Các đĩa nuôi nhiễm theo tỷ lệ 1 : 5 trên môi trường có bổ sung AS sẽ được dùng cho nghiên cứu chọn lọc thể nấm chuyển gen trên môi trường chọn lọc có bổ sung kháng sinh hyhromycin và cefotaxim.
Màng lọc từ các đĩa nuôi nhiễm được tiếp tục sang môi trường chọn lọc PDA có bổ sung hygromycin (50mg/ml) và cefotaxim (50 mg/ml). PDA là môi trường đặc hiệu cho sự phát triển của nấm và hygromycin B là kháng sinh ức chế sự phát triển của nấm [18]. Màng lọc được chuyển sang môi trường chọn lọc và đĩa được ủ ở 37°C trong 3 ngày. Chúng tôi mới chỉ chọn được một khuẩn lạc duy nhất xuất hiện trên đĩa. Để sống sót trên môi trường có hygromycin, khuẩn lạc này chắc chắn phải mang gen kháng hygromycin, hơn nữa phải kháng lại cả cefotaxim vì cefotaxim là chất kháng sinh ức chế sự phát triển của Agrobacterium [11]. Do đó có thể khẳng định, khuẩn lạc trên không phải là Agrobacterium mà là dòng khuẩn lạc của nấm mang gen kháng hygromycin B. Kết quả nuôi nhiễm trong nghiên cứu tương đối thấp so với hiệu suất chyển gen của các nghiên cứu khác trên thế giới. Hiệu suất chuyển gen vào
P. digitatum nhờ vi khuẩn Agrobacterium rất cao, từ 97% – 100% [17]. Kết quả nuôi
nhiễm không cao có thể do giai đoạn chuẩn bị vật liệu chủng giống không tốt, hoặc do chủng giống Agrobacterium không phù hợp với A. niger. Theo Beijersbergen và
các tác giả khác (2001), chuyển gen vào nấm mốc A. niger, chủng Agrobacterium được sử dụng để nuôi nhiễm là LBA1100 [9]. Chuyển gen vào nấm mốc A. awamori, chủng Agrobacterium được sử dụng là các chủng có kí hiệu LBA100a, LBA1119 hay EHA105, LBA1126 [12]. Nhiều nghiên cứu chứng minh, chuyển gen vào nấm thông qua Agrobacterium A281 có hiệu suất cao hơn so với các chủng khác, chẳng hạn như chuyển gen vào Criphonectria paratosis thông qua Agrobacterium A281 có hiệu suất cao hơn Agrobacterium LBA4404 [12].
Sự phát triển mạnh của nấm cũng có thể ảnh hưởng đến hiệu suất chuyển gen do sự cạnh tranh dinh dưỡng. Hơn nữa, chủng nấm để nuôi nhiễm khi được chuẩn bị mới sẽ cho hiệu suất cao hơn so với vật liệu bảo quản trong thời gian dài [1]. Bào tử nấm dùng trong nuôi nhiễm đã được bảo quản ở 4°C trong 1 tuần, do đó có thể đây cũng là nguyên nhân ảnh hưởng đến kết quả nuôi nhiễm. Ngoài ra, giai đoạn xử lý
Agrobacterium để thu cặn tế bào cũng có thể ảnh hưởng đến Ti plasmid, dẫn đến hiệu
suất nuôi nhiễm thấp.
Nấm chuyển gen sau khi chọn lọc trên môi trường có bổ sung kháng sinh hygromycin B sẽ tiếp tục được nuôi lượng lớn trong môi trường DPA lỏng để thu cặn tế bào. DNA tổng số tách từ khuẩn lạc này được dùng làm khuôn cho phản ứng PCR. Trên hình ảnh điện di, sản phẩm PCR cuả gen kháng hygromycin B thu được rất đặc hiệu, tương ứng với kích thước 0,6 kb. Điều này cho thấy, chúng tôi đã chuyển thành công thành công vector biểu hiện vào nấm mốc A. niger thông qua vi khuẩn A.
tumefaciens.
Hiện nay, chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium không chỉ giới hạn ở một số loài nấm thuộc chi Aspergillus [3] mà nó còn được áp dụng trên nhiều loài nấm khác nhau như P. digitatum, M. circinelloides, C. albicals [1, 2, 38]. Trong nghiên cứu, A.
niger được sử dụng làm tế bào chủ để chuyển gen bởi nó là loài an toàn, cho năng
KẾT LUẬN
1. Đã thiết kế thành công vector biểu hiện (Ti plasmid tái tổ hợp) được kí hiệu là pCB_xylB_hph mang gen mã hóa xylanase và gen kháng hygromycin B trên cơ sở vector trung gian pKS_xylB_hph.
2. Đã tạo được chủng vi khuẩn Agrobacterium mang vector biểu hiện gen mã hóa xylanase pCB_xylB_hph để làm nguyên liệu chuyển gen vào nấm.
3. Bước đầu xây dựng quy trình nuôi nhiễm A. tumefaciens mang Ti plasmid tái tổ hợp pCB_xylB_hph và bào tử nấm A. niger.
4. Bước đầu chọn lọc được nấm mốc A. niger chuyển gen trên môi trường chọn lọc bằng kháng sinh hygromycin B.
KIẾN NGHỊ
1. Tiếp tục hoàn thiện quy trình chuyển gen mã hóa xylanase vào nấm mốc A. niger thông qua A. tumefaciens.
2. Kiểm tra nấm chuyển gen bằng kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho hph và xylB.
3. Xác định hoạt tính của enzyme xylanase trong môi trường có bổ sung cơ chất thích hợp.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Lê Trần Bình, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải, Trương Nam Hải, Lê Quang Huấn (2003), Áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu tài nguyên sinh vật
Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội.
2. Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học thực vật
trong cải tiến giống cây trồng, Nhà xuất bản Nông nghiệp, tr. 72 – 74.
3. Lê Thị Thu Hiền (2003), “Tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang gen kháng côn trùng để chuyển vào cây trồng”, Luận văn Tiến sĩ sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Hà Nội.
4. Nguyễn Sỹ Lê Thanh, Quyền Đình Thi (2009), “Nhân dòng và phân tích trình tự gen mã hóa xylanase từ A. niger DSM1957”, Báo cáo Hội nghị Công nghệ Sinh
học toàn quốc, Nhà xuất bản Đại học Thái Nguyên, tr. 701 – 704.
5. Nguyễn Thị Thu Thủy, Nguyễn Văn Thuật, Đỗ Thị Tuyên, Quyền Đình Thi (2009), “Biểu hiện và đánh giá tính chất hóa lý của xylanase tái tổ hợp từ chủng
A. oryzae VTCC – F187 trong Pichia pastoris GS115”, Báo cáo Hội nghị Sinh học toàn quốc, Nhà xuất bản Đại học Thái Nguyên, tr. 710 – 714.
Tiếng Anh
6. Alasdair D. I., Bruun R. T. (2000), Promoter, Patent WO 0078975.
7. Angeles J. G. C., Laurena A. C., Tecson M. E. M. (2005) “Extraction of genomic DNA from the lipid – polysaccharide, and polyphenol – rich coconut (Cocos
nucifera L.)”, Plant Molecular Biology Reporter, 23, pp. 297a – 297.
8. Krisana A., Rutchadaporn S., Jarupan G., Lily E., Sutip T., Kanyawim K. (2004), “Endo–1,4–ß–xylanase B from Aspergillus cf.niger BCC14405 isolated in Thailand: purification, characterization and gene isolation”, Journal of
Biochemistry and Molecular Biology, 38 (1), pp. 17 – 23.
10. Ruiz – Diez B. (2002), “Strategies for the transformation of filamentous fungi: A reviews”, Journal of Applied Microbiology, 92, pp. 189 – 195.
11. Michielse B. C, Hooykaas P. J. J., van den Hondel C. A. M. J. J. , Ram F. J. A. (2008), “Agrobacterium – mediated transformation of the filamentous fungus
Aspergillus awamori”, Protocol.
12. Michielse B. C., Hooykaas P. J. J., van den Hondel C. A. M. J. J., Ram F. J. A. (2005), “Agrobacterium – mediated transformation as a tool for functional genomics in fungi”, Review article.
13. Chantasingh D., Pootanakit K., Champreda V., Kanokratana P., Eurwilaichitr L. (2005), “Cloning, expression, and characterization of a xylanase 10 from
Aspergillus terreus (BCC129) in Pichia pastoris”, Protein Expression and Purification, 46, pp. 143 – 149.
14. Holster M., De Waele D., Depicker A., Messens E., Van Montagu M., Schell J. (1987), “Transfection and transformation of A. tumefaciens”, Molecular and
General Genetics 163, pp. 181–187.
15. Nyilasi I. (2004), “Investigation of the application of the Agrobacterium – mediated transformation in Zygomycetes”, Acta Biologica Szegediensis, 48 (1–4): 73.
16. Sugui A. Z, Chang C. Y., Kwon–Chung K.J. (2004), “Agrobacterium tumefaciens – mediated transformation of Aspergillus fumigatus: an efficient tool for insertional mutagenesis and targeted gene disruption”, Applied and
Environmental Microbiology, 71 (4), pp. 1798 – 1802.
17. Wang Z-Y., Li H-Y. (2008), “Agrobacterium tumefaciens – mediated genetic transformation of the phytopathogenetic fungus Penecillium digitatum”,
Journal of Zhejiang University SCIENCE B, 9(10), pp. 823–828.
18. Nyilas I., Acs K., Papp T., Nagy E., Vagvolgyi C. (2005), “Agrobacterium
tumefaciens – mediated transformation of Mucor circinellnoides”, Fonia Microbiology, 50 (5), pp. 415 – 420.
19. Hanif M. (2004), Chracterization of small GTPase Cdc42 from the
ectomycorrhizal fungus Suillus bovinus and Agrobacterium tumefaciens – mediated transformation of fungi, University of Helsinki.
20. Kheng P. P., Omar C. I. (2004), “Xylanase production by a local fungal isolate,
Aspergillus niger USM AI 1 via solid state fermentation using palm kernel
cake (PKC) as substrate”, Songklanakarin Journal Science Technology, 27 (2), pp. 325 – 336.
21. Deng P., Li D., Cao Y., Lu W., Wang C. (2006), “Cloning of a gene encoding an acidophilic endo – ß – 1,4 – xylanase obtained from Aspergillus niger CGMCC1067 and constitutive xpression in Pichia pastoris”, Enzyme and
Microbial Technology, 39, pp. 1096 – 1102.
22. Romaine (2005), United States Patent, US 6, 964, 866 B2.
23. Beg Q. K., Kapoor M., Mahajan L., Hoondal G. S.(2001), “Microbial xylanase and their industrial application: A review”, Applied Microbial Biotechnology, 56, pp. 326– 338.
24. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. (2001), "Molecular Cloning: A laboratary manual". Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor.
25. Stewart C.N.Jr., Via L.E.(1993) A rapid CTAB DNA isolation technique useful for RAPD fingerprinting and other PCR applications, BioTechniques, 14, pp. 748–751.
26. Stanton B Gelvin, (2003), “Agrobacterium mediated plant transformation: the biology behind the “Gene – Jockeying” tool”, Microbiology and Molecular
Biology Reviews, 67(1), pp. 16 – 37.
27. Cosson T., Pe’rez A.M., Vendrell, Gonza’lez Teresa B., Rene D., Taillade P., Brufau J. (1999), “Enzymatic assays for xylanase and ß–glucanase feed enzyme”, Animal Feed Science and Technology, 77, pp. 345 – 353.
28. Krengel U., Dijkstra W. B. (1996), “Three – dimensional structure of endo – 1,4 – ß – xylanase I from Aspergillus niger: Molecular basis for its low pH optimum”, Journal of Molecular Biology, 263, pp. 70 – 78.
29. Degefu Y. (2003), Cloning and characterization of xylanase gene from
phytopathogenetic fungi with a special reference to Helminthosporium turcicum, the cause of the northern leaf blight of maize, University of
Helsinki.
30. Lu L., Yang Z., Yuan H. (2008), “Production, purification and characterization of an alkaliphilic endo–ß–1,4–xylanase from a microbial community EMSD5”,
Enzyme and Microbial Technology, 43, pp. 343 – 348.
31. Olempska–Beer Z. S., Merker R. I., Ditto M.D., Dinovi M. J. (2006), “Food – processing enzymes from recombinant microorganism – a revew”, Regulatory
Toxicology and Pharmacology, 45, pp. 144 – 158.
32. Zuccarello G. C., Critchley A. T., Smith J., Sieber V., Lhonneur G.B., West J.A. (2006) Systematics and genetic variation in commercial Kappaphycus and Eucheuma (Solieriaceae, Rhodophyta), Journal of Applied Phycology.
33. http://en.wikipedia.org/wiki/Aspergillus_niger 34.http://arabidopsis.info/students/paaras/t_dna.htm]