước trên thếgiới Ở Việt Nam, Lê Ngọc Mỹ và cs (1994) [12] đã bước đầu chế kháng nguyêntiên mao trùng và ứng dụng để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở nước ta

* Các phương pháp phát hiện kháng nguyên tiên mao trùng

- Phương pháp ELISA kháng nguyên (Ag - ELISA)

Đây là phương pháp sử dụng phản ứng ELISA kháng nguyên để pháthiện kháng nguyên lưu động trong máu của gia súc nhiễm bệnh Phản ứngdựa trên kháng thể đơn dòng đặc hiệu với tiên mao trùng Lê Ngọc Mỹ và cs(1994) [12] đã bước đầu ứng dụng phương pháp này để chẩn đoán bệnh tiênmao trùng ở Việt Nam Tuy nhiên, theo cơ quan năng lượng nguyên tử thếgiới (IAEA) (1997), phương pháp ELISA kháng nguyên có độ nhạy kém hơn

so với các phương pháp phát hiện tiên mao trùng cổ điển Vì vậy, phươngpháp này đã không được phổ biến trong thời gian hiện tại và tương lai (IAEA

đã không sản xuất đĩa Ag - ELISA cho nhiều nước trên thế giới)

- Phản ứng Suratex:

Phản ứng Suratex là phản ứng ngưng kết giữa các hạt latex được gắnkháng thể đơn dòng với kháng nguyên lưu động trong máu động vật nhiễm

tiên mao trùng (Nantulya, 1994) Phản ứng này hiện đang được thử nghiệm vàđánh giá ở thực địa.

1.1.5 Phương pháp phát hiện ADN của tiên mao trùng bằng phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction)

PCR là phương pháp hiện đại nhất, mới được đưa vào ứng dụng đểchẩn đoán bệnh tiên mao trùng trong những năm gần đầy

Nguyên lý: dựa vào phản ứng chuỗi Polymerase để xác định sự có mặtgen AND của tiên mao trùng trong máu động vật nhiễm bệnh

Mullis và cs (1986) đã thiết lập qui trình phản ứng để ứng dụng chẩnđoán bệnh tiên mao trùng Sau đó, Desquesnes (1996, 2002), Masake (1997)

đã ứng dụng phản ứng PCR để chẩn đoán bệnh T evansi ở bò; Almeida

(1998) đã ứng dụng chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở dê

Phương pháp PCR có độ nhậy và độ đặc hiệu rất cao Tuy nhiên, phươngpháp này đòi hỏi phải có trình độ kỹ thuật cao, trang thiết bị hiện đại nên hiện naymới đang được thử nghiệm tại một số phòng thí nghiệm hiện đại

1.1.6 Phòng trị bệnh tiên mao trùng cho trâu, bò, ngựa

1.1.6.1 Phòng bệnh

Để phòng ngừa bệnh tiên mao trùng có hiệu quả cao, các nhà khoa học

đã đề nghị áp dụng 3 biện pháp sau:

* Diệt tiên mao trùng trên cơ thể ký chủ:

Diệt tiên mao trùng ký sinh ở vật chủ không những ngăn chặn được táchại gây bệnh của chúng mà còn làm cho bệnh mất khả năng lây lan Các biệnpháp cụ thể là:

- Phát hiện gia súc nhiễm tiên mao trùng ở vùng có bệnh và nhữngvùng lân cận, nhốt riêng trong chuồng có lưới để ngăn côn trùng và điều trịtriệt để cho gia súc bệnh

- Ở những vùng không có bệnh thì không nhập gia súc từ vùng có bệnh

về Nếu thật cần thiết thì chỉ nhập những gia súc khoẻ (có kết quả kiểm tra âmtính với tiên mao trùng), song vẫn cần nhốt riêng để theo dõi Nếu không bịbệnh mới cho nhập đàn Phát hiện và diệt những loài thú hoang nghi là nguồntàng trữ mầm bệnh, hoặc không chăn thả gia súc trong những khu vực cónhững loài đó sinh sống

* Diệt côn trùng môi giới truyền bệnh:

Hội nghị lần thứ VI của Uỷ ban khoa học Quốc tế nghiên cứu về tiênmao trùng đã đề ra những biện pháp tiêu diệt côn trùng như sau:

- Diệt côn trùng bằng thay đổi sinh thái:

Thay đổi sinh thái là thay đổi điều kiện sống, làm cho côn trùng khôngsinh sản, không thực hiện được chu kỳ phát triển

Phát quang cây cối ở từng khu vực, không để nước tù đọng, ủ phân đểdiệt trứng và ấu trùng ruồi, mòng, làm chuồng gia súc có lưới ngăn côntrùng là các biện pháp hữu hiệu, tạo ra những điều kiện bất lợi cho đời sốngcủa côn trùng

Tuy nhiên, do côn trùng có khả năng di chuyển khá mạnh nên các biệnpháp trên phải thực hiện đồng thời trên phạm vi rộng mới có hiệu quả

Challier A (1974) cho biết, ở Nigieria, việc phát quang cây cối xungquanh hồ và các con sông trong một khu vực rộng 400 - 800 mét, dài 10.000mét chỉ hạn chế được một phần hoạt động của những côn trùng môi giớitruyền bệnh tiên mao trùng ở đó

- Diệt côn trùng bằng hoá dược:

Có thể dùng các hoá dược tiêu diệt côn trùng môi giới của tiên maotrùng Các hoá dược đã được dùng là: Endosulfan, Brophos, Dieldrine,Tetracloreinphos…

- Diệt côn trùng bằng phương pháp sinh học:

Các nhà khoa học đã phát hiện được 25 loài ong và côn trùng ký sinhgây hại cho các loài ruồi, mòng môi giới truyền bệnh tiên mao trùng

Một số loài vi khuẩn có thể xâm nhập vào cơ thể ruồi hút máu làmchúng mắc bệnh và chết

Laird (1974) đã phân lập được một số loài vi khuẩn như: Bacillus thuringiensis, B.mathisi để tiêu diệt các loài ruồi hút máu Đây là biện pháp

diệt côn trùng có nhiều ưu điểm: không ảnh hưởng đến môi trường Tuynhiên, biện pháp này mới đang ở giai đoạn thử nghiệm

Jordan A N và cs (1974) đã gây đột biến ruồi hút máu bằng một sốhoá chất và tia sáng có bước sóng ngắn, bằng phương pháp di truyền quầnthể, đã tạo ra những ruồi đực vô tính rồi thả với ruồi cái trong tự nhiên Kếtquả là làm cho ruồi không sinh sản được Phương pháp này có nhiều khả năngthành công nhưng rất tốn kém

Nhìn chung, các biện pháp tiêu diệt côn trùng môi giới có hiệu quả nhấtđịnh nhưng cũng còn nhiều hạn chế

* Phòng bệnh cho gia súc bằng hoá dược:

Hội nghị chuyên đề quốc tế về phòng bệnh tiên mao trùng (1978) đãkết luận: Hiện nay, biện pháp sử dụng hoá dược để tiêm phòng rộng rãi chogia súc ở những vùng bệnh tiên mao trùng lưu hành cần phải được tiếp tụctrong nhiều năm (Touratier L và cs, 1979)

Từ năm 1934, tổ chức dịch tễ gia súc đã đề nghị sử dụng Novarsenobenzol

để tiêm phòng cho toàn đàn ngựa ở những vùng có bệnh tiên mao trùng Hiện

nay, thuốc Trypamidium, liều 0,5 mg/kTT được khuyên dùng để phòng bệnh tiên mao trùng cho trâu , bò

Liu, J H và cs (1992) đã nghiên cứu chế tạo vắc xin phòng bệnh tiên

mao trùng cho ngựa Kết quả tiêm thử nghiệm vắcxin liều 3 x 105 T.

evansilngựa, sau 30 - 60 - 90 ngày dùng vắcxin, tỷ lệ bảo hộ đạt 100%; trong

khi lô đối chứng chết trong thời gian 3 tháng

1.1.6.2 Điều trị bệnh

Một số loại hoá dược đã được dùng để điều trị bệnh tiên mao trùng chotrâu, bò, ngựa ở nước ta từ những năm 60 đến nay gồm:

- Naganin, liều 10 mg/kgTT Pha thuốc với dung dịch nước muối sinh

lý hoặc nước cất thành dung dịch 10%, tiêm tĩnh mạch

Phan Địch Lân và cs (1962), Phạm Sỹ Lăng và cs (1965) đã thử nghiệm

Naganin và cho biết, thuốc có tác dụng tốt trong điều trị bệnh do T evansi

trên trâu, bò ở nước ta

- Berenyl, liều 3 mg/kgTT Pha thuốc với nước cất theo tỷ lệ cứ 0,8gam thuốc trong 5 ml nước cất Tiêm sâu bắp thịt (không dùng quá 9 gam chomột gia súc)

Hồ Thị Thuận (1980) đã dùng Berenyl trị bệnh tiên mao trùng cho trâu

bò, thấy kết quả điều trị tết

Phan Văn Chinh (2006) [3] dùng Berenyl điều trị bệnh tiên mao trùngcho trâu, bò ở các tỉnh miền Trung và cho biết, thuốc đạt hiệu lực 100% vớinhững trâu, bò bị bệnh

- Trypamidium samorin, liều 1 mg/kgTT Tiêm sâu bắp thịt

Nguyễn Quốc Doanh và cs (1996) [4] đã dùng Trypamidium samorinđiều trị bệnh tiên mao trùng cho trâu, bò và xác định, thuốc có hiệu lực và độ

an toàn rất cao (100%)

Theo Phan Văn Chinh (2006) [3], sử dụng thuốc Trypamidium (liều 1mg/kgTT) cho tỷ lệ diệt hết tiên mao trùng là 100%

- Trypazen liều 3,5 mg/kgTT

Điều trị bệnh tiên mao trùng cho trâu, bò bằng Trypazen với liều trên,Nguyễn Quốc Doanh và cs (1997) cho biết, thuốc rất an toàn, tỷ lệ khỏi bệnh là 100%

1.1.7 Gen RoTAT 1.2 của tiên mao trùng

Theo Urakawa và cs, (2001) [31] dựa trên trình tự mã hóa gen của T evanci thì kháng nguyên bề mặt RoTAT 1.2 không tương đồng với các kháng nguyên bề mặt khác trong 39 mẫu Trypanosoma khác nhau và có kích thước

khoảng 215 bp

Kháng nguyên RoTAT 1.2 không xuất hiện ở các chủng T brucei, T Ganbense, T.shodeciense, T Viva.

Theo Ventura và cs 2004 [32] khi làm phản ứng PCR trên 9 mẫu

T.evanci, 1 mẫu T.equiperdem, 2 mẫu T.b.gambiense và một mẫu T.rhodesiense cho thấy các epitope RoTAT 1.2 có mặt ở tất cả các mẫu

T.evanci nhưng không có mặt ở các chủng khác

Như vậy kháng nguyên bề mặt RoTAT 1.2 chỉ được tìm thấy ở T evansi

1.2 Vector tách dòng

1.2.1 Khái niệm

Vector tách dòng còn gọi là phương tiện vận chuyển gen Vector táchdòng thường là các phân tử DNA có kích thước nhỏ, cho phép cài (gắn) cácgen cần thiết, có khả năng tái bản không phụ thuộc vào sự phân chia của tếbào Vector tách dòng phải có khả năng tồn tại trong tế bào vật chủ qua nhiều thế

hệ, ít gây biến đổi bộ gen của tế bào vật chủ Các vector tách dòng phải mangcác gen ”tín hiệu” để dễ dàng nhận biết các tế bào mang vector tái tổ hợp

Mục đích của việc tách dòng là để thu nhận được gen hay một trình tựDNA tinh sạch với hàm lượng lớn

Vector tách dòng có 3 đặc tính cơ bản:

 Có khả năng xâm nhập vào tế bào

 Có điểm mở đầu để tái bản, tức là có khả năng tái bản tích cực,không phụ thuộc vào sự sao chép của bộ gen tế bào chủ

 Các thể biến nạp phải dễ dàng được chọn lọc và sinh trưởng tốt trênmôi trường đặc Khả năng chọn lọc được mã hóa bởi các gen chọn lọc,thường là đặc tính kháng với chất kháng sinh

Ngoài ra, vector tách dòng sẽ được xem là càng mạnh khi có thêm các

ưu điểm sau đây:

 Có kích thước nhỏ để có thể thu nhận được tối đa lượng DNA, dễxâm nhập vào tế bào vi khuẩn và sao chép nhanh

 Tồn tại được qua nhiều thế hệ trong tế bào vi khuẩn và ít gây xáotrộn đối với quá trình trao đổi chất của tế bào chủ

 Mang các vị trí nhận biết duy nhất của nhiều loại enzyme giới hạn và

vị trí đó nằm trong các gen chọn lọc

 Trong số các loại vector hiện có thì plasmid được sử dụng phổ biếnnhất do dễ dàng nhân lên trong tế bào vi khuẩn và có kích thước nhỏ (1kb -200kb) Các thế hệ plasmid ngày càng được cải tiến và mang các đặc tínhmới, tạo điều kiện thuận lợi cho việc tách dòng

1.2.2 Các loại vector tách dòng

Vector tách dòng gồm nhiều loại như: plasmid, phage, cosmid,phagemid, virus, nhiễm sắc thể nhân tạo của tế bào nấm men Mỗi loạivector tách dòng có những ưu, nhược điểm nhất định Tùy thuộc kích thướccủa gen cần tách dòng và đặc điểm của loại tế bào chủ để chọn loại vectortách dòng thích hợp

Vector tách dòng là plasmid: plasmid là những phân tử ADN có kíchthước nhỏ (2kb - 5kb) dạng vòng, nằm trong nguyên sinh chất của tế bào vi

khuẩn, nấm men Một số loại vector tách dòng thường được sử dụng như:pBR322, pSC101, ColE1

Vector tách dòng là phage: các phage sử dụng làm vector tách dònghiện nay phần lớn đều bắt nguồn từ phage cos DNA Phage cos DNA làphage mạch kép kích thước 48.502 bp Sử dụng phage làm vector tách

dòng hiệu quả với tế bào chủ prokaryote và eukaryote (các plasmid sử dụng với tế bào eukaryote thường không có kết quả) Ví dụ: Các loại phage

M13, phage EMBL4, phage GEM

Vector tách dòng là cosmid: cosmid là vector nhân tạo, ghép nối từmột plasmid với đoạn trình tự cos của phage Trình tự cos điều khiển sự đónggói DNA của phage vào phần đầu của phage Vector tách dòng là cosmid chophép cài gắn đoạn DNA có kích thước 40 - 50 kb

Vector tách dòng là phagemid: phagemid là các cloning vector đượccấu tạo trên cơ sở của vector tách dòng Plasmid pBR322 được gắn thêm đoạnkhởi đầu tái bản (Ori) của phage fl, một đoạn có chứa promoter của phage T3,

T7 và polycloning site Điển hình cho phagemid là nhóm plasmid bluescript,

là loại plasmid mạnh được sử dụng nhiều trong công nghệ ADN tái tổ hợp

1.2.3 Plasmid pCR 2.1

Plasmid pCR 2.1 là vector tách dòng đang được sử dụng phổ biến,

có hiệu quả cao, với ưu điểm nổi bật là có thể gắn trực tiếp sản phẩm pCR

vào vector đã được cắt mở vòng do có sẵn hai đầu dính, mỗi đầu có mộtbazơ Timin

Vector pCR 2.1 có kích thước 3,9 kb, mang điểm khởi đầu tái bản của

plasmid pUC nên có khả năng nhân lên với số lượng rất lớn trong tế bào vi

khuẩn E.coli Vector được thiết kế có gắn một operon chuyển hóa đường lactoza là operon- lac Sau vị trí promoter là đoạn LacZα mã hóa cho 146 axitamin đầu tiên của enzyme β- galactosidase, là vùng cắt gắn đa vị được

thiết kế trên đoạn này với 17 vị trí cắt cho các enzyme giới hạn: EcoR I, hind III, Nsi I, Kpn I, Sac I, BamH I, Spe I, BstX I, EcoR V, Not I, Ava I, PaeR7 I, Xho I, Xba I, Apa I Trong đó, EcoR I và BstX I có 2 vị trí cắt, các enzyme

còn lại chỉ có 1 vị trí cắt Với vị trí của vùng cắt đa điểm như vậy, sản phẩm

β- galactosidase có thể được tạo ra (nếu vector không được dính đoạn DNA

ngoại lai, khuẩn lạc màu xanh) hoặc không được tạo ra (nếu vector được dínhđoạn DNA ngoại lai và khuẩn lạc có màu trắng trên môi trường thạch) Dựavào dấu chuẩn đó, người ta có thể lựa chọn được những tế bào mang vectortái tổ hợp với tần suất cao

Một ưu điểm nữa của pCR 2.1 là nó mang promoter của thực khuẩn thể

T và các vị trí gắn mồi xuôi và ngược của thực khuẩn thể M13, nhờ đó có thểphiên mã được đoạn RNA antisense và đọc trình tự đoạn DNA

Ngoài ra, vector pCR 2.1 có chứa gen kháng sinh là Amp và Ka, nhờ đó

mà có thể sinh trưởng bình thường trên môi trường có chứa Amp hoặc Ka vớinồng độ ức chế tối thiểu

1.3 Vector biểu hiện

1.3.1 Khái niệm

Vector biểu hiện gen là những vector tách dòng mang các promotermạnh, cho phép biểu hiện đồng thời cả gen chỉ thị và gen tách dòng tạo lêncác protein lai

Một vector biểu hiện gen gồm các thành phần chủ yếu: promoter mạnh,trình tự sao chép, vị trí khởi đầu phiên mã, vị trí bám của riboxom, tín hiệukết thúc dịch mã, các trình tự cắt nối và các gen chỉ thị

1.3.2 Các hệ thống biểu hiện gen

Biểu hiện gen tái tổ hợp là kỹ thuật quan trọng quyết định tính thànhbại của kỹ tuật gen Hệ thống tế bào chủ thường được dùng để biểu hiện genbao gồm: Tế bào vi khuẩn, tế bào nấm men, tế bào trứng của động vật có vú

và Baculovirut.

1.3.2.1 Biểu hiện gen trong tế bào vi khuẩn

Vi khuẩn E.coli là tế bào chủ được ưa chuộng nhất trong biểu hiện gen,

do mang nhiều ưu điểm hơn so với các tế bào khác:

Vi khuẩn E.coli có tốc độ sinh trưởng nhanh, khả năng biểu hiện

protein tái tổ hợp mạnh, chỉ sau khoảng 8 giờ nuôi cấy ở điều kiện thích hợp

đã có sản phẩm protein tái tổ hợp, khả năng tạo ra sản phẩm gen cao từ 50mg/lít đến 500mg/lít

Biểu hiện gen trong tế bào E.coli có thể giảm được các chi phí cho

công nghệ và hóa chất nên giá thành sản phẩm hạ

Cấu trúc bộ gen E.coli và các đặc điểm di truyền đã được biết tương đối đầy đủ, tạo nên điều kiện thuận lợi khi biểu hiện protein tái tổ hợp ở E.coli.

Có rất nhiều chủng vi khuẩn E.coli được sử dụng trong biểu hiện gen trong đó chủng E.coli BL21 là một trong những chủng E.coli được ưa chuộng

và sử dụng rộng rãi để biểu hiện các loại gen khác nhau

Tuy nhiên nó cũng có những hạn chế sau:

Các gen mã hóa các loại protein có kích thước lớn hơn 50kD, proteingiàu cystein (ví dụ như gen mã hóa plasminogen) hoặc những sản phẩmprotein có sự hình thành liên kết disunfua (S - S) rất khó biểu hiện gen trên vi

khuẩn E.coli.

Tế bào E.coli có thể cho biểu hiện tốt các loại protein không biến đổi

cấu trúc phân tử sau khi dịch mã và không có quá trình glycosyl hóa

Một số chủng vi khuẩn E.coli có thể gây bệnh hoặc có thể tạo độc tố

khi biểu hiện gen của sinh vật bậc cao

1.3.2.2 Biểu hiện gen trong tế bào Baculovirus

Biểu hiện gen trong tế bào Baculovirus có niều đặc điểm thuận lợi:

Baculovirus cho phép biểu hiện các protein có phản ứng glycosyl hóachính xác và có phản ứng cắt chuỗi peptid tín hiệu

Sử dụng Baculovirus trong biểu hiện gen có hiệu quả cao, giá thành sản

phẩm protein tái tổ hợp giảm

Hạn chế lớn nhất khi biểu hiện gen ở Baculovirus là sự tạo thành

protein tái tổ hợp chậm, thường sau 4 -5 ngày nuôi cấy mới có sản phẩm, thờigian nuôi cấy lâu từ 14 – 15 ngày, mặt khác điều kiện công nghệ và môitrường nuôi cấy phức tạp

1.3.2.3.Biểu hiện gen trong tế bào nấm men

Nấm men là nhóm tế bào chủ được sử dụng rộng rãi trong biểu hiệngen của sinh vật bậc cao

Nấm men có nhiều ưu điểm: cho phép sử dụng cả hai loại vector biểuhiện trong prokaryote và trong eukaryote, biểu hiện protein kích thước lớn

50kD, cấu trúc bộ gen có cấu trúc bộ gen của nấm men đã được nghiên cứuđầy đủ, không gây bệnh.

Nấm men có khả năng tạo sản phẩm nhanh, chỉ sau khoảng 8 giờ nuôicấy đã có sản phẩm protein tái tổ hợp, hiệu xuất biểu hiện gen khá cao (từ50mg đến 5000mg/1lít dịch nuôi cấy)

Các vector biểu hiện trong tế bào nấm men thường có promoter AOX(gen alcohol oxidase) rất mạnh, có khả năng kiểm soát gen cần biểu hiện cao.Biểu hiện gen trong tế bào nấm men có thể thực hiện các phản ứng glycosylhóa chính xác, phản ứng cắt chuỗi tín hiệu hoặc thay đổi cấu trúc protein saudịch mã

1.3.2.4 Biểu hiện gen trong tế bào động vật bậc cao

Tế bào động vật bậc cao cho phép biểu hiện các prootein có kích thướclớn hơn 50kD Các vector biểu hiện thường có các promoter mạnh SV 40CMV cho phép thực hiện các phản ứng glycosyl hóa, hoặc cắt chuỗi tín hiệuchính xác Tế bào trứng chuột đất vàng Trung Quốc được ứng dụng để sảnxuất nhiều loại protein tái tổ hợp sử dụng cho con người do khả năng tạothành các protein có cấu trúc không gian thích hợp

Sử dụng hệ thống biểu hiện gen là tế bào động vật bậc cao có một sốhạn chế là chỉ có thể biến nạp bằng xung điện, thời gian sàng lọc rất lâu, nuôicấy phức tạp, giá thành cao

Chương 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng

- Kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 của tiên mao trùng phân lập tạiViệt Nam

2.2 Vật liệu, trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu

2.2.1 Chủng vi khuẩn và plasmid

- Chủng Escherichia coli DH5α (F – endA1 hsdR17 (rk-/mk-) supE44 thi

λ –recrecA1 gyrA96 ΔlacU169 (φ80 lacZ ΔM15) (Promega) dùng để dòng hóa

- Vector pET-32a (+)

2.2.2 Các bộ sinh phẩm, thang chuẩn

- Kít tinh sạch sản phẩm PCR

- Kít tinh sạch RNA (Qiagen, Mỹ)

- Kít RT – PCR one step (Qiagen, Mỹ)

- Kít tách chiết plasmid

- Thang ADN và protein của Invitrogen, Mỹ (hình 2.1)

Hình 2.1 Kích thước các thang chuẩn

(1 Thang DNA chuẩn, 2: Thang protein chuẩn)

2.2.3 Hóa chất, máy móc và thiết bị

Các hóa chất chính sử dụng được liệt kê ở bảng sau:

Bảng 2.1 Các hóa chất chính

Nacl, NaOH, MgSo4, MgCl2, glycerol, CaCl2 Fementas (Mỹ)

Bảng 2.2 Các máy và thiết bị chính

Máy PCR(Gen Amp PCR system 9700) Applied BioSiences (Mỹ)

Máy ly tâm lạnh (Biofuge Primo R) Heraeus (Mỹ)

Máy đo pH (Digital pH Meter Delta 320) Thommas Scientific(Mỹ)

Tủ lạnh – 20oC, - 80oC Nuaire (Mỹ)

Tủ an toàn sinh học cấp II Nuaire Nuaire (Mỹ)

Máy quang phổ tử ngoại khả biến Nano Drop Analitika (Đức)

Máy phân tích trình tự DNA ABI 3100 –Avant Applied Bíociences (Mỹ)

Máy hút chân không Speed – Vac 110A Savant (Mỹ)

2.2.4 Môi trường và đệm

Môi trường nuôi vi khuẩn và các loại đệm sử dụng trong nghiên cứuđược chuẩn bị theo Sambrook và cs (2001)[] hoặc theo sự hướng dẫn của nhàsản xuất

2.2.5 Cặp mồi sử dụng

Để khuếch đại trình tự gen RoTAT 1.2 có kích thước 215 bp của

Trypanosoma evansi, Bashirsalim và cs (2010)[ ] đã dùng 1 cặp mồi gồm:

Mồi xuôi (5’- GCG GGG TGT TTA AAG CAA TA- 3’)

và mồi ngược (3’- ATT AGT GCT GCG TGT GTT CG -5’)

Kết quả RT-PCR sẽ được điện di để so sánh với các mẫu chuẩn và kết luận

2.3 Nội dung, địa điểm và thời gian nghiên cứu

+ Nội dung nghiên cứu:

- Nghiên cứu xác định các điều kiện nuôi cấy chủng E coli BL 21/pET –

RoTAT 1.2 để sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT1.2

Chủng vi khuẩn tái tổ hợp gen ROTAT 1.2

Tách tinh sạch protein tái tổ hợp

Đánh giá tính kháng nguyên của Protein tái tổ hợp gen RoTAT 1.2

Lên men: (xác định các điều kiện lên men chủng tái tổ hợp: IPGT, pH, t0C)

- Nghiên cứu ứng dụng kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 để thiếtlập phản ứng ELISA chẩn đoán bệnh tiên mao trùng

- Bước đầu đánh giá hiệu quả chẩn đoán bệnh tiên mao trùng của phảnứng ELISA với kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2

+ Địa điểm nghiên cứu:

Khoa Công nghệ sinh học - Viện Đại học Mở Hà Nội

+ Thời gian nghiên cứu

Từ tháng 5 năm 2012 đến tháng 6 năm 2013

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Sơ đồ nghiên cứu