* Chuẩn bị vector và gen mong muốn cho phản ứng nối ghép gen
– Tinh chế đoạn gen và vector: Để nối ghép gen vào một vector, trước hết chúng phải được với cùng một enzyme cắt giới hạn để tạo đầu cắt tương ứng cho phản ứng nối ghép gen. Ngoài ra, để phản ứng đạt hiệu suất cao cần tinh chế đoạn gen hoặc vector trước khi tiến hành lai. Phản ứng cắt lượng lớn để thôi gel và tinh sạch đoạn gen và vector quan tâm như sau:
Thành phần phản ứng cắt: H2O: 48 µl Buffer: 10 µl Vector/plasmid: 40 µl Enzyme cắt giới hạn: 2 µl Tổng thể tích: 100 µl Ủ 37° – 2 giờ
– Khử phosphate đối với vector
DNA plasmid sau khi cắt bằng enzyme hạn chế được loại nhóm phosphat ở đầu 5' nhờ enzyme phosphatase kiềm được tách từ ruột bê (CIP = Calf Intestinal Alkaline Phosphatase). Mục đích nhằm tránh hiện tượng đóng vòng trở lại của vector.
Phương pháp:
DNA plasmid (10 – 20 µg) được ủ với enzyme giới hạn trong 1 giờ. Lấy khoảng 0,3 µg điện di trên gel agarose 0,8% cùng với chỉ thị phân tử là DNA plasmid chưa xử lý bằng enzyme. Nếu như quá trình cắt chưa hoàn toàn, bổ sung thêm enzyme giới hạn và ủ tiếp.
Khi DNA đã được cắt hoàn toàn, chiết mẫu với phenol : chloroform và tủa DNA bằng hai thể tích ethanol trong 15 phút ở 0°C. Ly tâm thu DNA ở 4°C, 12000 vòng/phút (v/p) trong 10 phút. Hoà cặn trong 90 µl 10 mM Tris.Cl (pH 8,3). Lấy khoảng 200 ng DNA điện di kiểm tra. Mẫu còn lại được giữ ở – 20°C.
Thêm 10 µl dung dịch đệm dùng cho CIP và một lượng enzyme thích hợp, ủ ở điều kiện tương ứng.
Chú ý: Lượng enzyme cần dùng và điều kiện ủ phụ thuộc vào đoạn cắt DNA mang đầu dính hay đầu bằng.
Bảng 2. 1: Điều kiện khử photphat của các loại đầu dính
Lượng enzyme Điều kiện ủ Đầu dính 5' 1 unit / 100 pmoles* ở 37°C trong 30 phút Đầu bằng
1 unit / 2 pmoles ở 37°C trong 15 phút. Sau đó thêm một lượng enzyme và tiếp tục ủ ở 55°C trong 45 phút.
* 2 µg DNA mạch thẳng dài 5 kb khoản 1,4 pmoles.
Sau khi ủ, thêm vào mẫu SDS và EDTA (pH 8,0) đến nồng độ cuối cùng tương ứng là 0,5 % và 5 mM. Trộn đều và thêm proteinase K 100 µg/ml. Ủ 30 phút ở 56°C. Proteinase K dùng để hoà tan CIP nhằm loại bỏ chúng hoàn toàn giúp cho quá trình gắn gen vào vector có hiệu quả. CIP cũng có thể bị làm bất hoạt bằng cách ủ 1 giờ ở 65°C hoặc 75°C trong 10 phút cùng với 5 mM EDTA (pH 8,0).
Sau đó làm nguội phản ứng ở nhiệt độ phòng. Chiết DNA một lần bằng phenol, một lần bằng phenol : chloroform. Bổ sung Na – acetate 3M, pH 7,0 (nếu pH = 5,2 như thông thường thì EDTA trong dung dịch sẽ bị kết tủa khi nồng độ > 5 – 10 mM) theo tỷ lệ thể tích 1: 10. Trộn đều và thêm 2 lần thể tích ethanol 100%. Đảo đầu ống Eppendorf vài lần. Giữ ở 0°C trong 15 phút.
Ly tâm 12000 v/p, 10 phút, 4°C để thu DNA. Rửa cặn bằng ethanol 70%, ở 4°C. Làm khô DNA và hoà trong TE (pH 7,6) và bảo quản ở – 20°C.
Phản ứng khử phosphate được tiến hành như sau:
H2O: 29 µl Buffer CIAP: 5 µl CIAP: 1 µl Vector: 15 µl Tổng thể tích: 50 µl Ủ 37°– 1giờ và dừng phản ứng ở 65° – 15 phút
* Tinh chế các đoạn DNA và vector tách dòng trên gel agarose
Để chuẩn bị nguyên liệu cho các phản ứng ghép nối gen với vector, ngoài các vector có sẵn trong các bộ Kit tách dòng như pJET1.2, pBluescript II KS(-), trong nội dung nghiên cứu này vector biểu hiện, vector tách dòng trung gian, sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel 0,8 % agarose, sau đó cắt phần gel có băng DNA mong muốn và thu lại DNA bằng Kit tinh sạch Wizard®SV. Quy trình tinh sạch DNA gồm các bước sau:
Làm tan gel
Sau khi điện di xong, cắt phần gel chứa băng DNA tương ứng gel và chuyển vào ống Eppendorf, xác định lượng gel đã cắt được.
Bổ sung dung dịch gắn màng với tỉ lệ 10 µl dung dịch/10 mg gel.
Vortex và ủ ở 50 - 65˚C cho đến khi gel tan hoàn toàn.
Gắn DNA
Đưa cột SV vào ống Collection (cột tinh sạch).
Ly tâm 12000 v/p trong 1 phút, bỏ phần dịch ở cột Collection.
Rửa màng
Bổ sung 700 µl dung dịch rửa màng (đã bổ sung cồn). Ly tâm 12000 v/p trong 1 phút, loại bỏ phần dịch phía ở ống phía dưới cột Collection.
Rửa lại 1 lần bằng cách bổ sung tiếp 500 µl dung dịch rửa, ly tâm 12000 v/p trong 5 phút. Loại bỏ phần dịch ở ống phía dưới cột Collection.
Ly tâm tiếp cột 12000 v/p trong 1 phút, để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút để bay hơi hết lượng cồn còn lại.
Thu DNA
Nhẹ nhàng chuyển cột SV sang 1 ống Eppendorf 1,5 ml sạch.
Bổ sung 50 µl nước không có nuclease, ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút, ly tâm 12000 v/p trong 1 phút.
Loại bỏ cột SV và giữ DNA ở 4˚C hoặc -20˚C.
Kiểm tra nồng độ DNA bằng cách điện di trên gel 0,8 % agarose.
* Phản ứng ghép nối
Phản ứng nối ghép ở đây được thực hiện theo Kit tách dòng CloneJETTM PCR Cloning Kit của hãng Fermentas. Đây là phương pháp được thiết kế đặc biệt để tách dòng gen mong muốn (hoặc sản phẩm PCR nói chung) được nhân lên bằng enzyme
Taq DNA polymerase hoặc đã được cắt bằng enzyme giới hạn có vị trí nhận biết
điểm cắt tương ứng.
Quy trình nối ghép gen:
Vetor và đoạn DNA ngoại lai sau khi được xử lý bằng enzyme giới hạn, tinh chế và được tiến hành nối ghép theo phản ứng như sau:
H2O: 5µl
Vector: 2µl T4 DNA ligase: 2µl Sản phẩm cắt enzyme: 9µl
Tổng thể tích: 20µl
Hỗn hợp phản ứng được trộn nhẹ nhàng và ủ ở 0° – 18°C trong 16 giờ.
- Phương pháp ghép nối các đoạn DNA vào vector: các đoạn gen và vector sau
khi được xử lý bằng enzyme giới hạn phù hợp sẽ được ghép nối với nhau nhờ enzyme T4 ligase, phản ứng thực hiện ở 14˚C trong 12 giờ. Đặc biệt trong nội dung nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng tính chất đặc biệt của 2 loại enzym giới hạn Bam HI (GGATCC) và Bgl II (AGATCT) có 4 điểm nhận biết ở giữa giống nhau, tạo ra đầu dính giống nhau là GATC. Nhờ vào đặc điểm này mà người ta có thể tiến hành ghép nối đoạn DNA được cắt bằng Bam HI với đoạn DNA được cắt bằng Bgl II, khi đó trong phân tử DNA lai điểm cắt của hai enzyme này bị thay đổi.